专利名称：五味子乙素在制备治疗肿瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及五味子乙素的新用途，即五味子乙素在制备治疗肿瘤药物中的应用，尤其是五味子乙素在制备肿瘤细胞多药耐药性逆转剂药物和肿瘤化疗药物中的应用。
背景技术：
肿瘤是引起人类死亡的主要原因之一，肿瘤化疗是治疗肿瘤的一种主要手段。然而肿瘤化疗会因肿瘤细胞获得抗药性而失败。
《华北煤炭医学院学报》2001年3月第3卷第2期中由张慧珠等编著的《膜脂的流动性改变与肿瘤多药耐药逆转剂的研究进展》报导肿瘤细胞多药耐药(multidrugresistance，MDR)是其化疗失败的主要原因之一。MDR的产生机制复杂，除主要与ATP能量依赖性药物外排泵P-糖蛋白(pumpglycoprotein，P-gP)过度表达致药物外排增加，胞内药物浓度减少有关。
《药学进展》2002年第26卷第3期中胡振等编著的《肿瘤多药耐药逆转剂的研究进展》报导肿瘤细胞对化疗药物产生的多药耐药性(mul-tidrugresistance，MDR)是化疗失败的主要原因，因而应用MDR逆转剂是克服肿瘤临床耐药、提高化疗效果的一种潜在的重要手段。形成MDR的机制很复杂，目前认为可能有以下几种原因，细胞膜P-糖蛋白(permeabilityglycoprotein，P-gp)的过度表达是讨论最多原因之一。
1970年，Biedler等首次阐述了交叉耐药现象，后被称为多药耐药性。1976年，Juliano和Ling等发现，在已产生MDR的细胞膜上有一种高度表达的糖蛋白，其分子量为170kD，并发现该糖蛋白的表达水平和细胞膜的通透性、细胞内药物浓度以及耐药程度有关，故命名为P-糖蛋白(P-gp)。P-gp是ATP转运酶，它能将底物转运出细胞，起着能量依赖性外排泵的作用。而研究发现，化疗药物也可成为其底物。P-gp过度表达时，其转运药物的作用增强，从而使细胞毒药物在肿瘤细胞内的积累减少。这是MDR的可能机制，因此P-gp可以成为多种逆转剂的最终作用靶点。
目前在临床上使用的抗癌药如阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、长春新碱、高三尖杉酯、米脱蒽醌等药都逃脱不了肿瘤抗药性的命运，因为这些药物均为P-糖蛋白的底物。P-糖蛋白可将这些药物泵出抗药的肿瘤细胞。因此，当肿瘤细胞内P-糖蛋白高表达后，肿瘤细胞获得的抗药性并不仅仅对某一种抗癌药，而是对多种抗癌药。要使高表达P-糖蛋白的肿瘤细胞重新获得对抗癌药的敏感性，最有效的方法就是抑制P-糖蛋白的功能，使其不能发挥‘药泵’的功能。因此，研制抑制P-糖蛋白功能的药物对肿瘤的化疗有重要的意义。目前，临床上有很多种抗癌药，但没有一种针对P-糖蛋白的药物。因此，研制出这样一种药物刻不容缓。
胡振等编著的《肿瘤多药耐药逆转剂的研究进展》提及目前提出的一些有关逆转剂的假设作用机制有逆转剂通过与细胞毒药物竞争P-gp的同一结合位点而阻止药物外排；通过抑制蛋白激酶C，阻断P-gp的磷酸化而抑制MDR产生；通过药物-膜脂质相互作用改变细胞膜特性，影响P-gp构象及功能而逆转MDR等。一个好的P-gp逆转剂应符合以下几点(1)与对照药物相比，IC50降低；(2)化疗药物在肿瘤细胞中的逐渐恢复，最终达到有效浓度；(3)与P-gp具有较强的结合作用。
近年研制的与P-gp相互作用的MDR逆转剂。苯烷胺类衍生物钙拮抗剂维拉帕米是最早发现并具有较强逆转MDR活性的苯烷胺类衍生物。其对血管、心肌的钙拮抗活性与其MDR逆转作用无关，而与心血管系统副作用有关，其副作用严重妨碍临床应用。
五味子乙素(schisandrin B，Sch B)，主要来自于植物，如木兰科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.及木兰科植物华中五味子Schisandrasphenanthera Rehd.et Wils.，木兰科植物北五味子(Schisandra chinensis Baill)等都含有五味子乙素，也可人工合成，结构式如下
C.A.S61281-37-6；Benzo[3，4]cycloocta[1，2-f][1，3]benzodioxole，5，6，7，8-tetrahydro-1，2，3，13-tetramethoxy-6，7-dimethyl-，stereoisomer。
五味子乙素是中药五味子的有效成分之一，属联苯环辛烯类化合物。其显著的抗氧化活性已有报道(张铁梅，王宝恩，刘耕陶；五味子乙素对原代肝培养脂质过氧化的抗氧化作用[J]；中国药理学报；1989，10(4)；(353～355))。另外五味子乙素可明显促进肝细胞滑面内质网增生，具有抗肝毒性和解毒作用，对实验性肝损伤具有保护作用。王建华，李力更，李恩《五味子乙素对大鼠成骨细胞增殖分化的影响》报道五味子乙素体外能促进成骨细胞的增殖与分化；(天然产物研究与开发，2003年，第5期，446)，但还未有文献报道和专利公开表明五味子乙素在制备肿瘤药物中的有任何应用前景。
发明内容本发明的目的就是提供了一种对人体毒性小，肿瘤细胞多药耐药逆转剂五味子乙素，及在制备肿瘤细胞多药耐药性逆转剂药物和肿瘤化疗药物中的应用。
本发明采用的技术方案是五味子乙素在制备治疗肿瘤药物中的应用。五味子乙素应用于制备肿瘤细胞多药耐药逆转剂药物。所述的逆转剂药物还含有用于制备通过逆转肿瘤细胞多药耐药性起作用的抗肿瘤药物，及药物赋形剂或载体。
所述的抗肿瘤药物为P-gp(P-糖蛋白)的底物，如①紫杉醇、②阿霉素、③表阿霉素、④柔红霉素、⑤长春新碱、⑥高三尖杉酯、⑦米脱蒽醌、⑧羟基喜树碱等。
所述的逆转剂药物可按本领域已知方法制成下列肠道或非肠道组合药的剂型①注射液 ②片剂 ③胶囊剂 ④颗粒剂 ⑤缓释剂。
所述的逆转剂药物还可以含有其他逆转剂，以提高对肿瘤多药耐药逆转的药效。
五味子乙素在制备肿瘤细胞多药耐药性逆转剂药物中的应用，具体的体现在五味子乙素抑制肿瘤细胞内P-糖蛋白的功能。特别是五味子乙素竞争性结合P-糖蛋白，抑制MDR产生。五味子乙素还可以抑制多药耐药肿瘤细胞内P-糖蛋白基因的表达。
五味子乙素与抗肿瘤药同时使用时可促进抗肿瘤药诱导多药耐药肿瘤细胞的凋亡。
五味子乙素还可应用于制备临床肿瘤化疗药物。
本发明所述的五味子乙素在制备肿瘤药物中的应用的有益效果如下(1)具有临床应用前景，五味子乙素可有效逆转肿瘤的多药耐药性，该化合物作用于P-糖蛋白，可完全抑制P-糖蛋白的功能；(2)五味子乙素具有较低的毒性，但对某些肿瘤细胞有毒性，因此，五味子乙素具有很好的临床肿瘤化疗的应用前景。
图1为K562，K562/ADR，K562/VCR，KBV200的P-gp的表达量检测。
图2为不同浓度五味子乙素逆转K562/ADR、K562/VCR对DNR(柔红霉素)的抗药性。
图3为五味子乙素对七种细胞的毒性。
图4为五味子乙素对阿霉素在药敏细胞K562和MDR细胞K562/ADR细胞内的积聚的影响。K562+doxK562细胞与5μg/ml阿霉素；Adr+DoxK562/ADR与5μg/ml阿霉素；Adr+SchB(五味子乙素)+DoxK562/ADR与5μg/ml阿霉素和10μg/ml五味子乙素；Adr+Ver(维拉帕米)+doxK562/ADR与5μg/ml阿霉素和10μg/ml维拉帕米。
图5为FCM柔红霉素(DNR)在K562和K562/ADR中的细胞积聚。K562/ADRK5622μg/ml柔红霉素与K562温育；K562/ADR+DNR2μg/ml柔红霉素与K562/ADR温育；K562/ADR+SchB+DNR2μg/ml柔红霉素+10μg/ml五味子乙素与K562/ADR温育；K562/ADR+Ver(维拉帕米)+DNR2μg/ml柔红霉素+10μg/ml维拉帕米与K562/ADR温育。
图6为HPLC检测SchB和VER(维拉帕米)对K562/ADR细胞外排阿霉素的影响。
Ctrl组对照组，仅加培养液；VER(维拉帕米)组加6μg/ml的维拉帕米；SchB组加10μg/ml的五味子乙素。
图7为FCM检测10μg/ml五味子乙素影响罗丹明Rh-123在KBV200细胞中的积聚。
图8为柔红霉素在敏感细胞KB和耐药细胞KBV200中的不同分布。ADNR在KB细胞中分布；BDNR在KBV200细胞中分布。
图9为罗丹明Rh-123在药敏细胞KB(A)和抗药细胞KBV(B)细胞中的分布。
图10为五味子乙素和维拉帕米对KBV200细胞内柔红霉素分布影响。A1，A2分别为10μg/ml VER作用后放大100和200倍时DNR荧光图；B1，B2分别为5μg/ml SchB作用后放大100和200倍时DNR荧光图；C1，C2分别为10μg/mlSchB作用后放大100和200倍时DNR荧光图。
图11为SchB和VER(维拉帕米)对Rh123在KBV200中分布的影响；A为对照组，表示Rh123在KBV200中的分布；B为VER组，表示10μg/ml VER对Rh123在KBV200中的分布的影响；C为5μg/ml SchB组，表示5μg/ml SchB对Rh123分布的影响；D为10μg/ml SchB对Rh123分布影响。
图12为Hoechst 33342和PI联合染色观测KBV200和KB细胞在阿霉素单独或阿霉素和五味子乙素联合作用48h后的凋亡比率。
A对照组，无药物处理的KBV200组；B1μg/ml ADR(阿霉素)处理KBV200细胞组；C5μg/ml ADR处理KBV200组；D1μg/ml ADR和10μg/ml SchB联合处理的KBV200组；E5μg/ml ADR和10μg/ml SchB联合处理的KBV200组；F1μg/mlADR处理组KB细胞。
图13为KBV200在ADR或ADR和SchB联合作用下凋亡效果。
Ctrl为对照组；A1为1μg/ml ADR处理组；A55μg/ml ADR处理组；A1+S101μg/ml ADR和10μg/ml SchB联合处理组；A5+S10为5μg/ml和10μg/ml SchB联合处理组。
图14为五味子乙素下调MDR1基因的表达电泳成像图。MMarker(分子量标志)；Ctrl为不加SchB的对照组；S55μg/ml的SchB；S1515μg/ml的SchB。
图15为20μg/ml五味子乙素作用于K562/ADR和KBV200细胞48h后检测P-gp表达量。A)为K562/ADR对照组，表示没有SchB作用；B)为K562/ADR的处理组，表示20μg/ml SchB作用K562/ADR细胞48h；C)为KBV200对照组，无SchB作用；D)为KBV200处理组，表示20μg/ml SchB作用KBV200细胞48h。
图16为不同浓度的五味子乙素对3H-azidopine与P-gp的亲和成像的影响。C1没有加SchB(和Ver等逆转剂，同时也没有3H-azidopine的本底组；C2没有SchB(五味子乙素)和VER(维拉帕米)，但加10μl 3H-azidopine，作为阴性对照组；S1加1μg/ml SchB，同时加10μl 3H-azidopine组；S5加5μg/ml SchB，同时加10μl 3H-azidopine组；S10加10μg/ml SchB，同时加10μl 3H-azidopine组。
图17为用药后瘤体体积变化曲线。NS组为灌胃100μl生理盐水、尾静脉注射50μl生理盐水组；PT组为灌胃100μl PEG400和Tween20 9∶1混合液、尾静脉注射50μl生理盐水组；SchB组为灌胃100μl五味子乙素、尾静脉注射50μl生理盐水组；ADR组为灌胃100μl生理盐水、尾静脉注射50μl2.5mg/ml ADR组；ASB组为灌胃100μl 40mg/ml五味子乙素、尾静脉注射50μl2.5mg/ml ADR组。
图18为SchB和ADR联合治疗荷KBV200移植瘤小鼠后生命延长率。NS组为灌胃100μl生理盐水、尾静脉注射50μl生理盐水组；PT组为灌胃100μlPEG400和Tween20 9∶1混合液、尾静脉注射50μl生理盐水组；SchB组为灌胃100μl五味子乙素、尾静脉注射50μl生理盐水组；ADR组为灌胃100μl生理盐水、尾静脉注射50μl 2.5mg/ml阿霉素组；ASB组为灌胃100μl 40mg/ml五味子乙素、尾静脉注射50μl 2.5mg/ml阿霉素组。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述实施例1多药耐药细胞的P-糖蛋白(P-gp)检测(1)实验材料细胞株K562/ADR、/K562/VCR多药耐药细胞株为P-gp蛋白高表达为主要耐药机制，由浙江大学肿瘤研究所诱导建系，KBV200多药耐药细胞株为P-gp蛋白高表达为主要耐药机制，购自中国医学科学院血液研究所。
试剂P-gp的单克隆荧光标记抗体为美国BD公司R-PE-17F9。
仪器培养瓶，培养板，二氧化碳培养箱，FCM。
(2)实验方法细胞P-gp表达测定取对数生长期各株细胞，收集细胞制成1×106/ml的悬液，加入一抗(1∶400)，4℃避光反应45min，用加1％小牛血清的PBS洗3次后，加入二抗(1∶1000)，4℃避光反应30min，PBS洗三次，用PBS垂悬后，流式细胞仪检测细胞荧光强度。
(3)实验结果图1为K562，K562/ADR，K562/VCR，KBV200的P-gp(P-glycoprotein)的表达量检测，用FCM法，K562和其耐药细胞K562/ADR、K562/VCR，KBV200耐药细胞的P-gp表达量。A为K562细胞，P-gp表达为阴性，仅总细胞数的1.52％表达P-gp，每细胞荧光均值为2.49。BK562/ADR细胞的P-gp表达强阳性，其中占总数的67.72％细胞表达P-gp，每细胞荧光均值为136.45。C为K562/VCR细胞的P-gp表达为强阳性，其中占总数的67.98％细胞表达P-gp，每细胞荧光均值为196.37。D为KBV200细胞，其P-gp表达为76％，均值为69.38。
(4)结论K562/ADR，K562/VCR，KBV200为P-gp高表达的多药耐药细胞株。即P-gp为这些细胞多药耐药的主要原因。
实施例2五味子乙素的耐药逆转作用(1)实验材料细胞株K562/ADR、K562/VCR多药耐药细胞株为P-gp蛋白高表达为主要耐药机制，由浙江大学肿瘤研究所诱导建系，KBV200多药耐药细胞株为P-gp蛋白高表达为主要耐药机制，购自中国医学科学院血液研究所。
试剂化合物五味子乙素，溶于DMSO，配成1mg/ml作为母液，再以RPMI-1640配成工作液；以上试剂均购自中国药品与生物制品鉴定所。RPMI-1640培养基和小牛血清为美国Gibco产品；四甲基偶氮唑盐(MTT)四甲基偶氮脞盐(MTT)为Sigma公司产品，二甲基亚砜(dimethyl sufoxide，DMSO)为上海生工进口分装，注射用硫酸长春新碱(vincristine，VCR)为广州明光制药厂产品，注射用盐酸米托蒽醌(Mitoxantrone，Mx)为四川绵竹制药厂产品，注射用盐酸阿霉素(doxorubincin)为浙江海正药业股份有限公司产品，羟基喜树碱注射液(hydroxycamptothecine)为湖北黄石飞云制药有限公司产品，注射用紫杉醇(pacilitaxel)为济南瑞达宏科技有限公司产品，高三尖杉酯碱(homoharringtonine)为上海信宜药业有限公司产品，柔红霉素(daunomycin，DNR)是浙江海正药业有限公司产品，表阿霉素(epirubicin)为浙江海正药业有限公司产品，盐酸维拉帕米(verapamil)为上海禾峰制药有限公司产品。
仪器培养瓶，培养板，二氧化碳培养箱，酶标仪，FCM，高效液相色谱仪。
(2)实验方法细胞培养采用Gibco公司的RPMI-1640培养液进行培养，MDR细胞系中K562/ADR和K562/VCR耐药性分别以100ng/ml阿霉素和100ng/ml长春新碱维持，而KBV200以120ng/ml长春新碱维持。使用前，须停药一周后方用于实验。MTT检验取对数生长期细胞，K562/ADR和K562/VCR以1×105/ml，KBV200以5×104/ml分别接种于96孔培养板，100μl/孔。在37℃、5％CO2条件下培养过夜后，加不同浓度的SchB和化疗药共100μl，调零孔和对照组加相应体积的培养液，每组设4个平行孔，培养72h后，每孔加5mg/ml MTT 20μl(调零组除外)，再培养4h，去培养液，加DMSO 100μl/孔，待结晶Formazan完全溶解后，用酶联免疫仪在波长570nm处调零组调零后读取吸光度(A)值。取4孔A值的均数按公式计算细胞抑制率细胞抑制率(IR)＝[1-(实验孔A均值/对照孔A均值)]×100％。计算IR采用Origin 7.0数据处理软件用Sigmodel函数拟合求出半数抑制浓度(IC50)，每实验重复三次。
(3)实验结果实验数据如表1、表2所示。表中数据表明五味子乙素对抗药肿瘤细胞K562/ADR和K562/VCR有强的逆转作用。并且，五味子乙素逆转K562/ADR、K562/VCR对DNR(柔红霉素)的抗药性与五味子乙素的浓度呈正比，如图2所示。
表1.SchB(五味子乙素)(10μg/ml)对K562/ADR耐药逆转Drug Ctrl SchB RF Ver RF紫杉醇0.3423±0.13220.01913±0.020817.89 0.0143±0.009323.94阿霉素1.4175±0.24630.1691±0.0137 8.38 0.1324±0.008610.76米托蒽醌 0.1052±0.0356＜0.01 ＞10.52＜0.01＞10.52柔红霉素 0.5046±0.07280.0977±0.063 5.16 0.0791±0.03136.38长春新碱 0.9162±0.238 0.1486±0.0554 6.17 0.0872±0.023610.51表阿霉素 1.3196±0.32180.3033±0.0812 4.35 0.2218±0.09095.95高三尖杉酯0.4283±0.10790.0964±0.0312 4.44 0.0701±0.00426.03羟基喜树碱0.3688±0.08750.0417±0.062 8.84 0.0432±0.02058.53Ctr对照；SchB五味子乙素；RF耐药性的逆转倍数；Ver维拉帕米。
表2SchB(10μg/ml)对KBV200的耐药逆转Drug Ctrl Schb RF Ver RF
阿霉素0.3272±0.21310.0691±0.01374.74 0.0324±0.008610.11米托蒽醌 0.0906±0.0456＜0.01＞9.06 ＜0.01＞9.06柔红霉素 0.3046±0.07280.0913±0.003 3.34 0.0555±0.01755.49长春新碱 ＞20 0.1572±0.0946127.30.9872±0.015520.26表阿霉素 0.9876±0.15240.1033±0.05459.56 0.1226±0.08258.05高三尖杉酯0.5257±0.19870.1064±0.08124.94 0.1108±0.00764.74羟基喜树碱0.1618±0.15010.0527±0.06133.07 0.0468±0.02543.48紫杉醇0.0800±0.00790.0316±0.00192.85 0.0329±0.00792.70Ctr对照；SchB五味子乙素；RF耐药性的逆转倍数；Ver维拉帕米。
从表1和表2中可发现，SchB的逆转效果与VER近似，尤其是对VCR的逆转效果达100倍以上，是VER的5-6倍，说明SchB是一个有效的MDR逆转剂。
实施例3五味子乙素对多种细胞的毒性作用(1)实验材料细胞株和正常细胞K562、KB细胞为浙江大学肿瘤研究所提供；K562/ADR和K562/VCR多药耐药细胞株为P-gp蛋白高表达为主要耐药机制，由浙江大学肿瘤研究所诱导建系，对多药耐药细胞株为P-gp蛋白高表达为主要耐药机制等均有较强的抗药性；KBv200多药耐药细胞株为P-gp蛋白高表达为主要耐药机制，引自中国医学科学院药物研究所，对多种药物有交叉耐药性。
试剂化合物五味子乙素，溶于DMSO，配成1mg/ml作为母液，再以RPMI-1640配成工作液；购自中国药物与生物制品鉴定所。RPMI-1640培养基和小牛血清为Gibco产品；四甲基偶氮唑盐(MTT)为Sigma产品；仪器培养瓶，培养板，二氧化碳培养箱，酶标仪，FCM，高效液相色谱仪。
(2)实验方法
取对数生长期细胞，接种于96孔细胞培养板内，每孔20000个细胞，分组加入抗癌药和五味子乙素。放置于CO2培养箱中培养，48小时后做MTT实验。
(3)实验结果五味子乙素对七种细胞的毒性数据见图3。数据表明五味子乙素对MDR逆转的药效浓度范围内，对正常细胞，如人的成纤维细胞和淋巴细胞，无任何毒性。该化合物对人的肝和骨髓来源的非肿瘤细胞系也无毒性，但对肿瘤细胞系如人的红白血病和肝癌细胞系HepG2有较大的毒性。
实施例4五味子乙素对多药耐药细胞株细胞内药物浓度的集聚和外排(1)实验材料细胞株和正常细胞K562/ADR多药耐药细胞株为P-gp蛋白高表达为主要耐药机制，由浙江大学肿瘤研究所诱导建系，人口腔鳞癌多药耐药细胞株KBV200购自中国医学科学院血液研究所。。
试剂化合物五味子乙素，溶于DMSO，配成1mg/ml作为母液，再以RPMI-1640配成工作液；RPMI-1640培养基；阿霉素；柔红霉素；维拉帕米。
仪器培养瓶，培养板，FCM，高效液相色谱仪。
(2)实验方法FACS法分析细胞内ADR和DNR积聚K562/ADR细胞培养于无药物的新鲜培养液中，传代二次，取对数生长期细胞，经胰酶消化成单细胞悬液。实验分为四组，对照组、敏感组、耐药组和逆转组。对照组加入新鲜培养液，逆转组加入浓度分别为6μg/ml，10μg/ml的SchB，孵育1h后加入ADR或DNR，浓度分别为1μg/ml和5μg/ml，分别于0min，15min，30min，60min，90min，120min取样分析荧光强度，见图4。图4表明SchB可有效增加ADR或DNR在抗药细胞中的积聚。
高效液相色谱法检测细胞内ADR外排样品处理取对数生长期细胞，弃陈旧培养基，换新培养液，在培养液中分别加或不加10μg/ml的SchB，再加5μg/ml的ADR，培养3h后收集细胞，4℃PBS洗三遍，PBS垂悬计数后，置-20C冰箱保存，测定前先融化并超声破碎处理，再以10000g离心30min，取上清用高效液相色谱仪分析。HPLC分析条件是60％乙晴作为流动相，流速1ml/min，柱温40℃，检测波长290nm，色谱柱HypersilC18柱，取10μl样品进样。结果分析以色谱峰的峰面积对ADR浓度进行作图，细胞内ADR滞留倍数＝细胞内ADR积累(ADR+SchB)/细胞内ADR的积累(ADR)，见图5。图5说明SchB可显著增加ADR在多药耐药细胞中的滞留，抑制药物外排。
Rh-123积聚的检验Rh-123为P-gp的底物，同时本身又具有荧光，且与用荧光抗癌药物相比几乎没有细胞毒性，不会影响细胞正常生命活动。收集对数生长期的KB和KBV200细胞，细胞数为1×106/ml，各分为12组，各组细胞经不同浓度逆转剂处理后分别与5μmol/L的Rh-123在37℃孵育，90min后取出0.5ml细胞悬液，冷PBS冲洗，细胞悬液上样，用流式细胞仪测定，每份样品分析10000个细胞，激发波长488nm，荧光分析为530/530nm。没有加Rh-123的细胞作为在这种情况下的自动荧光背景，见图6。
Rh-123的外排细胞经含0.02％EDTA的胰酶消化，在培养液中以1×106/ml垂悬，10μg/ml的SchB或10μg/ml VER加进培养基，随后加1.0μg/ml的Rh-123，细胞37℃下培养1h(底物结合期)。接着，用没有逆转剂和Rh-123的正常培养基垂悬。在外排期，样品培养在37C孵箱中，分别于0，0.5，1，2h取0.5ml混匀的细胞，冷PBS洗涤两次，垂悬在500μl PBS中，取1×104细胞用流式细胞仪进行荧光检测分析，激发波长488nm，发射波长530nm，检测荧光相对强度。A＝逆转组平均荧光强度值-对照组平均荧光强度值，见图7。
统计学处理实验结果分析采用t检验、线性相关分析，P值＜0.05为显著差异。
(3)实验结果图4说明五味子乙素可恢复阿霉素在MDR细胞K562/ADR细胞中的积聚，其药效与维拉帕米相当。
图5说明五味子乙素可恢复柔红霉素在MDR细胞K562/ADR细胞中的积聚，其药效与维拉帕米相当。
图6说明五味子乙素可阻止MDR细胞K562/ADR细胞中阿霉素的外排，其药效与维拉帕米相当。
图7说明五味子乙素可恢复罗丹明Rh-123在MDR细胞KBV200细胞中的积聚，其药效与维拉帕米相当。
结论五味子乙素可完全抑制P-糖蛋白的功能，完全恢复MDR肿瘤细胞内的药物积聚。
实施例5五味子乙素恢复柔红霉素在多药耐药细胞中的分布(1)实验材料试剂五味子乙素购自中国药品与生物制品研究所，柔红霉素，为浙江为浙江海正药业有限公司，罗丹明(Rh-123)购自Sigma公司。
细胞药敏细胞株KB和多药耐药细胞株KBV200细胞均购自中国医学科学院血液研究所，用10％小牛血清RPMI 1640培养液在37C、5％CO2条件下培养。耐药细胞株KBV200为长春新碱(VCR)诱导建立的耐药株，维持在200ng/ml VCR中稳定生长，实验前一周停药培养。
仪器流式细胞仪为Becton Dickson公司产品。
(2)实验方法流式细胞仪检测细胞内DNR(柔红霉素)含量DNR为蒽环类药物，具有自发荧光的特点。可采用流式细胞仪检测荧光法测定细胞内DNR含量，以DNR荧光强度(fluorescent intensity，FI)代表细胞内DNR浓度的相对含量。KB和KBV200细胞分别制成1×106细胞悬液，加入2μg/mlDNR，在37℃、5％CO2条件下孵育1h，离心，冷PBS洗涤2次，行FCM检测。见图8。
同样，细胞内的药物积聚也可用荧光指示剂罗丹明Rh-123，见图9。
蔡氏荧光显微镜观测将细胞悬液1*105/ml，分三组，一组为不加任何逆转剂组，一组为加10μg/mlSchB组，另外一组为加6μg/ml verapamil组。各组均在在37℃、5％CO2孵育30min后，各取1ml与2μmol DNR(终浓度)或1μg/ml的Rh-123在37℃、5％CO2条件下再孵育1h，离心，冷PBS(pH7.4)洗涤2次，冷PBS(pH7.4)重新垂悬细胞，加入载波片，置荧光显微镜下观察，激发光488nm，发射光515nm。见图10、11。
(3)实验结果P-gp除出介导药物外排外，还可使化疗药物在细胞内异常分布。我们采用蔡式荧光显微镜，利用蒽环类化疗药物本身固有的荧光，结合特异探针，定位研究DNR在KBV200中的异常分布和SchB、VER对其分布的影响。结果指出，DNR(柔红霉素)主要集中在药敏细胞KB的核内，而DNR在耐药细胞KBV200的核内几乎没有，说明DNR不能到达耐药细胞中的靶位点(图8)。荧光指示剂罗丹明Rh-123在药敏细胞KB和抗药细胞KBV200中的分布与DNR一致，进一步说明抗癌药不能到达耐药细胞中的靶位点(图9)。而耐药细胞用五味子乙素处理后，DNR和罗丹明Rh-123可积聚在细胞核内，并在细胞质中也呈弥漫性分布，与药敏细胞相似(图10，图11)。五味子乙素恢复抗癌药物在多药耐药细胞中的分布的药效与维拉帕米相当。
实施例6五味子乙素促进抗癌药对多药耐药细胞的凋亡(1)实验材料试剂五味子乙素对照品购自于中国生物制品药品检定所，标定纯度大于98％。该药用DMSO配成10mg/ml的储备液，使用时用培养基稀释使DMSO终浓度小于1％。MTT购自美国Sigma化学品公司。长春新碱(vincristine，VCR)购自浙江民生药业，用生理盐水配成1mg/ml母液，以上药物使用时均用培养液配成一系列稀释液。Hoechst 33342和碘化丙锭(Propidium iodide，PI)购自Sigma公司。
仪器德国蔡氏荧光显微镜，美国BD流式细胞仪。
(2)方法细胞培养人口腔鳞癌敏感性细胞KB及其耐药细胞系KBV200，由浙江大学肿瘤研究所提供，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养(GIBCO)在37℃，5％CO2培养箱中，其中KBV200用100ng/ml的VCR进行耐药维持。
荧光染色检测采用DNA荧光染料Hoechst 33342和碘化丙锭(PI)联染技术，细胞传于12孔板中，24h后加药，药物处理后24h，用含EDTA胰酶分离仍贴壁的细胞，合并收集悬浮和消化的细胞，加1μl 1mg/ml Hoechst 33342及5μl 100μg/ml PI后37℃、染色10min后，紫外光激发，荧光显微镜下统计结果，每种样品至少统计150个细胞以上，同时拍摄药物处理后的凋亡细胞图像，实验至少重复2次，结果以二类染色质凝集的细胞数占总细胞数的百分比表示。见图12。细胞周期分析和亚二倍体峰观测细胞经胰酶消化后，用冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，70％乙醇固定细胞24h以上。测定前离心去乙醇，用PBS洗3次，加100μg/ml RNase37C消化30min，PI 50μg/ml染色30min以上，流式细胞仪488nm波长下检测，结果用ModFit 3.0软件分析。每份样品检测1万个细胞，计算凋亡细胞百分比。
统计与数据分析统计比较采用Student’s t-test，P值＜0.05为显著差异。
(3)实验结果1μg/ml ADR单独作用于敏感KB细胞，有90％以上的细胞出现凋亡；1μg/ml、5μg/ml的ADR处理耐药细胞KBV200，仅2％-9％的细胞发生凋亡，说明KBV200耐药细胞对ADR有交叉耐药性，和敏感细胞KB对凋亡的敏感度有显著差别，表现为凋亡耐受。SchB与ADR合用处理耐药细胞，明显增加凋亡的百分率。10μg/ml SchB与1μg/ml ADR合用，使凋亡百分率从ADR单独作用的1.7％增加到46.1％如和5μg/ml ADR联合处理，凋亡百分率增加到90％以上，凋亡增敏达10-20倍(表3，图13)。
表3.双染观测KB或KBV200在ADR或ADR和SchB联合作用下凋亡比率(％apoptosis)Cell Ctrl A1A5 A1+S10A5+S10KBV2001.2％1.7％ 7.6％46.1％＞90％KB0.8％＞90％ ＞90％Ctrl细胞不用药物处理；A1用1μg/ml的阿霉素处理；A5用5μg/ml的阿霉素处理；A1+S10用1μg/ml的阿霉素和10μg/ml五味子乙素处理；A5+S10用5μg/ml的阿霉素和10μg/ml五味子乙素处理。
以上的细胞用流式仪分析得到相似的结果见表4表4.FCM检测的SchB对ADR诱导KBV200细胞凋亡的效果
A1组为1μg/ml ADR处理组；A5组为5μg/ml ADR处理组；A1+S10组为1μg/mlADR和10μg/ml SchB联合处理组；A5+S10为5μg/ml和10μg/ml SchB联合处理组。与相应对照组比aP＜0.01，bP＜0.01，有显著差异。
五味子乙素并不增加阿霉素对药敏细胞的凋亡作用，见表5表5.FCM检测的SchB对ADR诱导KB细胞凋亡
A0.1组为0.1μg/ml ADR处理组；A1组为1μg/ml ADR处理组；S10+A0.1组为0.1μg/ml ADR和10μg/ml SchB处理组；S10+A1组为1μg/ml ADR和10μg/ml SchB处理组。与对应组比cP，dP＞0.05，无明显差异。
实施例7五味子乙素下调多药耐药蛋白P-gp的表达(1)实验材料试剂五味子乙素购自中国药品生物制品检定所，用DMSO配成10mg/ml的储备液，使用时用培养基稀释使DMSO终浓度小于1％。P-gp荧光单抗购自BD公司。Trizol提取试剂盒为Invitrogen公司产品。小牛血清为杭州四季青生物制品有限公司。AMV逆转录酶试剂盒(AMV reverse transcriptase kit)和PCR试剂盒为Promega公司产品。
细胞耐药细胞株K562/ADR和KBV200。
(2)实验方法RT-PCR检测MDR基因mdr1的表达，β-actin作为内参照。总RNA用Trizol法抽提并参照试剂盒说明书进行操作。不同浓度的SchB作用Kbv200耐药细胞株24小时后提取mRNA，RT-PCR后在1.5％琼脂糖凝胶电泳并成像，见图14。取经不同浓度SchB(0，5，10，20μg/ml)作用4h的KBV200细胞(1×105/ml)，分别采用Trizol(Invitrogen公司)试剂按操作说明提取其总RNA，经紫外分光光度计测定，进行RNA定量。采用Promega公司的逆转试剂盒，按其方法说明进行cDNA合成。反应体系中RNA 2μg，AMV-RT缓冲液4μl，RNasin 20U，dNTP 2μl，cDNA引物50pmol/L，AMV 20U，25mmol/L MgCl24μl，置37C水浴60min，95C10min合成cDNA。MDR1引物上游序列5’TGTACCCATCATTGCAATAGCAGG3’，下游序列为5’ATATGTTCAAACTTCTGCTCCTGA3’，间隔序列长度为164bp。25μl的PCR反应体系，含5×PCR反应液5μl，上下游引物各7.5pmol/L，1.5U Taq酶和50ng cDNA，反应条件为95℃5min→1 cycle{95℃ 1.5min 58℃1min，72℃3min}→33cycles{95℃0.75min，58℃1min，72℃1min}→1 cycle{95℃0.75min，58℃1min，72℃3min}→72℃7min→4℃保持。β-actin(肌动蛋白)作为内对照，同MDR1的PCR体系，上游引物为5’AGGCCAACCGCGAGAAGATGACC3’，下游引物为5’GAAGTCCAGGGCGACGTAGCAC3’，上下游引物序列间隔为350bp，反应条件为95℃5min→25-28cycles{95℃20s→55℃20s→72℃30s→72℃7min→4℃保持。细胞P-gp表达测定各组细胞分别与浓度为0，20μg/ml SchB作用48h，收集细胞制成1×106/ml的悬液，加入一抗鼠抗人P-gp(1∶400)，4℃避光反应45min，用加1％小牛血清的PBS洗3次后，加入二抗羊抗鼠IGg(1∶1000)，4℃避光反应30min，PBS洗三次，用PBS垂悬后，流式细胞仪检测细胞荧光强度。见图15。
(3)实验结果用0μg/ml，10μg/ml和15μg/ml SchB与KBV200细胞24孔板共培养24h，Trizol提取细胞总RNA，RT-PCR观测mdr1基因表达。结果表明五味子乙素可在mRNA和蛋白水平下调耐药细胞的P-gp。说明五味子乙素也可通过下调P-gp的表达来逆转肿瘤MDR。
实施例8五味子乙素竞争性结合P-gp。
(1)实验材料试剂五味子乙素购自中国药品生物制品检定所，用DMSO配成10mg/ml的储备液，使用时用培养基稀释使DMSO终浓度小于1％。3H-azidopine(无准确中文翻译参考)为Amersham公司产品。P-gp荧光单抗购自BD公司。Trizol提取试剂盒为Invitrogen公司产品。小牛血清为杭州四季青生物制品有限公司产品。细胞多药耐药细胞KBV200。
(2)实验方法3H-azidopine的亲和标记检验(photoaffinity labelling)P-gp的亲和标记用Feery等修正过的方法评估。KBV200细胞制成悬液，超声粉碎，离心取细胞膜碎片，在预溶缓冲液(终浓度，50mM Tris-HCL(PH7.4)，0.1mM AEBSF，0.25mM蔗糖和5mM MgCL2)中调整到1mg/ml浓度。30μl膜样品加上10μl标记缓冲液50mMTris-HCl(PH7.4)，0.1mM p-aminoeth-ulbenzenesulfony fluoride(无准确中文翻译参考)，0.25mM蔗糖和5mM MgCL2中，与不同浓度的SchB和10μl3H-azidopine(无准确中文翻译参考)共同孵育在96孔板中，置冰上黑暗中孵育1h，3H-azidopine孵育在混和液中的终浓度是1μM。样品经7.5％SDS-聚丙烯酰氨电泳，凝胶在170KD处切割，置液闪仪成像，见图16。
(3)实验结果亲和成像(photoaffinity labelling)检测P-gp与3H-azidopine的关系。3H-azidopine时P-gp特异性底物，加入不同浓度的SchB后，放射自显影的结果是条带越来越小，说明SchB能竞争性结合到P-gp活性位点，从而阻断化疗药物与P-gp的结合，增加药物浓度，减少外排。
实施例9五味子乙素体内逆转肿瘤多药耐药性药效-五味子乙素合并阿霉素治疗荷人多药耐药KBV200细胞异种移植瘤的Balb/c裸鼠的疗效(1)实验材料试剂PEG400为Sigma公司产品，Tween20购自华美生物工程公司。五味子乙素购自中国药品生物制品检定所，用PEG400和Tween20按9∶1体积比(PT)配成20mg/ml溶液。硫酸长春新碱(vincristine，VCR)为广州明光制药厂产品。注射用盐酸阿霉素(Adriamycin)为浙江海正药业股份有限公司产品，用生理盐水配成2.5mg/ml浓度储存液。
细胞人多药耐药KBV200裸鼠Balb/C裸鼠购自上海动物中心。
(2)实验方法Balb/c裸鼠皮下接种RKO细胞形成实体瘤5×106经VCR长期诱导的KBV200细胞接种于Balb/c裸鼠腋部皮下。大约10天当瘤体直径达0.5-1cm左右时，动物随机分成5组生理盐水处理组(NS组)，溶剂处理组(PT组)，阿霉素处理组(ADR组)、SchB处理组(SchB组)、阿霉素和SchB联合使用组(ASB组)。每次用药，NS组首先灌胃100μl生理盐水，PT组首先灌胃100μl PT溶剂，ADR灌胃生理盐水100μl，SchB组灌胃100μl 20mg/ml SchB，ASB组灌胃100μl20mg/ml SchB，30min后，NS、PT及SchB组依次注射50μl生理盐水，ADR组和ASB组均注射50μl 2.5mg/ml ADR。所有动物每7天用药两次，并用游标卡尺测量瘤体大小。瘤体体积计算采用公式体积＝∏/6×(长×宽2)，长代表最长径。见图17。
统计与数据分析数值采用mean±SD.统计比较采用Student’s t-test，P值＜0.05为显著差异。
(3)实验结果抑制KBV200致实体瘤的生长从图17可以看出，NS组、PT组和SchB组小鼠在肿瘤体积上都表现出一种渐进性的快速增长，在9天时分别有1.13±0.243cm3，1.29±0.262cm3和1.21±0.202cm3，在21天时瘤体积分别为2.66±0.324cm3，2.54±0.346cm3和2.71±0.262cm3。NS组、PT组分别有一只小鼠在13天和15天时死亡。阿霉素组在9天和18天的瘤体积分别为0.882±0.169cm3和2.15±0.309cm3，与NS组、PT组和SchB组相比P＜0.05，具有显著差异，但有一只鼠在第9天死亡。在阿霉素和SchB联合处理组，其平均瘤体大小在9天和18天分别是0.77±0.195cm3和1.83±0.322cm3，与NS组、PT组和SchB组相比，其P＜0.01，有极显著差异，相比ADR组也有显著差异(P＜0.05)，该组无任何小鼠死亡。SchB和阿霉素联用组的小鼠明显被抑制了KBV200所致实体瘤的增长，其抑癌效果比单独用等剂量化疗药阿霉素(2.5mg/kg)相比要好。在SchB处理的小鼠中都没有观察到显著的反常体重减轻或其它的毒性反应，证明该浓度长期使用是安全的。延长荷KBV200实体瘤裸鼠生存时间除了抑制肿瘤体积的增长外，另一个重要的指标是生命延长率。SchB和阿霉素联合处理组与生理盐水作用组的小鼠相比较，具有显著的生命延长(表1，图18)。对照组(NS)和溶剂组(PT)之间无有意义的差别，SchB单独作用组的小鼠与对照组也没有显著差异，说明SchB和溶剂均没有抗瘤效果。从表6中可看到，虽然ADR组平均生命延长率较NS组、PT组和SchB组没有显著性，但从图18比较，ADR是有一定抑制瘤体生长作用。
表6 SchB和ADR联合治疗对荷KBV200移植瘤小鼠存活率和生命延长率的影响
其中，NS为生理盐水处理组，PT为溶剂处理组，ADR为阿霉素处理组、SchB为五味子乙素处理组、ASB为阿霉素和五味子乙素联合使用组*P＜0.05与PT组、SchB组和对照组相比。
综合实施例1～9实验数据可知，五味子乙素可有效地逆转肿瘤的多药耐药性，其药效与维拉帕米相当。五味子乙素与维拉帕米相比，后者有较大的心血管毒性，因此在临床试验中被淘汰。而五味子乙素无这方面的毒性，因此有临床应用的前景。
权利要求
1.五味子乙素在制备治疗肿瘤药物中的应用。
2.如权利要求1所述的五味子乙素在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的五味子乙素在制备肿瘤细胞多药耐药性逆转剂药物中的应用。
3.如权利要求2所述的五味子乙素在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的逆转剂药物还含有用于制备通过逆转肿瘤细胞多药耐药性起作用的抗肿瘤药物，及药物赋形剂或载体。
4.如权利要求3所述的五味子乙素在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的抗肿瘤药物为P-糖蛋白的底物，为下列之一①阿霉素 ②紫杉醇 ③表阿霉素 ④柔红霉素 ⑤长春新碱 ⑥高三尖杉酯 ⑦米脱蒽醌 ⑧羟基喜树碱。
5.如权利要求4所述的五味子乙素在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的逆转剂药物可制成下列剂型①注射液 ②片剂 ③胶囊剂 ④颗粒剂 ⑤缓释剂。
6.如权利要求2所述的五味子乙素在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的逆转剂药物还可以含有其他逆转剂。
7.如权利要求2所述的五味子乙素在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的肿瘤细胞多药耐药性逆转剂药物抑制肿瘤细胞内P-糖蛋白的功能。
8.如权利要求2所述的五味子乙素在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的肿瘤细胞多药耐药性逆转剂药物竞争性结合P-糖蛋白。
9.如权利要求2所述的五味子乙素在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的肿瘤细胞多药耐药性逆转剂药物抑制P-糖蛋白在多药耐药肿瘤细胞内的表达。
10.如权利要求1所述的五味子乙素在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的五味子乙素促进抗肿瘤药物诱导多药耐药肿瘤细胞的凋亡。
11.应用五味子乙素制备临床肿瘤化疗的药物。
全文摘要
本发明公开了五味子乙素在制备治疗肿瘤药物尤其是在制备肿瘤细胞多药耐药性逆转剂药物和肿瘤化疗药物中的应用，该化合物还可与其他药物配伍用进一步提高逆转效果。五味子乙素可有效逆转肿瘤的多药耐药性，该化合物作用于P－糖蛋白，可完全抑制P－糖蛋白的功能，因此具有临床应用意义；另外五味子乙素具有较低的毒性，但对某些肿瘤细胞有毒性，所以五味子乙素具有很好的临床肿瘤化疗的应用前景，特别是作为肿瘤细胞多药耐药性逆转剂药物的前景。
文档编号A61K31/704GK1621037SQ20041005960
公开日2005年6月1日 申请日期2004年6月11日 优先权日2003年11月29日
发明者胡汛, 王弢 申请人:胡汛, 宁波英诺药业科技有限公司