编码tc嵌合型核心蛋白的乙肝病毒基因真核表达载体及其构建方法
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，具体涉及编码含TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒基因真核表达载体及其构建方法。编码TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒基因真核表达载体，所述真核表达载体命名为pcHBV1.3-TC，所述真核表达载体以pcDNA3.1+为基本骨架，所述的乙肝病毒真核表达载体含有1.3倍乙肝病毒基因，所述的1.3倍乙肝病毒基因上还同时含有TC标签。pcHBV1.3-TC可稳定结合在宿主细胞基因组形成稳定表达的细胞，便于研究乙肝病毒的整个生命周期过程。
【专利说明】编码TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒基因真核表达载体及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，具体涉及编码含TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒基因真核表达载体的构建。
【背景技术】
[0002]乙型肝炎病毒(h印atitis B virus, HBV)是一种含有双链DNA的小包膜病毒，可以感染肝细胞，引起急慢性肝炎，最终导致肝硬化和肝细胞癌。HBV病毒体为双层壳样颗粒，直径40nm到42nm。病毒体的外层脂质蛋白包膜中含有三种相关的包膜糖蛋白。而在病毒体的外膜内，则是一个由核心蛋白(21kD)组成的正20面体状核心颗粒，直径为34nm。核心颗粒中包含有病毒DNA聚合酶和病毒DNA基因组。除了病毒体颗粒以外，感染了 HBV的细胞还分泌两种不同的亚病毒颗粒:17~25nm球型和管型的HBsAg颗粒。这些HBsAg颗粒只包含病毒的包膜蛋白和宿主细胞来源的脂质。
[0003]HBV的复制和蛋白合成机制已经被基本阐明，但是HBV生命周期中的动态过程，如病毒的入胞、胞内的转运以及出胞等方面的研究仍然不足。目前对人HBV分子生物学的描述和理解，均是通过对鸭乙肝病毒、树駒乙肝病毒等其他嗜肝病毒进行研究的，而且多数是借助生物化学和分子生物学的方法分析感染细胞的裂解物或通过免疫学方法和电子显微镜检测被固定细胞样本中的病毒颗粒，显然这些应用死细胞的研究方法都不能充分反映HBV生命周期中真实的动态过程，直接在活细胞中观察HBV生命周期中的动态过程则是一种更为形象、真实、直观的反映HBV在细胞中的天然过程，HBV的标记则是观察其在活细胞内动态过程的瓶颈。
[0004]迄今为止,病毒一般都是应用绿色突光蛋白(green fluorescent protein, GFP)进行标记的，组装成的重组病 毒将带上荧光标记，从而能够被示踪，进而可以直接在活细胞中观察并研究病毒的生命周期。近年来，GFP已经成功地用于标记艾滋病病毒(HIV-1)、腺相关病毒(AVV)以及疱疹病毒(HSV)等多种病毒。然而由于HBV病毒体积小而且空间利用率高，没有足够的内部空间容纳含有238个氨基酸的GFP的嵌入。至今尚无人乙肝病毒的标记技术并在活细胞中示踪并对其生命周期进行研究的报道。
[0005]林园园在07年用含四个半胱氨酸(tetracysteine, TC)的标签插入到乙肝病毒核心蛋白的77~78位氨基酸之间，构建了带TC标签的原核质粒载体pTHBVl.3-TC，这个TC标签是由六个氨基酸组成，其中四个半胱氨酸形成发夹样结构，如C-C-P-G-C-C，该发夹结构与双砷染料特异性的结合发出荧光。
[0006]pTHBVl.3是原核质粒载体pBR322通过脂质体在体外和质粒形成复合物，导入细胞后进行瞬时表达。由于这种瞬时表达的质粒在真核细胞不能扩增，并不断被降解，在一定的时间后就会消失。因此，没有观察到完整的乙肝病毒Dane颗粒。
[0007]我们现在用真核载体pcDNA3.1+来代替原核载体，用酶切连接的方法将质粒整合进入细胞的基因组，通过质粒上所携带的筛选标记进行G418筛选，得到稳定表达带有TC标签的乙肝病毒细胞克隆。
【发明内容】
[0008]本发明的目的旨在填补乙肝病毒标记技术的空白，提供编码TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒基因真核表达载体及其构建方法，解决了不能动态观察乙肝病毒入胞以及胞内运输的问题。
[0009]为实现上述目的，本发明所设计的编码TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒基因真核表达载体，所述真核表达载体命名为pcHBVl.3-TC，所述真核表达载体以pcDNA3.1+为基本骨架，所述的乙肝病毒真核表达载体含有1.3倍乙肝病毒基因，所述的1.3倍乙肝病毒基因上还同时含有TC标签。其中，将真核表达载体pcHBVl.3，命名为大肠杆菌DH5 α /pcHBVl.3Escherichia coil DH5 a/pcHBVl.3，于 2013 年 11 月 22 日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC);保藏地址为:武汉大学，其保藏号为CCTCC NO:M2013590。
[0010]进一步地，所述真核表达载体为:
[0011]真核表达载体pcHBVl.3-TC-1，其中，在1.3倍乙肝病毒基因上第759个碱基后插入TC标签，或；
[0012]真核表达载体pcHBVl.3-TC-2，其中，在1.3倍乙肝病毒基因上第906个碱基后插入TC标签，或； [0013]真核表达载体pcHBVl.3-TC-3，其中，在1.3倍乙肝病毒基因上第990个碱基后插入TC标签，或；
[0014]真核表达载体pcHBVl.3-TC-4，其中，在1.3倍乙肝病毒基因上第1218个碱基后插入TC标签。
[0015]本发明还提供了一种构建所述的编码TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒基因真核表达载体的方法，包括步骤如下:
[0016]1)1.3倍乙肝病毒基因的获得
[0017]以含1.3倍乙肝病毒基因的环形载体质粒pTHBVl.3为模板设计引物，扩增pTHBVl.3质粒上从5675位点顺时针方向扩增到3270位点的片段，得到1.3倍乙肝病毒基因片段；
[0018]2) 1.3倍乙肝病毒基因真核表达载体的构建
[0019]根据酶切位点分析，结合pcDNA3.1+真核表达载体的限制性酶切位点图谱，选用HindIII和NotI两个限制性内切酶对1.3倍乙肝病毒基因和pcDNA3.1+真核表达载体进行双酶切，分别回收酶切的片段，用T4DNA连接酶进行连接，转化感受态细胞，酶切鉴定，载体命名为pcHBVl.3 ；
[0020]3) pcHBVl.3-TC真核表达载体的构建
[0021 ] 利用SOE-PCR技术，设计引物并将TC标签设计入引物内，进行PCR，得到编码TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒真核表达载体，命名为pcHBVl.3-TC。
[0022]本发明的优点如下:
[0023]UTC标签是一个仅含6个氨基酸的插入片段，并且与之结合的双砷染料的分子量也仅为545.38，相当于5个氨基酸。因此，结合了双砷染料的TC嵌合型核心蛋白同野生型核心蛋白具有相近的大小，TC标签可以装配入成熟的HBV病毒体中，作为遗传物质随着细胞的分裂分配到子代细胞中。
[0024]2、TC标签分别插入在乙肝病毒核心蛋白的第2位、第49位、第79位、第155位氨基酸后面，这几个位点是临床上乙肝病毒常见的突变位点，不会引起病毒抗原性以及基因组复制完整性的改变。
[0025]3,pcHBVl.3-TC的细胞和!fepG2细胞的一般生物学特性一致，具有典型的上皮样形态，可以无限传代培养。
[0026]4、pcHBVl.3_TC可稳定结合在宿主细胞基因组形成稳定表达的细胞，便于研究乙肝病毒的整个生命周期过程。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1为pTHBVl.3的载体示意图；
[0028]图2为pcDNA3.1+的载体示意图；
[0029]图3为pcHBVl.3-TC载体示意图；
[0030]图4为pcHBVl.3-TC-1的质粒双酶切电泳图。
【具体实施方式】
[0031]为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
[0032]实施例1
[0033]1、获得1.3倍乙肝病毒基因
[0034]I)设计引物，如下:
[0035]引物如下:
[0036]
【权利要求】
1.编码TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒基因真核表达载体，其特征在于:所述真核表达载体命名为pcHBVl.3-TC，所述真核表达载体以PCDNA3.1+为基本骨架，所述的乙肝病毒真核表达载体含有1.3倍乙肝病毒基因，所述的1.3倍乙肝病毒基因上还同时含有TC标签。
2.根据权利要求1所述的编码TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒基因真核表达载体，其特征在于:所述真核表达载体为: 真核表达载体pcHBVl.3-TC-1，其中，在1.3倍乙肝病毒基因上第759个碱基后插入TC标签，或； 真核表达载体pcHBVl.3-TC-2，其中，在1.3倍乙肝病毒基因上第906个碱基后插入TC标签，或； 真核表达载体pcHBVl.3-TC-3，其中，在1.3倍乙肝病毒基因上第990个碱基后插入TC标签，或； 真核表达载体pcHBVl.3-TC-4，其中，在1.3倍乙肝病毒基因上第1218个碱基后插入TC标签。
3.构建权利要求1所述的编码TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒基因真核表达载体的方法，包括步骤如下: 1)1.3倍乙肝病毒基因的获得 以含1.3倍乙肝病毒基因的环形载体质粒pTHBVl.3为模板设计引物，扩增pTHBVl.3质粒上从5675位点顺时针方向到3270位点的片段，得到1.3倍乙肝病毒基因片段； 2)1.3倍乙肝病毒基`因真核表达载体的构建 根据酶切位点分析，结合PCDNA3.1+真核表达载体的限制性酶切位点图谱，选用HindIII和NotI两个限制性内切酶对1.3倍乙肝病毒基因和pcDNA3.1+真核表达载体进行双酶切，分别回收酶切的片段，用T4DNA连接酶进行连接，转化感受态细胞，酶切鉴定，载体命名为pcHBVl.3 ； 3)pcHBVl.3-TC真核表达载体的构建 利用SOE-PCR技术，设计引物并将TC标签设计入引物内，进行PCR，得到编码TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒真核表达载体，命名为pcHBVl.3-TC。
【文档编号】C12N15/79GK103805628SQ201310655349
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2013年12月6日 优先权日:2013年12月6日
【发明者】林菊生, 孙淑珍, 廖家智, 闫静君, 何星星, 常莹, 田德安, 赵秋, 但自立 申请人:华中科技大学同济医学院附属同济医院