专利名称：流感病毒纳米技术裂解工艺制造亚单位疫苗的方法
技术领域：
本发明涉及医用生物药品流感病毒疫苗，特别是流感病毒纳米技术裂解工艺制造亚单位疫苗的方法。
流感是甲、乙、丙三型流感病毒引起的急性呼吸道传染病。本病发病急，传播快，发病率高，具有一定的死亡率，在儿童和老弱患者中死亡率较高，给人类造成严重的社会和经济后果。至今人类尚无有效的治疗方法，唯一的方法就是接种流感疫苗进行预防，因此流感疫苗的研制具有十分重要的社会和经济效益。
目前，国际上流感病毒疫苗主要包括流感病毒灭活疫苗(纯化的，三价的全属毒粒灭活疫苗)；裂解疫苗；亚单位疫苗三种如
图1，三种流感病毒疫苗的结构所示。它们各有利弊，前者制备简单，但有时会引起不良反应；裂解的，可降低不良反应，但制备过程中需加和去除裂解剂；而后者安全性好，可对儿童进行免疫接种，但抗体应答效果差，同时造价高。
流感全病毒灭活疫苗于1941年在美国首次被批准使用。这种疫苗接种后，局部和全身反应都很强。本世纪60年代，超速离心机和层析色谱技术的应用，使毒粒纯化操作大大提高，制成了全毒粒疫苗。然而，儿童使用时仍可出现不良反应。以后又研制出裂解的纯化疫苗，不良反应大为减少，接着研制出多种化学裂解剂，如乙醚，3-N-丁基酸盐(Tri-N-butylphosphate)，聚山梨酸酯80(Polysorbate80)，脱氧胆酸钠(Sodium deoxy cholate)，三硝基甲苯X100(TritonX100)等，生产出了裂解疫苗。此种疫苗1968年在美国首次被批准使用。
本世纪70和80年代，在裂解疫苗的基础上，又研制出了毒粒亚单位和表面抗原(HA和NA)疫苗。英国在临床疫苗试用中，证实了免疫效果与裂解疫苗相同，并可用于儿童。80年英国首次批准使用，而后扩展到其它国家。
在实践中发现，毒粒亚单位和表面抗原疫苗接种后虽然不良反应有所减少，但其免疫原性都不如纯化的全毒粒疫苗，从而就开展了佐剂研究工作。从根本上讲裂解疫苗，亚单位疫苗的免疫原性目前还尚未完全解决。
本发明目的是针对现有技术不足。提供一种利用纳米技术裂解流感病毒的方法，取代化学试剂和去污剂制成亚单位疫苗，可以简便快速、安全可靠地满足工业化生产的需求。
流感病毒纳米技术裂解工艺制造亚单位疫苗的方法；单价全病毒悬液经检定合格后，置4-8℃冰箱中保存备用，防止冻融；将选定好的纳米对撞机放置于4-8℃无菌室中，接通电源，调节电压，选定10nm极超微粒子通道，用无菌超纯水冲洗容器和管道，分别或合并进行病毒单价悬液处理；处理完毕，冲洗干净容器和管道，对裂解后的流感病毒超微粒子再层析纯化，去除病毒核衣壳和基质蛋白，获得高度纯化的流感病毒表面抗原HA和NA亚单位。
纳米科学，是人们研究纳米尺度——即100纳米至0.1范围之内的物质所具有的特异现象和物异功能的科学，而纳米技术则是指此基础之上制造新材料、研究新工艺的方法和手段。纳米科学技术不是某一学科的延伸，也不是某一工艺产物，而是基础理论学科与当代高新技术的结晶。它以物理、化学的微观研究理论为基础，以当代精密仪器和先进的分析技术为手段，是一个内容广阔的多学科群。
纳米技术不仅是指它能制造超细粉末或纳米液体技术，它还泛指在扫描隧道显微镜下，直接观察和操纵单个原子和分子，按人们意愿组成需要的超微型器件。
(一)纳米尺度的定义纳米又称毫微米，符号为nm或mu，是1微米的千分之一。如果以我们日常生活中常用的单位“米”(m)(1m＝3市尺)作为主单位的话，纳米在长度单位中换算所处的位置如图2所示。
可见，1纳米等于10-9米(十亿分之一米)，是人类肉眼不能分辨出来的很小的长度单位。一般人类头发丝的直径在70微米左右，即为70000纳米。
组成自然界的最基本的单位是原子，它们的大小必须用埃这个单位来量度。而由原子构成的分子，则大小不等。一般有机小分子在几个纳米至几十纳米之间，与生命有关的生物分子则大得多。
(二)纳米技术裂解流感病毒的理论依据1、流感病毒的形态结构众所周知，甲、乙型流感病毒是有囊膜病毒，呈现多型性，常为球队型，直径为80-120nm。主要包括HA和NA以及M2三种蛋白。核衣壳呈现螺旋对称，直径9-15nm。RNA为单股负链。甲、乙型流感病毒的结构示意图(见图3)。
2、流感病毒主要多肽成分及其抗原性质(见图4)根据流感病毒各抗原成分的性质及分子量大小可以看出，其主要保护性抗原可分为HA和NA，亚单位的大小分别为70kDa，其颗粒直径在10nm以下。所以，我们选用10nm级对撞机对流感病毒进行技术处理，既保持其病毒的免疫原性，又能充分裂解病毒颗粒。用这种方法裂解的流感亚单位疫苗只含有浓缩和纯化的流感病毒外壳抗原即血凝毒和种经氨酸酶；而不含有病毒核酸及其他外来蛋白质。这就是我们用纳米技术处理流感病毒，制作亚单位疫苗的理论依据。
(三)纳米对撞机的选型及工作原理目前尚无国产纳米对撞机问世，从日本进口的纳米对撞机主要有两个型号LEH-2和PEH-1，(见图5)。我们选用LEH-2型纳米对撞机进行了中等规模的流感病毒亚单位疫苗生产，基本可以满足实际需要。如果进行较大规模的生产，可采用PEH-1型机。
纳米对撞机的基本工作原理是对对撞机中的单晶金刚石开了两个“X”通道，反应物和介质在2000个大气压驱动通过这两个“X”通道，在通道的交叉处瞬间被粉碎、分散和乳化。粉碎的粒度只有几个纳米，粒度小，粒度分布窄，而且粒度大小是可调控的。这与一般情况和一般能量下的反应显然不同，肯定会发生质的变化。
本发明创造是利用高新物理技术和生物技术处理流感病毒的方法。取代化学试剂和去污剂制成亚单位疫苗的一次革命。
三十年前，生物学就遇到了可见光仪器的局限问题。一般的光学显微镜由于分辨率不够不能对病毒进行观测。电子湿微镜虽然有很高的放大倍数，但是不能用于对活细胞的研究。而许多基本的生物学问题，必须在活的机体中去研究。
纳米技术的发展使上述问题有了解决的办法。在这个用埃或纳米作单位的范围中，病毒就好比是大象了。而原子就象是棋盘上的棋子，可以一个一个搬动。
纳米技术在生物学中的应用既可能在扫描隧道显微镜下，直接观察和操纵单个原子或分子，又可以粉碎生物材料，制造纳米粉末或液体。我们应用纳米技术处理流感全病毒(80-120nm)，裂解为10nm左右大小的颗粒，取代化学试剂和去污剂制成亚单位疫苗。实践证明是完全可以的。它不仅手段先进科学，方法简便快速，而且非常安全。表面抗原生物活性指标好。流感全病毒经纳米级裂解超微化后，颗粒小，表面积大。产物易纯化，收产率高，一般可提高抗原的免疫原性提高15-20％，影响安全的因素少，不残留任何化学物质，具有特殊的生物物理性能。
(一)纳米技术裂解流感病毒的电镜结果。(见图5)(二)纳米技术裂解(物理方法)与化学试剂裂解流感病毒灭活亚单位疫苗各项质控指标检测的比较。(见图6)由图6可看出化学方法裂解需要清除化学裂解剂，工艺复杂，影响安全因素多、疫苗免疫原性低；而纳米技术处理表面抗原活性指标高，而且技术先进，方法简使快捷，适于工业化生产，宜于普及推广。
本发明创造附图1为三种流感病毒疫苗的结构示意图；图2纳米长度换算单位图表；图3甲、乙型流感病毒的结构示意图；图4流感病毒主要多肽成分及其抗原性质图表；图5为纳米对撞机的型号与功能图表；图6纳米技术裂解流感病毒的电镜结果；图7纳米技术与化学裂解流感病毒亚单位疫苗各项质控指标、检测结果比较。
下面结合实施例具体描述本发明创造。
实施例11、按国家规定的质量标准和工艺生产出的合格流感三价灭活全病毒粒悬液取30ml。
2、将合格的流感三价病毒粒悬液，放入调试好的纳米对撞机，对流感病毒进行纳米处理，调节电压、压力、流量，使病县液裂解至10nm大小颗粒，以15分钟处理30ml，经纳米机处理后，再放入4-8℃冰箱内。
实施例21、按国家规定的流感病毒灭活疫苗生产方法进行收集单价病毒粒悬液约1000毫升作为中试样品。
2、选下中小型纳米对撞机，30分钟能处理1000毫升产样品，裂解病毒悬液颗粒均为10nm。
实施例31、流感病毒纳米技术裂解亚单位灭活疫苗产业化大规模生产，生产环境条件必须符合GMP要求，疫苗生产全程工艺及质量指标，必须按流感疫苗WHO规定要求进行，人员、技术、设备、工艺环境必须综合配套。
2、纳米对撞机需用大中型一流设备，每小时能处理流感三价病毒粒悬液15000ml以上，安置于生产流感病毒疫苗最佳工艺环节，一般固定不动，纳米对撞机每次处理流感三价病毒粒悬流技术参数不宜有变动，以确保量的稳定性。
本流感病毒灭活疫苗系由甲1、甲3及乙型流感病毒经纳米技术处理后纯化的病毒亚单位，经磷酸盐缓冲液稀释而成。每0.5ml含有血凝素甲1、甲3及乙型都在15μg以上。
经三价流感病素灭活疫苗免疫小白鼠后，血清中和试验证明疫苗免疫后血清对甲1、甲3及乙型流感病毒的中和指数分别达到1.6×105，2.5×105，1.6×105以上，以保证疫苗免疫效果。
流感病毒纳米裂解亚单位灭活疫苗再经皮下接种小白鼠，腹腔接种豚鼠，观察7天。全部小白鼠及豚鼠体重增加，健康存活，无任何异常表现。证明疫苗安全性及毒性试验合格。并经过敏原性检测，证明不存在有过敏原。
通过纳米技术裂解流感病毒粒悬液经实验室、中试，产业化等不同规模应用，证实既能有效裂解流感病毒，提抗高免疫原性，又不残留化学试剂，能显著缩短工艺时间，又简便价廉，很适合现代产业化生产。
权利要求
1.一种流感病毒纳米技术裂解工艺制造亚单位疫苗的方法，单价全病毒悬液经检定合格后，置4-8℃冰箱中保存备用，防止冻融；将选定好的纳米对撞机放置于4-8℃无菌室中，接通电源，调节电压，选定10nm级超微粒子通道，用无菌超纯水冲洗容器和管道，分别单价或三价并进行病毒悬液处理；处理完毕，冲洗干净容器和管道，对裂解后的流感病毒超微粒子再层析纯化，去除病毒核衣壳和基质蛋白，获得高度纯化的流感病毒表面抗原HA和NA亚单位。
2.根据权利要求1所述的流感病毒纳米技术裂解工艺制造亚单位疫苗的方法，按国家规定的质量标准和艺生产出的合格流感三价灭活全病毒粒悬液取30ml，放入微型纳米对挖机内，进行纳米技术处理，使流悬液裂解至10nm大小颗粒，以15分钟处理30ml，经纳米机处理后，再放入4-8℃冰箱内。
3.根据权利要求1所述的流感病毒纳米技术裂解工艺制造亚单位疫苗的方法，按家规定的流感病毒灭活疫苗生产方法进行收集单价病毒粒悬液约1000ml试样品；选定小型纳米对撞机，30分钟能处理1000ml裂解病毒悬液颗粒均为10nm。
全文摘要
流感病毒纳米技术裂解工艺制造亚单位疫苗的方法,将合格的流感病毒粒悬液,放入调试好的纳米对挖机,对流感病毒进行纳米技术处理,使病毒粒悬液裂解至10nm大小颗粒。是利用当代高压物理学与生物学技术结合的一种尝试,取代化学试剂和去污剂制成亚单位疫苗,可以简便快速、安全可靠地满足工业化生产的需求。
文档编号A61P31/16GK1269244SQ00110210
公开日2000年10月11日 申请日期2000年3月16日 优先权日2000年3月16日
发明者苟仕金, 苟鸿鹰, 王成余 申请人:辽宁天成生物制药研究所