一种表达鸡传染性法氏囊可溶性 vp 2-4-3多肽的方法
【专利摘要】本发明的目的是提供一种表达鸡传染性法氏囊可溶性VP2-4-3多肽的方法，能够克服目前鸡传染性法氏囊可溶性VP2-4-3蛋白重组表达时主要以包涵体方式表达的问题，从而弥补现有技术的不足。本发明提供一种改造的鸡传染性法氏囊VP 2-4-3多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明优化获得的VP2-4-3抗原保持了其主要抗原性，且经过了细胞周质的加工和修饰过程，结构上比单纯的原核表达的包涵体更接近于原蛋白结构，抗原特异性更强。并且该抗原为分泌表达，抗原纯化无需裂解细胞，避免了内毒素的引入回避了内毒素去除程序。该抗原更适于低成本大规模工业化生产。
【专利说明】-种表达鸡传染性法氏囊可溶性VP 2-4-3多化的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于蛋白重组表达【技术领域】，具体设及一种表达鸡传染性法氏囊可溶性VP 2-4-3多肤的方法。
【背景技术】
[000引传染性法氏囊病（infectious bursal disease, IBD)是由传染性法氏囊病病毒感 染，引起幼鸡发病的一种急性高度传染性疾病。该疾病发病率高，病程较短，对养殖业的危 害巨大。发病鸡主要表现为腹泻、颤抖、极度虚弱严重者引起死亡。而且幼鸡感染之后可导 致免疫抑制，诱发多种疫苗免疫失效。该病毒为双链RNA病毒，有单层衣壳，无囊膜。IBDV 病毒颗粒有五种蛋白构成，其中VP2蛋白可W诱导产生具有保护性的中和抗体，是发展亚 单位疫苗的理想抗原。目前临床上常用IBDV弱毒活疫苗及灭活疫苗进行免疫，应用弱毒活 疫苗需准确把握免疫时期，母源抗体水平降低时免疫，过早免疫效果不佳，已被中和，免疫 时期延后，由于其免疫抑制影响其他疫病免疫接种。灭活苗不利与长期维持较高抗体水平。 发展VP2蛋白的重组疫苗可W很好地解决传染性法氏囊病免疫抑制问题，但目前原核表达 VP2抗原多W包涵体的形式存在，导致获得蛋白的量达不到要求，且免疫效果欠佳。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种表达鸡传染性法氏囊可溶性VP 2-4-3多肤的方法，能 够克服目前鸡传染性法氏囊可溶性VP 2-4-3蛋白重组表达时主要W包涵体方式表达的问 题，从而弥补现有技术的不足。
[0004] 本发明首先提供一种改造的鸡传染性法氏囊VP 2-4-3多肤，其氨基酸序列为SEQ ID N0:1 ；
[0005] 本发明还提供一种编码上述鸡传染性法氏囊可溶性VP 2-4-3多肤的基因；作为 实施例的优选，上述基因的核巧酸序列为SEQ ID NO:2;
[0006] 本发明还提供一种重组质粒，所述的重组质粒携带有上述的基因；
[0007] 作为优选，上述的重组质粒中，在基因片段的前面来连接有OmpA信号肤。
[000引本发明再一个方面提供生产鸡传染性法氏囊可溶性VP 2-4-3多肤的方法，是用 转化有上述重组质粒的大肠杆菌发酵来制备的；
[0009] 本发明再提供一种疫苗，所述的疫苗中是用其氨基酸序列为SEQ ID NO: 1的鸡传 染性法氏囊可溶性VP 2-4-3作为抗原。
[0010] 本发明优化获得的的VP 2-4-3抗原保持了其主要抗原性，且经过了细胞周质的 加工和修饰过程，结构上比单纯的原核表达的包涵体更接近于原蛋白结构，抗原特异性更 强。并且该抗原为分泌表达，抗原纯化无需裂解细胞，避免了内毒素的引入回避了内毒素去 除程序。该抗原更适于低成本大规模工业化生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1;质粒构建示意图。
[001引 图2 ;分泌表达纯化后的VP2-4-3多肤PAGE图；
[0013] 图3 ; W抗传染性法氏囊病毒抗血清为抗体识别VP2-4-3多肤抗原的Western blotting 图。
【具体实施方式】
[0014] 本发明提供了一种优化后的鸡传染性法氏囊（I抓V LN 5/13)VP 2-4-3基因，通过 优化使VP 2-4-3更适用于分泌表达。并用大肠杆菌的I型跨膜转运分泌系统，在重新构建 VP 2-4-3基因序列的5'端连接能被大肠杆菌的Sec系统识别OmpA信号肤序列，引导转运 到细胞间质。把构造好的片段克隆到祀T-28a质粒，转化入E. coli化2UDE3)，IPTG诱导 即可制备分泌表达IBDV LN 5/13株VP 2-4-3可溶性抗原。
[0015] 鸡传染性法氏囊（I抓V LN 5/13)VP 2-4-3基因，其原始核巧酸序列为SEQ ID NO: 3,氨基酸序列为SEQ ID NO:4。但 申请人:发现VP 2-4-3多肤柔性较低不利于分泌表达， 因此对该多肤的氨基酸序列进行优化，使其更适于分泌表达，而且抗原特异性更强，从而促 成了本发明。
[0016] 下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
[0017] 实施例1 ;VP 2-4-3多肤的优化
[001引首先分析VP 2-4-3基因（SEQ ID NO:扣序列指导合成的肤链（SEQ ID NO:4)的 特征，发现C-score、S-score、Y-score的水平较低，肤链的前70个氨基酸序列不含有极性 较强的疏水区，没有明显的剪切位点，由此可认为该多肤链前段无特征性信号肤。肤链的抗 原特征显示亲水区多集中于肤链的前段及末端，中级为一段比较长的核屯、疏水区。该多肤 链的抗原特征区和肤链的亲水区大体相同，也集中与肤链的两端。肤链可翻转的角度较低， 柔性较低不利于分泌表达。 申请人:修改VP 2-4-3基因的基因序列，修改方法如下：
[0019] 开 放 阅 读 框 的 295-297，340-342, 508-510, 547-549, 553-555, 571-573, 589-591，607-609, 871-873, 889-891，910-912 的 半脱氨酸密码子扣GU、UGC)脯氨酸密码子（CCU、CCC)修改为甘氨酸密码子佑GU、GGC)。
[0020] 优化后的VP 2-4-3开放阅读框的核巧酸序列为SEQ ID NO:2,氨基酸序列为SEQ ID N0:1。
[0021] 实施例2 ;VP 2-4-3多肤的分泌表达
[0022] 在优化后的VP 2-4-3基因（核巧酸序列为SEQ ID NO: 2)开放阅读框的最前端加 入一段指导合成OmpA信号肤（MKKTAIAIAVALAGFATVAQA)序列的基因片段ATGAAAAAGACAGC TATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCAGGTTTCGCTACCGTCGCTCAGGCT，VP 2-4-3 优化后的基因片段去 掉前段的ATG直接连与OMPA信号肤序列之后。在信号肤的前面加入ATG起始密码子然后 连接修改后的VP 2-4-3序列，并把其直接置于质粒启动子的下游，然后加上化0 I，化0 I 双酶切位点，、OmpA;获得核巧酸序列为SEQ ID N0:5的片段。Nco I，化0 I分别双酶切基 因片段和表达载体祀T-28a(+)，并凝胶回收。4yl基因片段、lyl祀T-28a(+)载体片段、 0. 5 y 1 T4DNA酶、1 y 1连接酶缓冲液、3. 5 y 1 d地20,4°C连接过夜制成质粒（图1)。将重 组质粒转化到感受态E. coli BL2UDE3)中，在含50yg/ml卡那霉素的LB固体培养基上培 养过夜。挑取单菌落，加入含卡那霉素（50yg/ml)的LB液体培养基中，37°C振荡培养过夜， 提取质粒测序比对正确。
[002引取10 y 1菌液，加入含卡那霉素（50 y g/mU的LB液体培养基中，37°C振荡培养至 菌液A600达0. 4-0. 6时，加入终浓度为ImM的IPTG诱导表达，37°C振荡诱导化，收集浓缩 菌液，加入 4. 5yl DTT，2yl SXLoading 6证'61'，煮沸10111111，4°[ 10000肖离屯、10111111，取 15 y 1上清进行SDS-PAGE分析。Western blot分析在47邸处有明显条带，说明分泌表达 鸡传染性法氏囊IBDV LN 5/13株VP 2-4-3可溶性抗原疫苗株构建成功。
[0024] VP-2-4-3分泌表达及其验证
[0025] 取经过鉴定正确的上述菌种菌液100 y 1，涂布含有卡那霉素（50 y g/ml)的LB平 板，37°C过夜培养，挑取单菌落接入5ml含有卡那霉素（50yg/ml)的LB液体培养基中。 37 °C 18化/min转摇菌她后接入1000ml LB培养基中继续培养（卡那霉素浓度50 y g/ml、 转速18化/min)。化后菌液浓度达到OD值为0. 4-0. 6时，加入终浓度为ImM的IPTG诱导 表达化。
[0026] 取诱导后的1L菌液，800化/min离屯、lOmin收集上清，并加入截留分子量为30邸 的透析袋中，放入PEG2000透析过夜，透析袋内容物W 10ml双蒸水重新溶解。溶解产物经 过Bio-Gel P-200蛋白纯化柱，收集化ISA检测传染性方式囊抗原呈阳性的样品。测试收 集液蛋白浓度，最终换算为分泌可溶蛋白产率为240mg/L。该优化后的VP2-4-3基因应用 阳T-28a启动的表达效率远高与同样应用化mA信号肤引导表达的糖巧酶8mg/L (Protein Expr Purif，2002, 24:90-98)，及应用化oA信号肤表达鼠内皮抑制素的40mg/L (Protein Expr化rif, 2002, 24:453-459)的效率。图2为分泌表达纯化后的VP2-4-3多肤PAGE图 (左面为纯化的蛋白，右面为marker)。图3为W抗传染性法氏囊病毒抗血清为抗体识别 VP2-4-3多肤抗原的Western blotting结果表明明分泌表达的VP2-4-3多肤具有良好的抗 原活性。
【权利要求】
1. 一种鸡传染性法氏囊VP 2-4-3多肽，其特征，所述的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1〇
2. -种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的鸡传染性法氏囊可溶性 VP 2-4-3 多肽。
3. 如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO :2。
4. 一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒携带有权利要求2所述的基因。
5. 如权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述的基因片段的前面连接有OmpA信 号肽。
6. -种重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌是用权利要求4或5所述的质 粒转化/转染制备的。
7. -种生产权利要求1所述的鸡传染性法氏囊可溶性VP 2-4-3多肽的方法，其特征在 于，所述的方法是用权利要求6所述重组的大肠杆菌发酵来制备VP 2-4-3多肽。
8. -种疫苗，其特征在于，所述的疫苗是用权利要求1所述的鸡传染性法氏囊可溶性 VP 2-4-3多肽作为抗原。
【文档编号】A61P31/14GK104513298SQ201410753079
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2014年12月9日 优先权日:2014年12月9日
【发明者】李明义, 高江明, 刘阳, 冯晶晶, 单学强, 张伦, 赵航, 李佳琪, 孙化露 申请人:山东信得科技股份有限公司