一种博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法
【专利摘要】本发明涉及生物医药【技术领域】，具体涉及一种博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法，该方法是通过培养SB9026(保藏号CCTCC?M2011292)发酵用菌株、选择合适的种子培养基和发酵培养基和培养条件，在此基础上，在发酵罐中对上述微生物发酵制备方法进行中试放大，通过对温度、转速、pH值控制及原料补充控制等调控手段来调试和建立放大规模的新型活性博莱霉素衍生物6’-脱羟基-BLM?S的微生物发酵制备工艺。该制备方法缩短6’-脱羟基-BLM?S的发酵制备周期，提高6’-脱羟基-BLM?S的发酵产率,同时增加了6’-脱羟基-BLM?S在总代谢产物中的比例，便于后继的分离提纯。本发明的博来霉素族衍生物其化学结构通式如说明书中所示。
【专利说明】一种博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药【技术领域】，具体涉及一种新型博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法。
【背景技术】
[0002]博莱霉素(Bleomycin，英文简字BLM)是20世纪60年代从轮枝链霉菌(Streptomyces verticillus)的发酵产物中分离发现的一类糖肽类抗肿瘤抗生素。目前已有十余种博莱霉素天然组分被发现，它们的结构仅在末端胺基上存在差异，其中主要成分为博莱霉素A2 (55%~70%)和博莱霉素B2 (25%~32%)。此外，包括泰莱霉素(Tallysomycin),佐伯霉素(Zorbamycin)和腐草霉素(Phleomycin)在内的天然产物与博莱霉素的结构和活性都极为相似，因此统称为博莱霉素族糖肽类抗肿瘤抗生素。
[0003]博莱霉素有独特的分子结构和生物活性，能够介导激活氧分子，并选择性地引起单链和双链DNA的断裂从而抑制肿瘤细胞DNA合成和复制。此外，博莱霉素还可以选择性地裂解RNA从而抑制蛋白质的合成。博莱霉素的活性机理决定了其不会抑制骨髓造血系统和免疫系统，因此对人体白细胞，机体免疫功能和造血系统等的副作用较为轻微。博莱霉素属于细胞周期非特异性药物，从上世纪80年代起被开发成为一种重要的有效抗肿瘤药物，在临床上广泛应用。以BLM A2和B2为主要成分的商品药Blenoxane?就被用于治疗睾丸癌，同时还广泛应用于霍奇金淋巴瘤、鳞状上皮细胞癌、生殖细胞瘤和其他肿瘤的治疗。但是博莱霉素能增加活性氧分子从而导致细胞的氧化压力，并诱导肺中的上皮和非上皮细胞的衰老和凋亡最终导致肺纤维化。目前博来霉素一般与其他抗肿瘤药物或辅助药物联合应用，以降低其毒性和获得更好的抗肿瘤效果。
[0004]佐伯霉素(Zorbamycin,英文简字ZBM)是由黄绿链霉菌(Streptomycesf lavoviridis)合成的博莱霉素族抗生素。佐伯霉素与博莱霉素在结构极为相似，主要差别在于佐伯霉素中的末端胺基支链不同，第一个噻唑啉/噻唑的氧化程度不同，多肽骨架中存在β -羟基化-L-缬氨酸和L-高丝氨酸结构部分，糖基部分为2-0- (3-0-氨基甲酰-甘露糖基)-6_脱氧-L-古洛糖(如式II所示)。相应的，在佐伯霉素生物合成基因簇(zbm)的40个开放阅读框(ORF)中，仅有22个显示出与对应的博莱霉素生物合成基因簇(blm)开放阅读框的同源性，其它开放阅读框的不同很可能导致了上述两种化合物的结构差异。
[0005] 博莱霉素自被发现后便因其强效的抗肿瘤活性迅速成为治疗多种肿瘤的特效化疗药物，近年来博莱霉素族抗生素在抗病毒研究中的应用，更加拓宽了其应用范围。但是博莱霉素导致的剂量依赖性肺纤维化以及一些肿瘤细胞逐渐形成的耐药性极大地限制了其临床应用和推广。因此合成新型的高效低毒的博莱霉素族衍生物一直都是开发博莱霉素类抗肿瘤药物的关键和热点。虽然博莱霉素的化学全合成已经完成，但是通过传统化学修饰获取的少量博莱霉素衍生物并未展示出更好的活性或更低的毒性，同时博莱霉素及其复杂的分子结构也导致相关的合成过程繁琐且效率低下，无法满足临床研究的需要和工业化生产的应用。随着生物化学和分子生物学的快速发展，新兴的组合生物合成方法通过遗传操纵次代谢产物生物合成基因来获取目标天然产物衍生物，是一种非常有应用前景的高新技术。通过生物合成基因簇中蕴含的信息以及相关微生物的遗传操纵，组合生物合成技术可实现复杂结构的多功能团化合物的特定结构改变。另一方面，包括博莱霉素、泰莱霉素和佐伯霉素在内的几种博莱霉素族抗肿瘤抗生素的生物合成被大量研究，其相关生物合成基因簇已经被分别克隆、测序以及表征，这为我们通过组合生物合成技术来操纵这些生物合成器并获得具有更好抗肿瘤活性和更低毒性的新型博莱霉素衍生物提供了坚实的基础，也为最终的博莱霉素类新型抗肿瘤药物的开发提供了一条新颖高效的途径。
[0006]
【权利要求】
1.一种博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法，所述博来霉素族衍生物为6’-脱羟基-BLM S，其特征是，具体步骤为: 1)黄绿链霉菌SB9026的发酵培养: 将黄绿链霉菌SB9026菌株接种至种子培养基中培养，在25° C_35°C下培养1_3天；再取所述种子培养基转接到发酵培养基中培养，接种量为8%-12%，在25° C-35°C下培养9-10 天；所述种子培养基为:12g/L-17g/L 甘油、12g/L-17g/L 棉籽粉、2.5g/L_3.5g/L NaCl和4.5g/L-5.5g/L蛋白胨，其余为水，pH值为6.8-7.2 ;所述发酵培养基为:18g/L_22g/L 葡萄糖，12g/L-17g/L 可溶性淀粉，18g/L-22g/L 黄豆粉，4.5g/L_5.5g/L 酵母粉，0.08g/L-0.12g/L CuSO4.5Η20，0.48g/L_0.52g/L ZnSO4.7Η20 和 2.5g/L_3.5g/L CaCO3，其余为水，pH为6.8-7.2 ;其中黄绿链霉菌SB9026的保藏号为CCTCC M 2011292 ； 2)发酵罐发酵制备博来霉素族衍生物: 采取逐级放大的方式将所述发酵培养基转接至发酵罐中发酵培养；所述发酵罐培养时采取梯度降温模式，初始温度为32° C，当发酵罐培养至20-26小时降温至30°C ;当发酵罐培养至55-65小时时降温至28° C，继续发酵培养115-125小时；在发酵培养过程中对微生物的生长和次代谢产物的合成进行控制，同时通过在线监测PH值和溶氧值，使发酵液中残糖浓度维持在0.8g/L-l.2g/L，同时pH值维持在7.5以下，溶氧维持在40%_60%，发酵周期为6-12天；6’ -脱羟基-BLM S在发酵液中的产量达30mg/L以上。
2.根据权利要求1所述博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法，其特征是，在步骤O发酵培养之前先对黄绿链霉菌SB9026进行涂布培养，筛选高产菌株。
3.根据权利要求1或2所述博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法，其特征是，步骤I)为:将黄绿链霉菌SB9026菌株接种至种子培养基中培养，在30°C下培养2天；再取所述种子培养基转接到发酵培养基中培养，接种量为10%，在30° C下培养12天；所述种子培养基为:15gL甘油、15g/L棉籽粉、3g/L NaCl和5g/L蛋白胨，其余为水，pH值为7.0 ;所述发酵培养基为:20g/L葡萄糖，15g/L可溶性淀粉，20g/L黄豆粉，5g/L酵母粉，0.lg/LCuSO4.5Η20，0.5g/L ZnSO4.7H20 和 3g/L CaCO3，其余为水，pH 值为 7.0。
4.根据权利要求1或2所述博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法，其特征是，步骤2)中所述逐级放大的方式具体为:先将300 μ I黄绿链霉重组工程菌SB9026的孢子悬浮液接种到60ml种子培养基中进行第一级放大，在32° C下培养24小时后转至600ml发酵培养基中进行第二级放大，并在32° C再次培养24-36小时直至菌丝体密度达到肉眼可见密集程度；随后将所述600ml发酵培养基转接至装有6L发酵培养基的15L发酵罐中进行发酵培养。
5.根据权利要求1或2所述博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法，其特征是，步骤2)中发酵罐培养的具体方法为:当发酵罐的容积为12L-20L时，发酵罐开始培养时，初始温度为32° C ;初始pH值为6.8 ;设置发酵罐溶氧值与转速为联动状态，溶氧的下限值为30%，转速范围为210rpm-400rpm ;当发酵罐培养至20-26小时，设置发酵罐溶氧值与转速为联动状态，将培养温度降低至30° C ;当发酵罐培养至55-65小时，发酵液溶氧值跌至最低，转速在最高值运转，此时将培养温度进一步降低至28° C ;在发酵培养后期约115-125小时，发酵液溶氧值和PH值开始上升时，开始补加葡萄糖溶液，并实时测定发酵液中残留的还原糖浓度，通过调节补料的频率和速度以及葡萄糖溶液的浓度，使发酵液中残糖浓度维持在Ig/L，同时pH值维持在7.5以下，溶氧在40%-60% ;当发酵罐维持补充葡萄糖2_3天，溶氧和pH值开始进一步上升，此时整 个发酵周期结束。
【文档编号】C12R1/465GK104004804SQ201310059456
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2013年2月26日 优先权日:2013年2月26日
【发明者】段燕文, 沈奔, 朱湘成, 杨虎 申请人:长沙天赐生物医药科技有限公司, 长沙慈航药物研究所有限公司, 哈药慈航制药股份有限公司