一种重组戊型肝炎疫苗p179抗原的纯化方法

一种重组戊型肝炎疫苗p179抗原的纯化方法
【专利摘要】本发明提供一种重组戊型肝炎疫苗P179抗原的纯化方法，采用目的蛋白再经阴离子交换层析（阴离子层析介质）和疏水层析（疏水层析介质）相结合对重组戊型肝炎疫苗P179抗原进行纯化，能够在保护疫苗的免疫原性的基础上有效去除杂质，提高该疫苗的产量和质量稳定性。同时缩短了重组戊型肝炎疫苗P179抗原的纯化时间，降低了生产成本。
【专利说明】一种重组戊型肝炎疫苗P179抗原的纯化方法

【技术领域】
[0001]本发明提供一种重组戊型肝炎疫苗P179抗原的纯化方法，具体涉及酸沉、阴离子交换层析与疏水层析的应用，属于疫苗制备生产【技术领域】。

【背景技术】
[0002]戍型肝炎是一种由戍型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)引起的经肠道传播的急性肝炎，发病症状重，病死率高，常引起万人发病的大流行，对孕妇和胎儿的危害尤为严重，妊娠晚期病死率可高达15%-25%，且极易发生早产、流产和死胎。目前，对戊型肝炎尚无有效的治疗方法，预防是控制戊型肝炎病毒传播的重要措施，戊肝疫苗被世界卫生组织推荐为21世纪最优先发展的疫苗之一。
[0003]目前我国最流行的IV型HEV外壳蛋白P179片段(参见表1)作为疫苗的候选抗原，在大肠杆菌中进行了高效可溶性表达。采用纯化后的P179抗原配制成本重组戊型肝炎疫苗。
[0004]现有的大肠杆菌表达可溶性蛋白的纯化工艺流程一般是将发酵菌体通过过滤或离心沉淀澄清后，经裂解剂裂解至一定程度，再加入一定硫酸铵至一定饱和度，放置一定时间，然后经疏水层析柱和分子筛层析柱进一步提纯抗原活性组分；或者是将发酵菌体通过过滤或离心沉淀澄清后，经裂解剂裂解至一定程度，再加入一定硫酸铵至一定饱和度，放置一定时间，然后经阴离子交换柱层析和分子筛层析柱进一步提纯抗原活性组分。其中，获得可溶性蛋白质的工艺比较通用，而对溶性蛋白质进一步提纯的方法却有多种方法:
方法一:大肠杆菌表达可溶性蛋白经硫酸铵沉淀，采用一种或多种疏水层析柱一次或多次层析进行提纯；
方法二:大肠杆菌表达可溶性蛋白经硫酸铵沉淀，采用一种或多种分子筛层析柱一次或多次层析进行提纯；
方法三；大肠杆菌表达可溶性蛋白经硫酸铵沉淀，经分子筛层析后，再采用离子交换柱层析提纯抗原。
[0005]由此可见，传统的生产通常的大肠杆菌表达可溶性蛋白采用硫酸铵沉淀进行纯化，由于纯化步骤中大量多次使用硫酸铵沉淀，工艺参数不够稳定，一旦出现问题往往比较严重，问题查找的追溯型比较困难，且不易保持无菌，在设备与人力的投入上都大大超过了使用层析技术所需的投入，不适宜目前工业化大生产。采用硫酸铵沉淀提纯抗原的纯化效果上也无法有效地获得较高的抗原回收率。单步分子筛是指得到大肠杆菌表达可溶性蛋白后，通过一种或多种分子筛填料进行层析提纯。这种方法仅仅通过分子量大小不同的单一原理来分离杂质，只能分开不用分子量的物质，而对于相近分子量的物质就算经过更长的层析路径也无法分离，对于与抗原分子量相近的杂质，特别是DNA无法做到有效的去除。同时由于分子筛层析工艺批量较小，从而导致疫苗产品批间差异大，产品质量稳定性不够好。


【发明内容】

[0006]本发明的目的在提供一种重组戊型肝炎疫苗P179抗原的纯化方法，操作规程简单、方便，并利于规模化生产。
[0007]本发明提供的一种重组戊型肝炎疫苗P179抗原的纯化方法，其工艺步骤为:
1、将表达重组戊肝疫苗P179抗原的大肠杆菌HEV 179/BL21(DE3)破碎，调节破菌液pH至酸性，使杂蛋白沉淀，离心去除杂蛋白及细胞碎片，得粗提液。
[0008]2、粗提液经阴离子交换层析或疏水层析初步纯化P179抗原，含目的蛋白的洗脱液经处理后再用疏水层析或阴离子交换层析纯化，获得精纯的P179抗原。
[0009]3、含精纯P179抗原的层析洗脱液经过滤除菌后即为重组戊型肝炎疫苗原液。
[0010]在所述步骤(2)和(3)过程中，检测重组戊型肝炎疫苗原液的蛋白浓度在2~5mg/ml之间，目的蛋白回收率40%~60%，原液外源性DNA残留量应≤Ing/剂，宿主菌蛋白残留量小于总蛋白质含量的0.10%，疫苗原液稀释10倍后的细菌内毒含量应< 5EU/ml。经蛋白电泳检测纯度> 95%，经高效液相检测纯度> 95%。
[0011]所述的一种重组戊型肝炎疫苗P179抗原的纯化方法，其中，步骤(1)中所述表达重组戊肝疫苗抗原P179的工程菌破菌方法为超声波法或匀质法。超声仪超声破碎I~3次或匀质机匀质(600bar~800bar)破碎I~3次,破菌液滴加0.lmol/L~lmol/L盐酸调至破菌液的pH为2.0~5.5之间，使杂蛋白沉淀。将沉淀物放入离心机，离心力6000rpm~12000rpm,离心时间40分钟，得上清液。用0.22 μ m滤膜过滤除菌，将目的蛋白与杂蛋白及细胞碎片初步分离，得粗提液。
[0012]所述的一种重组戊型肝炎疫苗P179抗原的纯化方法，其中，步骤(2)中所述采用的层析纯化次序可以是先进行阴离子交换层析再进行疏水层析，也可以是先进行疏水层析再进行阴离子交换层析。
[0013]所述的一种重组戊型肝炎疫苗的纯化方法，其中，步骤(2)中所述采用的阴离子交换层析介质是阴离子层析介质，疏水层析介质是疏水层析介质。
[0014]所述的一种重组戊型肝炎疫苗P179抗原的纯化方法，其中，步骤(2)中所述采用的阴离子交换层析介质，层析柱柱高10~100厘米，粗提液的体积为阴离子层析柱体积的
1.5~3倍，用三羟甲基氨基甲烷-盐酸pH在7.0~9.0之间平衡，用氯化钠溶液浓度在0.05~0.12mol/L之间洗脱杂蛋白，用氯化钠溶液浓度在0.13~0.20mol/L之间洗脱目的蛋白，洗脱溶剂的流速为50~150ml/min。紫外检测器波长280nm处检测。
[0015]所述的一种重组戊型肝炎疫苗P179抗原的纯化方法，其中，步骤(2)中所述采用的疏水层析介质，层析柱柱高10~100厘米，粗提液的体积为疏水层析柱体积的1.5~3倍。疏水层析平衡液pH在4.0~6.0之间，洗脱杂蛋白的氯化钠浓度在0.30~3.0Omol/L之间，洗脱目的蛋白的氯化钠浓度在0.10~0.20mol/L之间。洗脱溶剂的流速为50~150ml/min。紫外检测器波长280nm处检测。
[0016]所述的一种重组戊型肝炎疫苗P179抗原的纯化方法，其中，步骤(3)中所述重组戊型肝炎疫苗原液的蛋白浓度在2~5mg/ml之间，目的蛋白回收率40%~60%，原液外源性DNA残留量应< Ing/剂，宿主菌蛋白残留量应小于总蛋白质含量的0.10%，疫苗原液稀释10倍后的细菌内毒含量应小于5EU/ml。经蛋白电泳检测纯度应> 95%，经高效液相检测纯度应> 95%。本发明提供一种重组戊型肝炎疫苗P179抗原的纯化方法，该纯化方法将阴离子交换层析和疏水层析相结合对重组戊型肝炎疫苗抗原P179进行纯化，重组戊型肝炎疫苗原液的蛋白浓度在2~5mg/ml之间，目的蛋白回收率40%~60%，原液外源性DNA残留量应< Ing/剂，宿主菌蛋白残留量应小于总蛋白质含量的0.10%，疫苗原液稀释10倍后的细菌内毒含量小于5EU/ml。该纯化工艺稳定、简单、易于产业化。本发明由于加入酸沉步骤，可大大减轻离子交换层析和疏水层析的压力，有效保障了抗原的免疫原性，只需要很低含量的抗原即可达到足够的效力。经过两步层析，均可有效去除浓缩液中杂质，特别是DNA、残留的宿主蛋白等物质。
[0017]本发明根据目的蛋白与杂蛋白及细胞碎片各种分子在不同酸性作用下稳定性不同的特点，使欲分离的目的蛋白以病毒样颗粒(VLP)形式存在存在于溶液中，而且保持其活性，其他成分(杂蛋白及细胞碎片)由于酸性条件因素影响下，可引起杂蛋白质失去表面的水化层和双电层破坏其稳定的亲水状态，达到其等电点，失去表面的电荷在水溶液中溶解度最小而沉淀。尤其当溶液的酸性条件影响下发生剧烈变化时，引起杂蛋白的变性而沉淀，变性作用破坏杂蛋白氢键构象稳定，影响杂蛋白氨基酸残基侧链之间的相互作用，从而达到纯化有效成分的目的。离心分层使目的蛋白纯度在上清液中达到80%以上。
[0018]本发明的积极效果在于:
(I)重组戊型肝炎疫苗抗原P179的工程菌所表达的重组戊肝抗原P179为胞内可溶性表达，且表达产物以病毒样颗粒(VLP)形式存在，由于加入破菌、酸沉、离心这三个步骤，可大大减轻离子交换层析和疏水层析的压力，有效保障了抗原的免疫原性，只需要很低含量的抗原即可达到足够的效力。
[0019](2)纯化方法将阴离子交换层析和疏水层析相结合对重组戊型肝炎疫苗抗原P179进行纯化，经过两步层析，均可有效去除浓缩液中杂质，特别是DNA、残留的宿主蛋白等物质，获得精纯的目的P1 79抗原，蛋白浓度在2~5mg/ml之间，目的蛋白回收率40%~60%，，原液外源性DNA残留量应小于Ing/剂，宿主菌蛋白残留量应小于总蛋白质含量的0.10%，疫苗原液稀释10倍后的细菌内毒含量应小于5EU/ml。经蛋白电泳检测纯度应> 95%，经高效液相检测纯度应> 95%。该纯化工艺稳定、简单、易于产业化。
[0020](3)含精纯P179抗原的层析洗脱液经过滤除菌后即为重组戊型肝炎疫苗原液。
[0021]采用目的蛋白再经阴离子交换层析(阴离子层析介质)和疏水层析(疏水层析介质)相结合对重组戊型肝炎疫苗P179抗原进行纯化，能够在保护疫苗的免疫原性的基础上有效去除杂质，提高该疫苗的产量和质量稳定性。同时缩短了重组戊型肝炎疫苗P179抗原的纯化时间，降低了生产成本。

【专利附图】

【附图说明】
[0022]图1为本发明重组戊型肝炎疫苗P179抗原的工艺流程图；
图2为本发明重组戊型肝炎疫苗P179抗原的电镜(实施例1)观察图；
图3为本发明重组戊型肝炎疫苗P179抗原的电镜(实施例2)观察图；
图4为本发明重组戊型肝炎疫苗原液的高效液相(实施例1)图；
图5为本发明重组戊型肝炎疫苗原液的高效液相(实施例2)图；
图6为本发明重组戊型肝炎疫苗P179抗原的匀质、酸沉蛋白电泳(实施例1)图；
图7为本发明重组戊型肝炎疫苗P179抗原的匀质、酸沉蛋白电泳(实施例2)图；
图8为本发明重组戊型肝炎疫苗P179抗原的蛋白电泳图分子量为19KD ；图9为本发明重组戊型肝炎疫苗P179抗原基础结构为二聚体分子量为38KD ；
图10为本发明重组戊型肝炎疫苗P179抗原的紫外分光光度扫描分析图；
图11为本发明提供一种重组戊型肝炎疫苗原液的残余DNA检测图(实施例1)显示了疫苗原液残留DNA检定结果为每剂< lng。

【具体实施方式】
[0023]本发明提供一种重组戊型肝炎疫苗P179抗原的纯化方法，为使发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，举实例对本发明进一步详细说明(参照附图1)。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0024]实施例1
重组戊型肝炎疫苗抗原的纯化方法
重组戊型肝炎疫苗抗原P179的工程菌主要在大肠杆菌中表达，经过匀质破碎洗涤后，可溶性表达P179抗原释放在溶解于溶液中，然后经过调节pH至酸性，上清液中P179抗原纯度达65%以上(参照附图6 )。
[0025]按照之前描述的方法，选用匀质机将表达重组戊肝疫苗抗原P179的工程菌匀质(800bar)破碎2次，将匀质破碎后液体倒入烧杯中，搅拌的同时滴加lmol/L盐酸调至pH为
4.0。使杂蛋白质沉淀，酸用0.22 μ m滤膜过滤除菌，将目的蛋白与杂蛋白及细胞碎片初步分离，得粗提液。
[0026]重组戊型肝炎疫苗抗原的粗提液，采用的层析纯化次序可以是先经阴离子交换层析初步纯化目的蛋白P179，含目的蛋白的洗脱液经处理后再用疏水层析纯化，获得精纯的目的蛋白P179。
[0027]阴离子交换层析介质(DEAE-Sepharose FF)分离,层析柱柱高20厘米,粗提液的体积为阴离子层析柱体积的3倍。平衡阴离子交换层析的三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液，pH为8.0，用0.07mol/L氯化钠溶液洗脱杂蛋白，采用0.20mol/L氯化钠溶液洗脱目的蛋白。洗脱溶剂的流速为80ml/min。紫外检测器波长280nm处检测。
[0028]收集阴离子交换柱层析后样品，以50/min的流速泵入疏水柱层析介质(Phenyl-Sepharose 6FF)层析分离,层析柱柱高15厘米,在上样之前用3倍柱体积的平衡液溶剂平衡层析柱。平衡液PH在4.0之间，洗脱杂蛋白的氯化钠浓度为3.0mol/L，洗脱目的蛋白的氯化钠浓度为0.15mol/L。紫外检测器波长280nm处检测，获得精纯的目的蛋白P179，经蛋白电泳检测纯度达98.8% (参见附图8和附图9)，经高效液相检测纯度达99.9%(参见附图4)。目的蛋白回收率在40%~60%，，原液外源性DNA残留量小于Ing/剂(见附图11)，宿主菌蛋白残留量小于总蛋白质含量的0.10%，疫苗原液稀释10倍后的细菌内毒含量小于5EU/ml ο
[0029]含精纯P179抗原的层析洗脱液经过滤除菌后即为重组戊型肝炎疫苗原液。
[0030]实施例2
重组戊型肝炎疫苗抗原的纯化方法
重组戊型肝炎疫苗抗原P179的工程菌主要在大肠杆菌中表达，经过超声仪超声破碎洗涤后，可溶性表达P179抗原释放在溶解于溶液中，然后经过调节pH至酸性，上清液中P179抗原纯度达80%以上(参照附图7)。
[0031]按照之前描述的方法，选用匀质机将表达重组戊肝疫苗抗原P179的工程菌超声仪超声破碎I~3次,将匀质破碎后液体倒入烧杯中,搅拌的同时滴加lmol/L盐酸调至pH为4.0。使杂蛋白质沉淀，酸沉后于SOOOrpm离心40分钟，上清液目的蛋白含量的纯度占上清总蛋白的65%以上。取上清用0.22 μ m滤膜过滤除菌，将目的蛋白与杂蛋白及细胞碎片初步分离，得粗提液。
[0032]重组戊型肝炎疫苗抗原的粗提液，采用的层析纯化次序可以是先经疏水层析纯化，初步纯化目的蛋白P179，含目的蛋白的洗脱液经处理后再用阴离子交换层析纯化，获得精纯的目的蛋白P179。
[0033]疏水柱层析介质(Phenyl-Sepharose 6FF)层析分离,层析柱柱高15厘米,在上样之前用3倍柱体积的平衡液溶剂平衡层析柱。平衡液pH在4.0之间，洗脱杂蛋白的氯化钠浓度为3.0mol/L,洗脱目的蛋白的氯化钠浓度为0.15mol/Lo紫外检测器波长280nm处检测。收集疏水柱层析后样品。以80/min的流速泵入阴离子交换层析介质(DEAE-SepharoseFF)分离，层析柱柱高20厘米，粗提液的体积为阴离子层析柱体积的3倍。平衡阴离子交换层析的三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液，pH为8.0，用0.07mol/L氯化钠溶液洗脱杂蛋白，采用0.20mol/L氯化钠溶液洗脱目的蛋白。紫外检测器波长280nm处检测。获得精纯的目的蛋白P179。经蛋白电泳检测纯度达98.8% (参见附图8和附图9)，经高效液相检测纯度达99.9% (参见附图5)。目的蛋白回收率在50%左右，原液外源性DNA残留量小于Ing/剂(见附图 11，图中，P:阳性对照 Dl:64.5ng D2:6.45ng D3:0.645ng D4:0.0645ng N:阴性对照al (实例一样品)、bl (实施二样品)为疫苗原液)，宿主菌蛋白残留量小于总蛋白质含量的0.10%，疫苗原液稀释10倍后的细菌内毒含量小于5EU/ml。
[0034]含精纯P179抗原的层析洗脱液经过滤除菌后即为重组戊型肝炎疫苗原液。
[0035]试验例:
重组戊型肝炎疫苗抗原的分析方法
根据实施例1和实施例2描述重组戊型肝炎疫苗抗原的纯化流程，将重组戊型肝炎工程菌，破碎后酸沉，并在阴离子层析柱和疏水柱层析中纯化，然后超滤除菌过滤，从而得到重组戊型肝炎疫苗抗原。使用透射电镜观察、高效液相色谱分析、SDS-聚丙烯胺凝胶电泳检测分析、紫外分光光度扫描分析等方法对重组戊型肝炎疫苗抗原进行研究。
[0036]透射电镜观察:
使用的仪器为日本日立公司生产的H600-A透射电镜，放大倍数为30，000倍。将获得的重组戊型肝炎疫苗抗原用2%磷钨酸pH6.4负染，固定于铜网上，进行观察。电镜效果见图2，其中可见大部分呈现直径为20nm左右、大小均匀的病毒样颗粒。
[0037]高效液相色谱分析:
使用的仪器为日本岛津液相CBM-lOAvp Plus分析型高效液相色谱层析系统以及TSKGel PW5000xl 7.8 X 300mm柱子进行分子筛层析分析。以2倍柱体积的生理盐水预先平衡层析柱，直至280nm处的吸收值无明显变化。将检测器的吸收值归零，然后由自动进样器进样并进行分析。结果如图3所示，按面积归一化法计算，戊肝疫苗抗原主峰面积应不低于总面积的95.0%。
[0038]聚丙烯胺凝胶电泳检测分析:使用的仪器为美国伯乐公司电泳仪，SDS-聚丙烯胺凝胶电泳分子筛作用能够对蛋白质的组分进行分离，样品与载样液混合后不进行煮沸处理，分离胶胶浓度为15%，考马斯亮兰R250染色。蛋白主区带为19kD、38kD (二聚体蛋白)，经扫描，结果如图5所示，单体及二聚体总量应在95.0%以上，二聚体应占总蛋白的80%~100%。
[0039]紫外分光光度扫描分析
使用的仪器为日本岛津公司生产紫外可见分光光度计UV-2550，用生理盐水将供试品稀释至500 μ g/ml左右，在光路Icm,波长190nm~400nm下进行扫描，结果如图10所不,最大吸收峰波长应为278 nm±3nm。
[0040]戊型肝炎疫苗原液检定结果如下:

【权利要求】
1.一种重组戊型肝炎疫苗P179抗原的纯化方法，包括以下步骤: 1)将表达重组戊肝疫苗P179抗原的大肠杆菌HEV179/BL21 (DE3)破碎，调节破菌液PH至酸性，使杂蛋白沉淀，离心去除杂蛋白及细胞碎片，得粗提液； 2)粗提液经阴离子交换层析或疏水层析初步纯化P179抗原，含目的蛋白的洗脱液经处理后再用疏水层析或阴离子交换层析纯化，获得精纯的P179抗原； 3)含精纯P179抗原的层析洗脱液经过滤除菌后即为重组戊型肝炎疫苗原液。
2.权利要求1所述的一种重组戊型肝炎疫苗P179抗原的纯化方法，其特征在于: 步骤1)中所述表达重组戊肝疫苗抗原P179的工程菌破菌方法为超声波法或匀质法，破菌液滴加0.lmol/L~lmol/L盐酸调至破菌液的pH在2.0~5.5之间，使杂蛋白沉淀；离心，过滤除菌，得粗提液。
3.权利要求1所述的一种重组戊型肝炎疫苗P179抗原的纯化方法，其特征在于: 步骤(2)中所述采用的层析纯化次序可以是先进行阴离子交换层析再进行疏水层析，也可以是先进行疏水层析再进行阴离子交换层析。
4.权利要求1所述的一种重组戊型肝炎疫苗P179抗原的纯化方法，其特征在于: 步骤(2)中所述采用的阴离子交换层析介质，层析柱柱高10~100厘米，粗提液的体积为阴离子层析柱体积的1.5~3倍，用三羟甲基氨基甲烷-盐酸pH在7.0~9.0之间平衡，用氯化钠溶液浓度在0.05~0.12mol/L之间洗脱杂蛋白，用氯化钠溶液浓度在0.13~0.20mol/L之间洗脱目的蛋白，洗脱溶剂的流速为50~150ml/min ;紫外检测器波长280nm处检测。
5.权利要求1所述的一种重组戊型肝炎疫苗P179抗原的纯化方法，其特征在于: 步骤(2)中所述采用的疏水层析介质，层析柱柱高10~100厘米，粗提液的体积为疏水层析柱体积的1.5~3倍；疏水层析平衡液pH在4.0~6.0之间，洗脱杂蛋白的氯化钠浓度在0.30~3.00mol/L之间，洗脱目的蛋白的氯化钠浓度在0.10~0.20mol/L之间；洗脱溶剂的流速为50~150ml/min ;紫外检测器波长280nm处检测。
【文档编号】C07K1/18GK104130317SQ201410354886
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月24日 优先权日:2014年7月24日
【发明者】陈子杨, 迟祥, 贾媛, 李铮, 张健锋, 时成波, 迟春萍 申请人:长春生物制品研究所有限责任公司