基于str基因标志用于鉴定供者dna嵌合比率的pcr引物、试剂盒及其应用以及嵌合体的检 ...的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于STR基因标志鉴定供者DNA嵌合比率的PCR引物、试剂盒及其应用以及嵌合体的检测方法，其检测方法包括以下步骤：a)从样品中提取DNA作为模板；b)设定根据权利要求1中所述的PCR引物的退火温度，并对所述PCR引物进行标记；c)将标记的PCR引物进行PCR扩增，得到扩增产物；d)对所述扩增产物的片段大小进行分析，确定具有差异的基因标志。根据本发明实施例的嵌合体的检测方法，将PCR引物与荧光标记DNA片段分析技术有机结合，创出供受者区分率高、操作简捷快速、结果分析准确的整套嵌合率检测分析系统，该方法克服了传统方法中主观影响，分辨率高结果精确，且操作简单快捷，干净无毒。
【专利说明】基于STR基因标志用于鉴定供者DNA嵌合比率的PCR引物、试剂盒及其应用以及嵌合体的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，更具体地，涉及一种基于STR基因标志基于STR基因标志用于鉴定供者DNA嵌合比率供者嵌合比率的PCR引物、试剂盒及其应用的检测方法。
【背景技术】
[0002]目前，评价造血干细胞移植后的植入情况主要依赖供者嵌合率的检测，早期用以检测供者嵌合率的方法包括表型检测、性染色体核型分析、以及HLA分型等。这些方法对部分病例可获得客观植活的证明，但均有一定的应用限制。随着分子生物学的发展，应用PCR技术扩增并分析供受体的基因型，可方便快捷地进行个体识别。用以扩增分析的基因多态性分子标志包括限制性片段长度多态性(RFLP)、小卫星DNA(minisatellite DNA)，微卫星DNA(microsatellite DNA)等。其中微卫星DNA又称为短串联重复序列(short tandemrepeats, STR)，是由2~7bp为核心单位，多次重复并串联而成的DNA序列，具有高度的多态性。无关个体间12个STR位点完全相同的概率为10_14，同胞之间完全相同概率也仅为10_4。显然以STR作为鉴别不同个体DNA的基因标志，进行PCR扩增并结合片段分析可以定量监测移植患者体内供者细胞的动态变化，对临床具有重要的指导价值。
[0003]当前的嵌合体检测的主要方法仍 然是利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离供受者STR基因的扩增片段，利用凝胶成像仪测量片段光密度相对定量分析供者嵌合比例。该方法也是法医学利用基因标志鉴定个体身份的经典方法。但该方法操作复杂、耗时、主观误差明显、精确度低。常用的STR引物因退火温度不同在对供受者初步分型时必须使用不同的扩增程序，不能合理配置资源和时间。聚丙烯酰胺凝胶配制使用试剂较多，程序繁琐而且难以保证每次配制凝胶的品质相同。电泳过程耗时2-3小时，长时间的电泳产生热量会使凝胶因受热不均影响电泳质量。凝胶在染色过程中也会因每次使用的银染、定容试剂的差异，温度的变化导致背景的差异影响判断。由于聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率较高，扩增产生的非特异性条带常会对真实扩增条带产生巨大影响。光密度定量属于相对定量，误差较大。
【发明内容】
[0004]本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种基于STR基因标志用于鉴定供者DNA嵌合比率的PCR引物，所述PCR引物的基因序列包括:
[0005]D5F(SEQ ID N0.1), D5R(SEQ ID N0.2)；
[0006]D7F(SEQ ID N0.3), D7R(SEQ ID N0.4)；
[0007]D8F (SEQ ID N0.5), D8R(SEQ ID N0.6)；
[0008]TF (SEQ ID N0.7)，TR (SEQ ID N0.8)；
[0009]FF (SEQ ID N0.9)，FR (SEQ ID N0.10)；
[0010]D13F(SEQ ID N0.11), D13R(SEQ ID N0.12)；[0011]SRYF (SEQ ID N0.13)，SRYR (SEQ ID N0.14)；
[0012]D16F(SEQ ID N0.15), D16R(SEQ ID N0.16)；
[0013]D18F(SEQ ID N0.17)，D18R(SEQ ID N0.18)。
[0014]本发明还提供了一种基于STR基因标志用于鉴定供者DNA嵌合比率的PCR引物在检测嵌合体中的应用。
[0015]本发明保护了一种基于STR基因标志用于鉴定供者DNA嵌合比率的试剂盒，具体地，所述试剂盒含有根据上述实施例所述的PCR引物。
[0016]本发明还提供了一种基于STR基因标志用于鉴定供者DNA嵌合比率的试剂盒在检测嵌合体中的应用。
[0017]本发明提供了一种嵌合体的检测方法，包括以下步骤:a)从样品中提取DNA作为模板山)设定根据权利要求1中所述的PCR引物的退火温度，并对所述PCR引物进行标记；
c)将标记的PCR引物进行PCR扩增，得到扩增产物；d)对所述扩增产物的片段大小进行分析，确定具有差异的基因标志。
[0018]根据本发明实施例的嵌合体的检测方法，
[0019]另外，根据本发明上述实施例的嵌合体的检测方法，还可以具有如下附加的技术特征:
[0020]根据本发明的一个实施例，在所述步骤b)中，所述标记为FAM荧光标记。
[0021]根据本发明的一个实施例，所述FAM荧光标记在所述PCR引物的5’端进行标记。
[0022]根据本发明的一个实施例，所述PCR的扩增条件为:95 V 5min ；95 V 30s,60°C 25s，72。。30s，共 30 个循环；72°C 延伸 4min。
[0023]根据本发明的一个实施例，在步骤d)中，对所述扩增产物的基因标志片段进行分析的方法采用全自动毛细管电泳。
[0024]根据本发明实施例的嵌合体的检测方法，将PCR引物与荧光标记基因片段分析技术有机结合，创出供受者区分率高、操作简捷快速、结果分析简单准确的整套嵌合率检测分析系统。根据本发明实施例的嵌合体的检测方法，操作简单快捷，干净无毒，并且分辨率高、结果精确、客观。
[0025]具体而言，根据本发明实施例PCR引物的与现有的引物序列相比，退火温度统一，扩增延伸时间均大幅度缩短。根据本发明实施例的嵌合体的检测方法与传统的操作方法相t匕，由于摒弃了配制聚丙烯酰胺凝胶及电泳、银染成像的过程，使得整个检测过程更加简单快速，容易操作。
[0026]根据本发明实施例的嵌合体的检测方法，由于不必再使用有毒的试剂配制凝胶，不必为成像进行银染显像，使得有毒试剂的使用大大减少，保护了操作者及操作环境的安
全，干净无毒。
[0027]采用荧光标记基因片段分析技术分辨率可以达到I个碱基差异，与同样具有相同分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术相比，由于后者受限于背景噪音、非特异扩增及技术人员的主观因素使得前者较凝胶成像方法有更好的重复性和更高的准确度。
[0028]根据本发明实施例的嵌合体的检测方法，相比于凝胶成像方法操作程序及结果分析的复杂， 该方法具有更好的可操作性，普通技术人员经过简单的培训即可进行操作并分析结果。[0029]传统的对于凝胶成像方法的结果分析最大的缺点是会因分析人员的不同而发生变化，甚至相同人员不同时间得出的结果都有可能不同。而荧光片段分析因其结果由仪器在扫描同时计算得出，其结果不会因分析人员的不同而发生变化，因此，其检测结果更为客观、准确。
[0030]本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中:图1是根据本发明实施例的受者D13基因位点扩增片段扫描图；
[0032]图2是根据本发明实施例的供者D13基因位点扩增片段扫描图；
[0033]图3是根据本发明实施例的移植后受者D13基因位点扩增片段扫描图；
[0034]图4是根据传统检测方法得到的基因位点凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0035]下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的 ，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0036]下面结合具体实施例描述根据本发明的嵌合体的检测方法。
[0037]一、实验方法:
[0038]1、从样品中提取DNA作为模板(利用英俊公司DNA提取试剂盒提取供受者DNA标本)。
[0039]2、PCR引物标记:重新设计引物统一不同基因标志引物的退火温度，并在PCR引物的5’端标记FAM荧光。
[0040]3、将标记的PCR弓丨物进行PCR扩增，得到扩增产物。
[0041]4、对所述扩增产物的基因标志片段进行分析，确定具有差异的基因标志。
[0042]二、PCR的反应体系
[0043]所述PCR的反应体系为:
[0044]
2X Premix (英俊公司) 12.5 μ I
标记引物上游ΙμL 10 μ M
引物下游ΙμL 10 μΜ
双蒸水9.5 μ I
DNA 样本IOOng I μ I。
[0045]三、PCR的扩增条件
[0046]PCR 的扩增条件为:95°C 5min ；95°C 30s，60。。25s，72。。30s，共 30 个循环；72°C延伸 4min。
[0047]采用全自动毛细管电泳的具体方法为:取PCR扩增产物1.5 μ I或Ladderl μ I加入21 μ I上样液(去离子甲烯胺20 μ 1+Rox500内标1.0 μ I)，95°C变性5分钟后立即冰浴至少 5 分钟，ABI310 遗传分析仪米用 P0P4 (Perforance Optimized Polymer 4)胶及 36cm长毛细管进行全自动毛细管电泳及片段分析。
[0048]四、实验结果
[0049]通过仪器自带软件作图，通过片段大小判断并明确供受者有区别基因型，实验结果如图1至图4所示，其中，图1表示受者D13基因位点扩增片段扫描图，D13两等位基因扩增片段大小相差4个碱基；图2表示供者D13基因位点扩增片段扫描，D13两等位基因扩增片段大小相差8个碱基；图3表示移植后受者D13基因位点扩增片段扫描图显示为混合嵌合。图4为某患者各基因位点凝胶电泳图，非特异扩增多，供受者区分主观因素影响大，精确度低。
[0050]五、结果分析 [0051]通过上述实施例以及图1至图3的结果可以看出，根据本发明实施例的嵌合体的检测方法，将PCR引物与荧光标记基因片段分析技术有机结合，创出供受者区分率高、操作简捷快速、结果分析简单准确的整套嵌合率检测分析系统。根据本发明实施例的嵌合体的检测方法，操作简单快捷，干净无毒，并且分辨率高、结果精确、客观。
[0052]在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0053]尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
【权利要求】
1.一种基于STR基因标志鉴定供者DNA嵌合比率基于STR基因标志用于鉴定供者DNA嵌合比率的PCR引物，其特征在于，所述PCR引物的基因序列包括:
D5F(SEQ ID N0.1)，D5R(SEQ ID N0.2)；
D7F(SEQ ID N0.3)，D7R(SEQ ID N0.4)；
D8F (SEQ ID N0.5)，D8R(SEQ ID N0.6)；
TF (SEQ ID N0.7)，TR (SEQ ID N0.8)；
FF (SEQ ID N0.9)，FR (SEQ ID N0.10)；
D13F(SEQ ID N0.11), D13R(SEQ ID N0.12)；
SRYF(SEQ ID N0.13)，SRYR(SEQ ID N0.14)；
D16F(SEQ ID N0.15), D16R(SEQ ID N0.16)；
D18F(SEQ ID N0.17)，D18R(SEQ ID N0.18)。
2.根据权利要求1所述的基于STR基因标志鉴定供者DNA嵌合比率基于STR基因标志用于鉴定供者DNA嵌合比率的PCR引物在检测嵌合体中的应用。
3.一种基于STR基因标志用于鉴定供者DNA嵌合比率的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的PCR引物。
4.根据权利要求3所述的基于STR基因标志用于鉴定供者DNA嵌合比率的试剂盒在检测嵌合体中的应用。
5.一种嵌合体的检测方法，其特征在于，包括以下步骤: a)从样品中提取DNA作为模板； b)设定根据权利要求1中所述的PCR引物的退火温度，并对所述PCR引物进行标记； c)将标记的PCR引物进行PCR扩增，得到扩增产物； d)对所述扩增产物的片段大小进行分析，确定具有差异的基因标志。
6.根据权利要求5所述的嵌合体的检测方法，其特征在于，在所述步骤b)中，所述标记为FAM突光标记。
7.根据权利要求6所述的嵌合体的检测方法，其特征在于，所述FAM荧光标记在所述PCR引物的5’端进行标记。
8.根据权利要求5所述的嵌合体的检测方法，其特征在于，所述PCR的扩增条件为:.950C 5min ；95°C 30s, 60°C 25s，72°C 30s，共 30 个循环；72°C延伸 4min。
9.根据权利要求5所述的嵌合体的检测方法，其特征在于，在步骤d)中，对所述扩增产物的基因标志片段进行分析的方法采用全自动毛细管电泳。
【文档编号】C12Q1/68GK104004820SQ201310060981
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2013年2月27日 优先权日:2013年2月27日
【发明者】艾辉胜, 孙学东 申请人:北京纽赛尔生物科技有限公司