专利名称：一种戊型肝炎病毒嵌合基因疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，是一种预防戊型肝炎病毒感染的嵌合基因疫苗。
背景技术：
戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(HEV)引起的病毒性肝炎，是发展中国家较常见的传染病，我国为高发区，人群感染率达17.2％，且呈上升趋势。该病流行广泛，病人发病症状重，病死率高(平均为1％-2％，最高可达10％-20％)，病情凶险，主要威胁青壮年，常引起爆发或流行，给社会带来恐慌和经济损失。1986年至1988年我国新疆维吾尔族自治区南部，曾发生迄今为止最大的HEV流行，历时20个月，共发病119280人，72％为15～44岁青壮年，总罹患率为2.96％，病死率0.59％，孕妇平均病死率13.46％，晚期妊娠病死率高达20.96％，流行原因主要为水源及食物污染。此外，该病在我国急性散发性病毒性肝炎中也占有较高的比例，平均约为8.6％，病死率为2.5％。随着甲型肝炎疫苗的使用，甲型肝炎的发病率逐年大幅度下降，但与甲型肝炎病毒具有相同的粪-口传播途径的戊型肝炎病毒发病率却不断攀升，控制该病已刻不容缓。为此全世界科学家进行了艰苦的努力。
研制有效疫苗是控制HEV传染的关键。由于戊型肝炎病毒组织培养困难，难以研制减毒或灭活疫苗。因此，基因疫苗和多肽疫苗的研制成为研究的热点。基因疫苗是一种新型疫苗，具有以下优点能诱导T、B淋巴细胞参与机体的免疫应答，并兼有多肽疫苗和合成肽疫苗的特性；兼有重组亚单位疫苗的安全性和减毒活疫苗诱导全面免疫应答的高效性；一次接种可获长期免疫力；制备简单，成本低，运输储存方便，临床应用安全有效。
抗原位点选择是基因疫苗研制能否成功的关键。国内外最新研究结果表明，HEV具有3个开放读码框(ORF)，ORF1位于非结构区，编码非结构蛋白；ORF2和ORF3位于结构区，前者编码结构蛋白或核壳蛋白，含有7个抗原表位，具有与HEV颗粒抗原相似的抗原性，后者介于ORF1和ORF2之间，含有4个抗原表位。根据以上研究成果，国内外对HEV进行了大量研究，证明HEV的抗原表位主要在ORF2和ORF3中，并进行了ORF2和ORF3的表达及抗原性研究。但国内外尚未开展HEV嵌合基因疫苗的研制。
发明内容
本发明的目的是研制一种安全、高效的戊型肝炎病毒(HEV)嵌合基因疫苗(见附图1)，为预防控制戊型肝炎流行提供最有效的措施。
本发明以戊型肝炎病人粪便为标本，按常规方法提取病毒RNA，用引物1和2，对HEV ORF2基因进行RT-PCR扩增，用引物2和4对HEV ORF3基因进行RT-PCR扩增。上述PCR产物经过纯化后，用BamHI/EcoRI酶切后将ORF2基因片断插入到pET28a+质粒中，获得pET28-ORF2(见附图2)，再用EcoRI/XhoI酶切后将ORF3基因片段插入到pET28-ORF2质粒中，获得嵌合重组质粒pET28-ORF23(见附图3)。将重组质粒pET28-ORF23转化E.coli BL21(DE3)菌株，用IPTG进行诱导，用His-纯化体系纯化目的蛋白，获得融合蛋白ORF23。该融合蛋白可作为抗原用于HEV诊断试剂盒的制备，也可用于制备预防戊型病毒性肝炎的多肽疫苗。
本发明以嵌合重组质粒pET28-ORF23为模板，用引物T1和T2进行PCR扩增。上述PCR产物经过纯化后，用Kpn I/Xba I酶切后将ORF23基因片断插入到酵母表达重组质粒pPICZαA中，获得嵌合重组质粒pPICZαA-ORF23(见附图4)。嵌合重组质粒pPICZαA-ORF23用Sac I将质粒载体线性化，通过电转移将线性化后的质粒DNA转入酵母细胞中，用纯甲醇进行诱导，用His-纯化体系纯化目的蛋白，获得融合蛋白ORF23。该融合蛋白可作为抗原用于HEV诊断试剂盒的制备，也可用于制备预防戊型病毒性肝炎的多肽疫苗。
本发明用BamHI/XhoI双酶解，从重组质粒pET28-ORF23中切下HEVORF23基因片段，再插入到pcDNA3质粒中，获得重组质粒pcDNA3-ORF23(见附图5)。重组质粒作为基因疫苗免疫Blab/C小鼠，免疫途径为肌肉注射，注射剂量为100ug和200ug，隔3周1次，共注射2次。每次注射后2周取小鼠血清检测抗体，末次注射后检测小鼠的T细胞增殖反应。结果发现经2次免疫后，小鼠均产生HEV特异性抗体，并产生明显的T细胞增殖反应。说明该重组质粒可作为HEV嵌合基因疫苗。
戊型肝炎病毒(HEV)嵌合基因疫苗，它含有编码HEV开放读码框2蛋白(ORF2)基因，它能够指导产生HEV蛋白质或与HEV蛋白质基本同源的蛋白质。该核酸序列被称为HEV ORF2示于下面HEV ORF2CAGCTGTTCT ACTCTCGTCC CGTCGTCTCA GCCAATGGCG AGCCGACTGT 50TAAGCTTTAT ACATCTGTAG AGAATGCTCA GCAGGATAAG GGTATTGCAA 100TCCCGCATGA CATCGACCTC GGGGAGTCTC GTGTAGTTAT TCAGGATTAT 150GACAACCAAC ATGAGCAGGA CCGACCGACA CCTTCCCCAG CCCCATCGCG 200CCCTTTTTCT GTCCTCCGAG CTAATGATGT GCTTTGGCTT TCTTTCACCG 250CTGCCGAGTA TGACCAGTCC ACTTACGGCT CTTCGACCGG CCCAGTCTAT 300GTCTCTGACT CTGTGACCTT GGTTAATGTT GCGACCGGCG CGCAGGCCGT 350TGCCCGGTCA CTCGACTGGA CCAAGGTCAC ACTTGATGGT CGCCCCCTTT 400CCACCATCCA GCAGCATTCA AAGACCTTCT TTGTCCTGCC GCTCCGCGGT 450AAGCTCTCCT TTTGGGAGGC AGGTACTACT AAAGCCGGGT ACCCTTATAA 500TTATAACACC ACTGCTAGTG ACCAACTGCT CGTTGAGAAT GCCGCTGGGC 550ATCGGGTTGC TATTTCCACT TACACCACTA GCCTGGGTGC TGGCCCCGTC 600TCTATTTCCG CGGTTGCTGT TTTAGCCCCC CACTCCGCGC TAGCATTGCT 650TGAGGATACC ATGGACTACC CTGCCCGCGC CCATACTTTC GATGACTTCT 700GCCCGGAGTG CCGCCCCCTT GGCCTCCAGG GCTGTGCTTT TCAGTCTACT 750
GTCGCTGAGC TTCAGCGCCT TAAGATGAAG GTGGGTAAAA CTCGGGAGTT 800G 801戊型肝炎病毒(HEV)嵌合基因疫苗，它含有编码HEV开放读码框3蛋白(ORF3)基因，它能够指导产生HEV蛋白质或与HEV蛋白质基本同源的蛋白质。该核酸序列被称为HEV ORF3示于下面HEV ORF3ATGAATAACA TGTCTTTTGC TGCGCCCATG GGTTCGCGAC CATGCGCCCT 50CGGCCTATTT TGCTGTTGCT CCTCATGTTT CTGCCTATGC TGCCCGCGAC 100ACCGCCCGGT CAGCCGTCTG GCCGCCGTCG TGGGCGGCGC AGCGGCGGTT 150CCGGCGGTGG TTTCTGGGGT GACCGGGTTG ATTCTCAGCC CTTCGCAATC 200CCCTATATTC ATCCAACCAA CCCCTTCGCC CCCGATGTCA CCGCTGCGGC 250CGGGGCTGGA CCTCGTGTTC GCCAACCCGC CCGACCACTC GGCTCCGCTT 300GGCGTGACCA GGCCCAGCGC CCCGCCGCTG CCTCACGTCG TAGACCTACC 350ACAGCTGGGG CCGCGCCGCT AA372戊型肝炎病毒(HEV)嵌合基因疫苗，它同时含有编码HEV ORF2基因和ORF3基因，并组成一个嵌合基因ORF23，它能够指导产生HEV蛋白质或与HEV蛋白质基本同源的蛋白质。该核酸序列被称为HEV ORF23示于下面HEV ORF23ATGCAGCTGT TCTACTCTCG TCCCGTCGTC TCAGCCAATG GCGAGCCGAC 50TGTTAAGCTT TATACATCTG TAGAGAATGC TCAGCAGGAT AAGGGTATTG 100CAATCCCGCA TGACATCGAC CTCGGGGAGT CTCGTGTAGT TATTCAGGAT 150TATGACAACC AACATGAGCA GGACCGACCG ACACCTTCCC CAGCCCCATC 200
GCGCCCTTTT TCTGTCCTCC GAGCTAATGA TGTGCTTTGG CTTTCTTTCA 250CCGCTGCCGA GTATGACCAG TCCACTTACG GCTCTTCGAC CGGCCCAGTC 300TATGTCTCTG ACTCTGTGAC CTTGGTTAAT GTTGCGACCG GCGCGCAGGC 350CGTTGCCCGG TCACTCGACT GGACCAAGGT CACACTTGAT GGTCGCCCCC 400TTTCCACCAT CCAGCAGCAT TCAAAGACCT TCTTTGTCCT GCCGCTCCGC 450GGTAAGCTCT CCTTTTGGGA GGCAGGTACT ACTAAAGCCG GGTACCCTTA 500TAATTATAAC ACCACTGCTA GTGACCAACT GCTCGTTGAG AATGCCGCTG 550GGCATCGGGT TGCTATTTCC ACTTACACCA CTAGCCTGGG TGCTGGCCCC 600GTCTCTATTT CCGCGGTTGC TGTTTTAGCC CCCCACTCCG CGCTAGCATT 650GCTTGAGGAT ACCATGGACT ACCCTGCCCG CGCCCATACT TTCGATGACT 700TCTGCCCGGA GTGCCGCCCC CTTGGCCTCC AGGGCTGTGC TTTTCAGTCT 750ACTGTCGCTG AGCTTCAGCG CCTTAAGATG AAGGTGGGTA AAACTCGGGA 800GTTGAATTCG GGTGGAATGA ATAACATGTC TTTTGCTGCG CCCATGGGTT 850CGCGACCATG CGCCCTCGGC CTATTTTGCT GTTGCTCCTC ATGTTTCTGC 900CTATGCTGCC CGCGACACCG CCCGGTCAGC CGTCTGGCCG CCGTCGTGGG 950CGGCGCAGCG GCGGTTCCGG CGGTGGTTTC TGGGGTGACC GGGTTGATTC 1000TCAGCCCTTC GCAATCCCCT ATATTCATCC AACCAACCCC TTCGCCCCCG 1050ATGTCACCGC TGCGGCCGGG GCTGGACCTC GTGTTCGCCA ACCCGCCCGA 1100CCACTCGGCT CCGCTTGGCG TGACCAGGCC CAGCGCCCCG CCGCTGCCTC 1150
ACGTCGTAGA CCTACCACAG CTGGGGCCGC GCCGCTAA 1188戊型肝炎病毒(HEV)嵌合基因疫苗，它是将嵌合基因ORF23插入到真核表达质粒中，构成重组质粒，重组质粒可作为一种预防戊型肝炎病毒感染的嵌合基因疫苗。
戊型肝炎病毒嵌合基因ORF23，它可插入到各类表达载体中，构成表达重组质粒，并可表达出HEV ORF2和ORF3融合蛋白，该融合蛋白可用于制备预防戊型病毒性肝炎的多肽疫苗。
基因疫苗作为近年发展起来的一种全新疫苗，不仅可诱发机体产生保护性抗体，更重要的是可诱导针对病毒的细胞免疫。研究表明，基因疫苗诱导细胞免疫的机制在于它模拟了病毒的自然感染过程。质粒DNA(基因疫苗)被肌细胞摄取后，合成的蛋白质被降解为含抗原表位的肽段，进入内质网与MHC I类分子结合，再转运至细胞膜，激活受MHC I类分子限制的CD8+CTL。部分分泌入血的抗原，诱导体液免疫，或被树突状细胞等抗原递呈细胞俘获，经加工并与MHC II类分子结合，激活CD4+Th细胞，分泌IFN-γ，IL-2等细胞因子，参与免疫调节作用。基因疫苗的出现为人类征服病毒性疾病等带来了希望，具有极为广阔的应用前景。
图1为本发明戊型肝炎病毒嵌合基因疫苗的结构示意图。
图2为含戊型肝炎病毒ORF2基因的重组质粒pET28-ORF2的构建流程图。
图3为含戊型肝炎病毒ORF2基因和ORF3基因的重组质粒pET28-ORF23的构建流程图。
图4为含戊型肝炎病毒ORF2基因和ORF3基因的酵母表达重组质粒pPICZαA-ORF23的构建流程图。
图5为含戊型肝炎病毒ORF2基因和ORF3基因的嵌合基因疫苗pcDNA3-ORF23的构建流程图。
具体实施例方式
实施例1含HEV ORF23嵌合基因的原核表达质粒的构建以戊型肝炎病人粪便为标本，按常规方法提取病毒RNA，用引物1和2，对HEV ORF2基因进行RT-PCR扩增，用引物2和4对HEV ORF3基因进行RT-PCR扩增。逆转录反应(RT)条件为42℃ 1小时；PCR条件为94℃ 1分钟，52℃ 1分钟，72℃ 2分钟，共35个循环。上述PCR产物经过纯化后，用BamHI/EcoRI酶切后将ORF2基因片断插入到pET28a+质粒中，获得pET28-ORF2(见附图2)，再用EcoRI/XhoI酶切后将ORF3基因片段插入到pET28-ORF2质粒中，获得嵌合重组质粒pET28-ORF23(见附图3)。
引物15’GTC GGA TCC ATG CAG CTG TTC TAC TCC CGT 3’引物25’GTC GAA TTC AAC TCC CGA GTT TTA CC 3’引物35’GGC TGG AAT TCG GGT GGA ATG AAT AAC ATG 3’引物45’GTG GCT CGA GTT AGC GGC GCG GCC CCA GCT GT 3’嵌合蛋白ORF23的表达和纯化将表达重组质粒pET28-ORF23转化E.coliBL21(DE3)菌株，挑取单克隆，用50ug/ml卡那霉素的LB 37℃培养至A600达0.8左右，用0.5mM的IPTG进行诱导，诱导条件32℃，4小时。离心收集菌体，用缓冲液(0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，PH7.9)悬浮，超声粉碎菌体，用His-纯化体系纯化目的蛋白，获得融合蛋白ORF23。融合蛋白经ELISA，Western-blot等鉴定，为HEV特异性抗原。融合蛋白ORF23可作为抗原用于HEV诊断试剂盒的制备，也可用于预防戊型病毒性肝炎的多肽疫苗的制备。
实施例2含HEV ORF23嵌合基因的酵母表达重组质粒的构建以嵌合重组质粒pET28-ORF23为模板，用引物T1和T2进行PCR扩增。PCR条件为94℃ 1分钟，52℃ 1分钟，72℃ 2分钟，33个循环。上述PCR产物经过纯化后，用Kpn I/Xba I酶切后将ORF23基因片断插入到酵母表达重组质粒pPICZαA中，获得嵌合重组质粒pPICZαA-ORF23(见附图4)。
引物T15’GAC TGG GTA CCC AGC TGT TCT ACT CTC GT 3’引物T25’GTA CTC TAG ACA GCG GCG CGG TCC CAG C 3’嵌合蛋白ORF23的表达和纯化将嵌合重组质粒pPICZαA-ORF23用Sac I将质粒载体线形化，通过电转移将线性化后的质粒DNA转入酵母细胞中。电转后细胞用含100ug/ml Zeocin的YPDS平板进行培养、筛选直到获得单菌落。再用MDH平板和MMH平板测定表形。将所获得野生型菌落，用MGYH培养基，28-30℃，250-300rpm振荡培养，直到A600＝2-6，离心收集细胞，并用MMH培养基重悬细胞，用纯甲醇至终浓度0.5％进行诱导。离心收集菌体，用缓冲液(50mM sodium phosphate，PH7.4，1mM PMSF，1mM EDTA，5％glycerol)悬浮，用His-纯化体系纯化目的蛋白，获得融合蛋白ORF23，融合蛋白经ELISA，Western-blot等鉴定，为HEV特异性抗原。融合蛋白ORF23可作为抗原用于HEV诊断试剂盒的制备，也可用于预防戊型病毒性肝炎的多肽疫苗的制备。
实施例3嵌合基因疫苗的构建及免疫小鼠实验用BamHI/XhoI双酶解，从重组质粒pet28-ORF23中切下HEV ORF23基因片段，再插入到pcDNA3质粒中，获得重组质粒pcDNA3-ORF23(见附图1、附图5)。重组质粒作为嵌合基因疫苗免疫Blab/C小鼠，免疫途径为肌肉注射，注射剂量为100ug和200ug，隔3周1次，共注射2次。每次注射后2周取小鼠血清检测抗体，末次注射后检测小鼠的T细胞增殖反应。结果发现经2次免疫后，小鼠均产生HEV特异性抗体，并产生明显的T细胞增殖反应。说明重组质粒可作为HEV嵌合基因疫苗。
权利要求
1.一种戊型肝炎病毒(HEV)嵌合基因疫苗，其特征是它同时含有编码HEV开放读码框2蛋白(ORF2)基因和开放读码框3蛋白(ORF3)基因。
2.根据权利要求1所述的基因疫苗，其特征是它含有HEV ORF2基因。
3.根据权利要求2所述的基因疫苗，其特征是该基因的核苷酸序列为HEV ORF2。
4.根据权利要求1所述的基因疫苗，其特征是它含有HEV ORF3基因。
5.根据权利要求4所述的基因疫苗，其特征是该基因的核苷酸序列为HEVORF3。
6.根据权利要求1所述的基因疫苗，其特征是HEV ORF2基因和HEV ORF3基因组成一个嵌合基因ORF23。
7.根据权利要求6所述的基因疫苗，其特征是该基因的核苷酸序列为HEVORF23。
8.根据权利要求6所述的嵌合基因，其特征在于它可编码HEV ORF2和ORF3融合蛋白。
9.根据权利要求6所述的HEV嵌合基因，其特征在于它可插入到各类表达载体中，构成表达重组质粒，并可表达出HEV ORF2和ORF3融合蛋白。
全文摘要
本发明涉及生物医药技术领域，是一种预防戊型肝炎病毒感染的嵌合基因疫苗。它是一种含戊型肝炎病毒开放读码框2(ORF2)和开放读码框3(ORF3)嵌合基因的真核表达重组质粒。该基因疫苗可诱导机体产生特异性细胞和体液免疫，用于预防戊型病毒性肝炎。
文档编号A61K48/00GK1539504SQ0311686
公开日2004年10月27日 申请日期2003年5月9日 优先权日2003年5月9日
发明者陈勇, 洪艳, 杨连华, 经络, 蒋骏航, 王怡婷, 凌志强, 陈 勇 申请人:浙江省医学科学院