一种利用its序列鉴定当归及其混伪品的方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用ITS序列鉴定当归及其混伪品的方法。包括以下步骤：1）中药当归及其混伪品总DNA的提取；2）以步骤1）中提取的DNA为模板，使用SEQ?ID?NO.1和2所示引物进行PCR扩增反应；3）PCR产物直接测序；4）序列拼接、对比，建立NJ树，鉴别中药当归及其混伪品。本发明首次运用ITS序列鉴别中药当归及其混伪品，该方法操作简便、结果显著、实用性强，可以快速、准确的鉴别开中当归及其混伪品，适于广泛推广应用。
【专利说明】—种利用ITS序列鉴定当归及其混伪品的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及中药材来源品种鉴定【技术领域】，具体地，涉及一种利用ITS序列鉴定当归及其混伪品的方法。
【背景技术】
[0002]当归，2010版药典记载为伞形科植物当归(Angelica sinensis (Oliv.) Diels.)的干燥根，具有补血活血，调经止痛，润肠通便。用于血虚萎黄，眩晕心悸，月经不调，经闭痛经，虚寒腹痛，风湿痹痛，跌扑损伤，痈疽疮疡，肠燥便秘的功效。现代药理也研究表明，当归在促进造血与抗贫血、抑制血小板聚集、抗血栓、抗凝血、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、提高免疫因子活性、神经保护和修复，以及对心脑血管系统的保护都能起到重要的作用。
[0003]当归为常用中药材，在临床方面有广泛的用途。当归属物种分布广泛，种类繁多，但由于临床需求量大，经常出现供不应求的状况。市场上关于当归的混伪品主要有重齿毛当归、土当归、藁本、紫花前胡等，其形态类似，参杂在正品当归中很难鉴别。条形码技术是一种分子鉴定技术，它利用一段特定的DNA片段，即可实现物种间的鉴别。本发明以ITS序列为条形码，运用生物信息学的方法准确鉴别中药当归及其混伪品，为条形码技术在中药鉴定中的应用提供理论基础。
【发明内容】
[0004]本发明目的是提供一种利用ITS序列鉴别中药当归及其混伪品的分子鉴定方法。
[0005]具体步骤如下:1)中药当归及其混伪品总DNA的提取；2)以步骤I)中提取的DNA为模板，使用ITS4R和ITS5F引物进行PCR扩增反应；3) PCR产物直接测序；4)序列拼接、对比，建立NeighborJoining Tree (NJ树),鉴别中药当归及其混伪品。
[0006]其中，PCR反应体系以25 μ I计为:
[0007]ddH20:8.5 μ I
[0008]2XTaq PCR Mix: 12.5μ I
[0009]ITS4R/5F 引物:1/1 μ I
[0010]DNA 模板:2μ1
[0011]pCR 反应条件为:94 °C 5min ；94 °C lmin、50 °C lmin、72 °C 1.5min+3s/cycle,30cycles ；72°C 7min ；
[0012]建立NJ树后，可以看到当归与其混伪品分在不同的支上，通过观察NJ树，可以很明显的把中药当归与其混伪品鉴别开。
[0013]本发明首次运用ITS序列鉴别中药当归及其混伪品，该方法操作简便、结果显著、实用性强，可以快速、准确的鉴别开中当归及其混伪品，适于广泛推广应用。
[0014]本发明提取样品DNA、ITS序列-PCR扩增、测序，对序列进行拼接、比对，结合网络数据基于K2P模型对中药当归及其混伪品的ITS序列建立Neighbor-Joining Tree (NJ树)。通过对NJ树的分析，可以很好的鉴别开中药当归及其混伪品。【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为使用ITS 4R/5F引物PCR扩增当归及其混伪品的电泳检测图。其中，DG1-DG15为当归，D1-D6为独活，XJ1-XJ2为新疆藁本，ZH为紫花前胡，TDG1-TDG4为土当归，LGB1-LGB6 为辽藁本，XG1-XG8 为西归；QG1_QG16 为秦归，QH1-QH7 为羌活，M 为 DNA Marker,CK为空白阴性对照；
[0016]图2为基于K2P距离法建立中药当归及其混伪品Neighbor Joining Tree (NJ树)；样品编号同图1。
[0017]图3为市售中药当归10样品的ITS 4R/5F引物PCR扩增电泳检测图；
[0018]图4为基于K2P距离法建立市售当归样品Neighbor Joining Tree (NJ树);样品编号同图3。
[0019]图5为基于K2P距离法建立当归及其伪品GenBank数据库ITS序列的NeighborJoining Tree (NJ树),命名方式为样品编号+种拉丁名+ITS序列GenBank登录号。
【具体实施方式】
[0020]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0021]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 [0022]实施例1当归及其混伪品GenBank数据分析
[0023]从GenBank上下载当归及其混伪品ITS序列数据,运用生物信息学软件CodonCodeAligner和MEGA5进行对比分析,建立Neighbor Joining Tree (NJ树)，结果如图5所示，ITS序列可以很好的把当归及其混伪品分开；
[0024]实施例2运用ITS序列鉴别当归及其混伪品
[0025]1、样品来源
[0026]采用的当归及其混伪品包括当归、秦归、独活、辽藁本、新疆藁本、土当归、紫花前胡等，分别收集自甘肃、四川、云南、陕西、湖南、北京等地。紫花前胡(Peucedanumdecursiva(Miq.)Franch.&Sav.)> 土当 归(Levisticum officinale ff.D.J.Koch)>辽藁本(Ligusticum jeholense Nakai et Kitag.)、新疆藁本(Conioselinumvaginatum(Spreng.) Thell.)、重齿毛当归(Angelica pubescens Maxim, f.biserrata Shanet Yuan)。
[0027]2、DNA 提取
[0028]将上述样品，每个样品取约30mg，加入灭菌小钢珠，用磨样机磨成粉末，利用试剂盒法提取DNA。试剂盒购自TianGen公司，型号为植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)200preps。
[0029]3、PCR 扩增
[0030]引物:ITS4R:5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，；
[0031]ITS 5F:5，-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3，；
[0032]PCR反应体系以25 μ I计为:
[0033]ddH20:8.5 μ I[0034]2XTaq PCR Mix: 12.5μ I
[0035]ITS4R/5F 引物:1/1 μ I
[0036]DNA 模板:2 μ I
[0037]PCR 反应条件为:94 °C 5min ；94 °C lmin、50 °C lmin、72 °C 1.5min+3s/cycle,30cycles ；72°C 7min ；
[0038]4、测序
[0039]运用ABI3730测序仪对PCR产物进行直接测序。
[0040]5、序列拼接、比对、处理
[0041]运用生物信息学软件CodonCode Aligener进行序列拼接,MEGA 5进行序列比对、建立NJ树；
[0042]结果如图所示，图1为当归及其混伪品ITS序列PCR扩增电泳检测图，显示DNA扩增成功，可以测序；图2为基于K2P距离法建立的当归及其混伪品ITS序列NeighborJoining Tree (NJ树)，由图可明显看出当归与其混伪品都分在不同的支上,可以明显的鉴别开。
[0043]实施例3运用 ITS序列鉴别市售当归样品
[0044]1、样品来源
[0045]采用的10份当归样品搜集自从市场上销售的中药当归。
[0046]2、DNA 提取
[0047]将上述样品，每个样品取约30mg，加入灭菌小钢珠，用磨样机磨成粉末，利用试剂盒法提取DNA。试剂盒购自TianGen公司，型号为植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)200prepso
[0048]3、PCR 扩增
[0049]PCR反应体系以25 μ I计为:
[0050]ddH20:8.5 μ I
[0051]2XTaq PCR Mix: 12.5μ I
[0052]ITS4R/5F 引物: 1/1 μ I
[0053]DNA 模板:2 μ I
[0054]PCR 反应条件为:94 °C 5min ；94 °C lmin、50 °C lmin、72 °C 1.5min+3s/cycle,30cycles ；72°C 7min ；
[0055]4、测序
[0056]运用ABI3730测序仪对PCR产物进行直接测序。
[0057]5、序列拼接、比对、处理
[0058]运用生物信息学软件CodonCode Aligener进行序列拼接，MEGA5进行序列比对、建立NJ树；
[0059]结果如图所示，图3为市售当归样品ITS序列PCR扩增电泳检测图，显示DNA扩增成功，可以测序；图4为基于K2P距离法建立的市售当归样品ITS序列Neighbor JoiningTree (NJ树)，由图可看出，样品1、5、8单聚在一支，与其他样品分开，经鉴定样品1、5、8为重齿毛当归、土当归、藁本，其余样品为正品中药当归。由此可证明基于ITS序列可以准确的鉴别出中药当归及其混伪品。[0060]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以 对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1.一种鉴定当归及其混伪品的方法，包括以下步骤: 1)提取中药当归及其混伪品的总DNA；2)以步骤I)中提取的DNA为模板，使用SEQID N0.1和2所示引物进行PCR扩增反应； 3)PCR产物直接测序； 4)序列拼接、对比，建立NJ树，鉴别中药当归及其混伪品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR反应体系以25μ I计为: ddH20: 8.5 μ I 2XTaq PCR Mix:12.5μ I ITS4R/5F 引物:1/1 μ I DNA 模板:2 μ I。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR反应条件为:94°C5min；94°C lmin>50°C lmin>72°C 1.5min+3s/cycle, 30cycles ；72°C 7min。
4.权利要求1-3任一项所述方法在鉴定当归及其混伪品中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104004818SQ201310060181
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2013年2月26日 优先权日:2013年2月26日
【发明者】黄林芳, 郑司浩, 林余霖, 陈士林 申请人:中国医学科学院药用植物研究所