的一式两份测量充当标准曲线。样品的阳性或阴性分类以及每个样品中SDD病毒 基因组材料的原始量的确定是基于相对于标准曲线的阈值循环。该qPCR的检测下限是大 约102个拷贝/μL(图3)。如在表2中所示，qPCR结果与PCR结果完全对应（参见列"结 果PCR"和列"结果Q-PCR"）。
[0179] 类似地，使用qPCR确定血清样品中的SDD病毒基因组拷贝的起始量，所述血清样 品衍生自没有鳞片脱落征状、具有早期和晚期阶段鳞片脱落征状的鱼（实验2)(表3)。除 了鱼8以外，所有得自具有早期和晚期阶段疾病的鱼的血清样品是阳性的，而所有得自具 有健康外观的鱼的样品是阴性的。
[0180] 另外，通过qPCR分析了得自实验3的血清样品。在20个从遭受鳞片脱落疾病的 鱼衍生出的血清样品中的17个中，检测到病毒基因组序列。从健康鱼收集的血清样品都不 是SDD病毒阳性的。
[0181] 总之，分析了 40个从具有鳞片脱落疾病的轻度至重度征状的鱼收集的血清和组 织样品。在这些样品中的35个中检测到SDD病毒基因组序列。形成鲜明对比的是，在14 个得自健康动物的样品中没有检测到病毒。
[0182] 在MSDAH建立的Bluegillfry(BF-2)细胞系的细胞培养 细胞系BF-2最初衍生自胰蛋白酶处理的1岁小鱼的躯干的合并尾部区域的混悬液(Bluegillfry,Lepomis macrochirus,Science1966; 151:1004，JVirol1968; 2:393，JInfectDis1968; 11:253，InVitroCellDev.Biol1992; 28A:385。该细胞 系通过ATCC和ECACC商购得到，但是将用于下述实验的系在MSD AH培养+70代。
[0183]BF-2细胞培养基由899ml补充了 2mML-谷氨酰胺和110mg/L丙酮酸钠、100 mlFCS(10%)和1mL新霉素多粘菌素抗生素溶液1000倍原液的E-MEM组成。在保湿培养 箱中在28°C和5%C02下常规地培养细胞。
[0184] 在培养开始之前，将培养基保持在4°C。使用1安瓿的冷冻原液BF-2开始培养。 将来自液氮的细胞在20-28°C水中快速融化。将细胞混悬液移入15mL试管中，并用7mL 培养基缓慢地稀释。随后，计数细胞。将混悬液用培养基进一步稀释，直到DMS0被稀释至 少50倍。随后，将混悬液分配至适当的培养瓶或滚瓶，并在28 °C和5%0)2中温育。6-24小 时或细胞完全附着以后，将培养基更新以除去剩余的DMS0 (冷冻培养基由80%培养基和 20%DMS0组成）。将细胞进一步温育3-7天或直到达到汇合。对于滚瓶，需要0. 2-0. 5rpm 的滚子速度。定期在倒置显微镜下检查细胞。
[0185] -旦达到汇合，将细胞传代。可以每3-4天进行传代，最初接种密度为2.0X104 个细胞/cm2。可选地，通过在达到4.0X104个细胞/cm2的较高密度接种细胞，可以得到更 短的传代间隔。将用于细胞传代的试剂（培养基，PBS，胰蛋白酶/EDTA)预温热至28°C。 抛弃培养基，并将汇合的单层用适当体积（对于T25,3mL)的PBS洗涤1次。随后抛弃 PBS，并将细胞在相同体积的补充了l%(V〇l/V〇l)的2. 5%胰蛋白酶溶液和l%(V〇l/V〇l)的 2%EDTA溶液的PBS中在28°C温育15分钟。加入相同体积的新鲜培养基，并将细胞再悬浮 和计数。在期望的细胞密度以对于培养瓶或滚瓶而言适当的培养体积装配新烧瓶。
[0186] 为了冷冻细胞，在操作之前将培养基和冷冻培养基（80%(V〇1/V〇1)培养基+ 20%(vol/vol)DMS0)保持在4°C。如上所述处理汇合的细胞培养物，直到且包括胰蛋白酶 消化。将细胞再悬浮，计数，进一步再悬浮于合适量的培养基中，并在搅拌混悬液的同时逐 滴加入相等体积的2倍冷冻培养基。将用于液氮贮存的安瓿用5X106个细胞/安瓿（以 开始T175)或用7. 5X105个细胞/安瓿（以开始T25)填充。
[0187] 给BF-2细胞接种SDD病毒 在建立接种实验之前，将从液氮贮存物培养的细胞传代至少1次。将细胞传代并培养 24小时，然后在T25培养瓶中以5.0X104个细胞/cm2接种。接种物由得自被SDD影响的 动物的血清在培养基中的1:10稀释物组成（将实验2的鱼4-7的合并血清样品用于建立 病毒培养物）。从烧瓶除去培养基。随后在28°C/5%C02给烧瓶接种0. 5ml接种物/T25保 持最小30min。
[0188]同样可能给细胞接种SDD病毒的先前传代物(在培养基中稀释的细胞中)的冻融收 获物。
[0189] 随后，除去接种物（尽管这不是绝对必要条件），加入新鲜培养基，并将细胞培养 多达10天或直到使用倒置光学显微镜观察到完全CPE。通过1-3个冻融循环（_70°C至4°C) 收获病毒，并随后通过在4°C在1000Xg离心5分钟从细胞碎片澄清收获物。可以用qPCR 分析和/或收获物的滴定证实病毒的复制。使用DNA测序技术来证实病毒的身份。
[0190] 使用生产商的说明书，使用Qiagen DNeasy Blood & Tissue试剂盒，从组织培养 基和冻融的细胞收获物分离用于qPCR的DNA。
[0191] 对于培养基收获物:格20〇μ1培养基收获物加入在1.5 mL Eppendorf试管中的 2〇μ1蛋白水解酶K，并混合均匀。向该混合物中，加入2〇μ1RNA酶A(20mg/mL)，混合均 匀，并在室温温育2分钟。此后，遵循生产商的说明书。
[0192]对于细朐裂解物:格5〇μ1细胞裂解物加入在1. 5mL Eppendorf试管中的2〇μ1蛋 白水解酶Κ，并混合均匀。向该混合物中，加入13〇μ1的ATL溶液（Qiagen)，混合均匀，并在 室温温育60分钟。向该混合物中，加入2〇μ1RNA酶A (20mg/mL)，混合均匀，并在室温温 育2分钟。此后，遵循生产商的说明书。
[0193] 没有病毒能够从不具有鳞片脱落疾病征状的鱼衍生出的血清样品培养。
[0194] SDD病毒的灭活 通过加入10倍预稀释的福尔马林（将1份福尔马林加入9份H20中），将病毒收获物 灭活。福尔马林的1000倍最终体积稀释对于SDD病毒灭活而言是有效的，所以将1体积的 10倍预稀释的福尔马林加入99体积的收获物（最终甲醛含量0.037%)中。将容器的内容 物在4°C轻轻搅拌。加入福尔马林和搅拌以后，直接将整个混合物转移至新容器以确保所有 病毒已经与福尔马林接触。将容器的内容物连续地、但是轻轻地搅拌3天，随后在没有搅拌 下温育11天。在14天的整个灭活阶段中，将混合物保持在4°C。
[0195] 灭活病毒的浓缩 应用横向流过滤以得到浓缩的灭活病毒。使用GEHealthcareFilter56-4100-92，UFP-100-E-H22LA，38cm2，100. 000NMWC，浓缩灭活的病毒。将过滤器用超纯水洗涤，并用 2%(V〇l/V〇l)的福尔马林水溶液灭菌。随后，将过滤器用PBS冲洗，并用EMEM培养基冲洗。 将灭活病毒批料加入过滤器并浓缩至原始体积的1/10。
[0196] 在BF-2细胞上滴定SDD病毒 如上所述培养BF-2细胞。在测试前1天，制备BF-2细胞混悬液，其含有在冷的（2-8°C) 培养基中的3X104个细胞/ml。给微孔滴定板的96个孔接种10〇μ1/孔的该细胞混悬液。 将板在湿气氛中在28°C/5%C02温育24小时。该温育时段以后，单层应当是大约30-50%汇 合的。
[0197] 在测试当天，如下制备每个病毒样品的10倍系列稀释物直到10 8:将0. 5ml样品 转移至含有4. 5ml冷的（0-20°C)滴定培养基（不含FBS的培养基）的试管，混合，并将 0.5ml转移至下一个含有4. 5ml滴定培养基的试管中，随后进行小心的混合、转移等。第 1和12列以及第A和Η行充当阴性对照，并接种10〇μ1/孔的新鲜滴定培养基。给微孔滴定 板接种?οομL/孔的病毒稀释液，将10 3、10 4、10 5、10 6、1〇7、10 8接种在第Β至G行（10孔/ 稀释度）。在操作过程中，将病毒稀释液的温度保持在〇°C至20°C之间。将板在28°C/5%C02 温育7天。7天病毒温育时段以后，用倒置光学显微镜针对SDD病毒特异性的CPE筛选板。 SDD病毒特异性的CPE的特征在于单层中的细胞的聚集，继之以细胞脱离。在图4中可以清 楚地看到这种细胞聚集之后脱离的现象。图5显示了未感染的对照细胞的单层。BF-2单层 中的孔被圆形细胞包围。将显示SDD病毒特异性的CPE的每个孔评分为阳性的。根据Reed 和Muench,Am.J.Epidemiol. (1938) 27(3): 493-497 描述的方法和计算，确定TCID5。。 分离自滴定测定中的阳性孔的DNA样品的qPCR分析证实了病毒的存在。
[0198]SDD病毒主要衣壳蛋白和ATP酶的序列和系统发生分析 图6和7分别显示了SDD病毒主要衣壳蛋白（MCP)和ATP酶的全长DNA和蛋白序列。
[0199] 使用SDD病毒MCP和ATP酶DNA序列建立系统树（图8和9)。使用邻接法和应用 标准设置，用MEGA5软件建立树。在比对中仅包括编码连续0RF的DNA序列。进行自举分 析（2000个副本），并在节点处指定自举支持百分比。距离条指示每个位点的核苷酸置换的 数目。
[0200] 将SDD病毒MCPDNA序列与在Kurita和Nakajima(Viruses2012，4:521_538) 所述的系统发生分析中包括的虹彩病毒MCPDNA序列比对。如在图8中所示，可以将SDD 病毒视作虹彩病毒科内的单个属的单个成员。SDD病毒MCP序列与Megalocytivirus属的 成员的MCP序列最密切相关。但是，与最密切相关的MCP序列（真鲷虹彩病毒MCP0RF)相 比，配对距离（已经被置换的位点的比例）仍然是49%(blast对比揭示与RSIVMCP的65% 同源性，与49% "配对距离"的差异主要是由于修复置换诸如从例如核苷酸A至G的突变以 及回复至A的第二个突变）。
[0201] 图9描绘了编码SDD病毒ATP酶的DNA序列的系统发生分析。证实了与在该分析 中包括的其它虹彩病毒ATP酶序列相比，SDD病毒ATP酶序列是一个遥远的离群值。
[0202] 表1:用于SDD病毒和RSIVPCR的引物序列
[0203] 表2:SDD病毒qPCR和PCR结果（实验1).
N/A:不可检测P0S:阳性的 NEG:阴性的 〇
[0204] 表6:在疑似受SDD病毒影响的鱼和对照鱼中的SDD病毒qPCR和PCR结果（实验 2) NC:「如'|.土刈职
N/A:不可检测 P0S:阳性的 NEG:阴性的。
[0205] 实施例2 :在鱼中的SDD病毒攻击实验 实验件方案简要： (使用的缩写肌肉内，IP:腹膜内，ppt:每千份） 用细胞培养物繁殖的SDD病毒进行该实验。在该研究中使用四百六十（460)只亚洲海 鲈（20g) 〇
[0206] 如下攻击九十五（95)条鱼：1)高剂量腹膜内（IP)注射，2)低剂量IP注射，3)低 剂量肌肉内（頂）注射，和4)高剂量IP和低剂量IM注射的组合。为了样品对比目的，将另 外80条未攻击的鱼保持为阴性对照。
[0207] 在时间点攻击后第1、3、7、10和14天，收获十五（15)条鱼，每条来自5个组。观 察剩余的15条鱼直到第28天，以评价来自每种攻击方法的死亡率。
[0208] 在每个取样时间点，将收获的鱼的肾单个地取样，并按组将血清合并。检查样品用 于病毒定量，以限定鱼血清或肾中的最高病毒滴度的时间段。
[0209] 攻击材料 使用细胞培养物繁殖的SDD病毒作为攻击材料。所述病毒最初分离自印度尼西亚的亚 洲海鲈并在体外繁殖。使用在实施例1中描述的滴定方法确定病毒滴度。
[0210] 攻击材料稀释剂 标准疫苗稀释缓冲液：PBS+ 1. 5%NaCl用作攻击材料稀释剂。
[0211] 动物 物种：亚洲海自卢（Zaies caJcari/kr) 到达时的平均重量：大约2克/鱼（平均） 在实验开始时的平均重量：20g鱼的数目：共460条鱼。
[0212] 养葙 水：攻击后28°C±2°C的海水（30ppt) 饲料：从攻击后当天开始随意饲喂鱼。
[0213] 罐：将鱼圈养在4个250L罐中。在每个罐中安装垂直网，以建立在罐的1/3处的 分隔。罐的该1/3分隔保持15条用于死亡率观察的鱼。其它2/3罐保持80条用于时程收 获的鱼（参见表3)。将未攻击的对照鱼圈养在500L罐的一半中。将对照鱼的罐的水温度 与攻击鱼的罐对齐。
[0214]分组和给药: 动物的分配 该实验需要共计460条海鲈。在它们到手时，随机地挑选在期望大小（20g)内的鱼。
[0215]攻击: 鱼准备和鱼体重测量 在攻击之前将鱼饥饿至少36小时。在攻击之前，将20条来自每组的鱼一起称重以得 到每组的平均体重。
[0216] 表3.观察罐
V高剂量=〇.lml/鱼的未稀释的SDD病毒。 *2低剂量=〇.lml/鱼的10倍稀释的SDD病毒。 *3在每个时间段从隔离罐取鱼。
[0217]IP攻击（高剂量和低剂量） 在攻击操作之前，使用AQUI-S将所有鱼麻醉。给鱼在