专利名称：适合于大规模生产人用禽流感疫苗的纯化技术的制作方法
技术领域：
本技术属于生物制药领域。涉及一种可满足人用禽流感裂解疫苗规模化生产的禽流感病毒纯化技术。
背景技术：
禽流感病毒是由正凝病毒科流感病毒属的A型流感病毒引起的，是各种家禽和野鸟的一种急性传染病。该病呈全球性分布，给养禽业造成巨大的经济损失。1997年一抹禽流感H5N1病毒在香港直接从禽传染给人造成18人感染，6人死亡，该事件说明由禽流感可以造成人流感流行。近几年禽流感在世界范围内有蔓延之势。亚洲近几年一直处于世界禽流感危机中心。据有关人员分析，禽流感的威胁将会持续很多年，卫生专家担心禽流感会和人流感病毒相结合，产生一种易于在人类间传播的疾病。2003年SARS夺走了近8QQ人的生命，禽流感对人类健康的威胁远要比SARS严重许多。目前接种疫苗是预防疾病最有效、最经济的手段。
本发明的目标是研制一种安全有效的人用禽流感裂解疫苗，以预防可能造成的禽流感病毒在人群中的流行。
该发明是利用禽流感病毒反向遗传株NIBGR-14,建立主代种子及工作种子库，规模化、工业化在鸡胚细胞上进行病毒扩增，在此基础上对病毒进行纯化、裂解、灭活等一系列的工艺过程，再进行稀释、除菌过滤制成疫苗。
该发明技术主要是确认禽流感病毒纯化方法及纯化条件，建立具有独立知识产权的人用禽流感病毒裂解疫苗生产工艺。
禽流感疫苗是用禽流感病毒感染鸡胚，使病毒在鸡胚中生长繁殖，然后取其尿液，并经澄清、浓缩、纯化，把病毒提取分离出来，再制成疫苗。然而，由于鸡胚尿液中尿酸盐、蛋白含量很高，提取病毒十分困难。尤其在纯化前的澄清阶段，国内外许多实验室，想了很多办法，例如高速离心、红血球吸附、甲醇沉淀、磷酸铝吸附、聚乙二醇-6000沉淀等等方法，这些办法都不能令人十分满意。随着科学的发展和技术的提高，提取的方法也有了质的飞跃。如用凝胶层析法纯化病毒。
由于病毒液浓缩后粘稠度高，层析纯化方法需要经常清洗凝胶、装柱测柱效，且层析过程中需要使用大量的PBS緩冲液及碱液等。凝胶的使用寿命一般为1至2年。且大生产中新装的层析柱与使用一段时间的层析柱純化的结果不同，因此批间差大、操作复杂、时间长、分离效果不均一，收率较低、成本高，易受其他条件影响。
蔗糖密度梯度法工艺流程简单，每批均使用新的蔗糖，因此批间差小、质量稳定、收率高、纯度很高，卵清蛋白含量很低，成本较低、疫苗的安全性更好，更适合于大规模疫苗的生产，从各项指标看后者均明显优于前者，因此我公司在制备人用禽流感病毒裂解疫苗时，采用蔗糖密度梯度法进行病毒的纯化。
3该发明方法解决了规模化生产中禽流感病毒纯化技术，为大规模生产安全、有效的人用禽流感病毒裂解疫苗奠定了理论基础。
发明内容
该发明是要摸索禽流感病毒纯化方法及纯化条件，建立具有独立知识产权的人用禽流感病毒裂解疫苗生产纯化工艺。
为满足人用禽流感病毒裂解疫苗的生产需要，本发明选用符合疫苗生产的海兰
白种蛋將化的9-11日龄鸡胚，使用禽流感病毒工作种子，进行病毒的生产规模化扩增，收获病毒液。
在本发明方法中，我公司研究用的禽流感毒种为NIBRG-14 (05/160)重配高产抹，是由A/Vietnam/1194/2004 (H5Nl)毒抹经重配获得，来自英国的NIBSC。
毒种传代和制备用鸡胚来源于无外源性禽白血病病毒、I型和III型禽腺病毒的SPF鸡群；疫苗生产用鸡胚来源于封闭式房舍内伺养的、符合疫苗生产的海兰白或来亨健康鸡群。并选用9~11日龄无畸形、血管清晰、活动的健康鸡胚。
本发明涉及一种规模化生产人用禽流感病毒裂解疫苗的病毒纯化方法，其特征在于用300目滤布粗滤尿嚢液去除杂质，再经8000rpm连续流^f氐速离心方法去除大分子物质，对尿嚢液澄清；选用IOOKD超滤膜，将病毒尿嚢液超滤浓缩30-50倍；将病毒浓缩液经蔗糖密度梯度30000rpm离心3小时，对病毒进行纯化；根据紫外检测仪收集纯化后的病毒峰。
本发明的优点是采用蔗糖密度梯度法工艺，其流程简单，每批均使用新的蔗糖，因此批间差小、质量稳定、收率高、纯度很高，卯清蛋白含量很低，成本较低、疫苗的安全性更好，更适合于大规模禽流感病毒裂解疫苗的生产，是唯一用于人用禽流感病毒裂解疫苗制备的方法。
图1纯化的禽流感病毒SDS-PAGE电泳照片图2禽流感病毒裂解疫苗生产流程图具体实施方案
1 ) 鸡胚准备
选用血管清晰、胚胎活动的9-11日龄鸡胚。
2) 病毒接种、培育及收获
取禽流感工作种子批毒种，根据其感染病毒滴度将病毒稀释成1000-10000个ETD50毒种悬液，于鸡胚尿囊腔接种，每胚0. lml;将鸡胚置33 35'C培育68-72小时，挑选活胚置2 8 °C经冷胚16 - 20小时，分组收获尿嚢液。
3) 病毒液合并与澄清
病毒的单次收获物合并为病毒合并液，将收获的病毒合并液用300目滤布过滤，再经8000rpm连续流离心澄清。
44)超滤浓缩
选用100~ 300KD超滤膜，将病毒合并液超滤浓缩30~50倍，血凝滴度应不低于1: 1600。
5 )纯化
将浓缩后的病毒液经蔗糖密度梯度30000rpm离心3小时，根据紫外检测仪收集纯化后的病毒峰。
本发明与现有技术比较的有益效果如下
项目本发明技术现有技术
纯化效果好一般
产品质量可去除更多的非特异性蛋白不能去除
工艺流程简单复杂
去除方法简单复杂
产品安全性用于儿童更安全<十反应较大
产品成本较原有技术降低成本较高
实施例
1. 材料及设备
病毒尿嚢液批号 Q0601Q0602 Q0603 Q0604
液量(L) : 34. 0 35. 235. 5 35. 2
血凝滴度 1:12801:960 1:1280 1: 1280
pH7.2PBS
30°/ 和55%的蔗糖300目滤布
连续流离心机型号CR21G (日立公司)超滤浓缩系统 IOOKD膜包 Millipore公司超速离心机型号CP70MX 日立公司紫外检测仪型号8823A-UL,蠕动泵。
2. 方法
将批号为Q0601、 QQ602、 Q0603、 Q0604共4批病毒尿嚢液分别用300目滤布过滤，去除蛋皮等不溶性杂质，再经连续流离心机8000rptn离心澄清去除大分子物质，将上述澄清后病毒液分别用IOOKD膜式超滤器浓缩30-50倍，再采用蔗糖密度梯度方法30000rpm离心3小时，去除病毒浓缩液中绝大部分卵清蛋白及其他杂质。
3. 结果
1)将纯化后病毒液分别取样测定血凝效价和总蛋白含量，结果如下纯化结果一览表
批号浓缩液纯化液总蛋白质 去除率 (%)收率
液量 mlHA效价 (1: X)总蛋 (ug/ml )液量 mlHA效价 (1: X)总蛋 (ug/ml )('"
Q0601700102401526924025600432890. 3%85. 7%
Q0602700102401486725025600390790. 6%89. 3%
Q0603700102401635026025600363591. 7%92. 9%
Q06047QG102401906125025600394892. 6%89. 3%
使用300目滤布过滤浓缩后，再经连续流低速离心机8000rpm离心去除大分子物质，此方法操作较简单、速度快。可保证生产的连续性，减少污染机会，极大提高了工作效率，并能有效控制制品中的细菌内毒素含量。
利用蔗糖密度梯度离心法纯化病毒，收获率及杂蛋白去除效果均令人满意。
2)病毒原液纯度检测
采用SDS-PAGE电泳分析法对4批禽流感全病毒纯化液进行分子量及纯度测定。图1纯化的禽流感病毒SDS-PAGE电泳图
从图中可见，四批禽流感全病毒的电泳条带间差异不明显。H5N1禽流感病毒是有包膜的RNA病毒，病毒颗粒分子量在几百万。病毒颗粒表面有两种糖蛋白血凝素(HA )和神经氨酸酶(NA)。血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)单体分子量分别为75000和55000。经SDS裂解在巯基乙醇还原下，血凝素被分解为两个独立的肽链HA1和HA2,分子量各为5Q000和25000;神经氨酸酶单体分子量为55000的糖蛋白。
研究结果表明，采用蔗糖密度梯度离心法对H5N1禽流感全病毒进行纯化，各批純度均较好，各批全病毒纯化液电泳条带差别不大。
权利要求
1.本发明涉及一种规模化生产人用禽流感病毒裂解疫苗的病毒纯化技术，其特征在于，采用禽流感毒种NIBRG-14(05/160)重配高产株，以鸡胚作为基质细胞，规模化制备人用禽流感病毒裂解疫苗，其中包括病毒接踵、病毒培养、病毒收获、粗滤尿囊液、连续流低速离心、超滤浓缩及蔗糖密度梯度离心。
2. 权利要求1所述的在本发明方法中，采用的禽流感毒种为NIBRG-14 (05/160)重配高产林,是由A/Vietnam/1194/2004 (H5Nl)毒抹经重配获得，来自英国的NIBSC。
3. 权利要求1所述的在本发明方法中使用鸡胚，病毒种子库为SPF鸡胚，生产用鸡胚为来源于封闭式房舍内伺养的、符合疫苗生产的海兰白或来亨健康鸡群。并选用9~11日龄无畸形、血管清晰、活动的#:康鸡胚。
4. 权利要求1所述的本发明中病毒培养方法为1 )将禽流感病毒工作种子制备成1000-10000个EID50毒种悬液，于鸡胚尿嚢腔接种，每胚0. lml; '2 )将鸡胚置33 ~ 35。C培育68 — 72小时；3 )挑选活胚置2 ~ 8'C经冷胚16 - 20小时，分组收获尿嚢液。
5. 权利要求1所述的本发明中病毒液合并与澄清方法其特征为1 )将收获的病毒合并液用300目滤布过滤；2 ) ,Orpra连续流离心澄清。
6. 权利要求1所述的在本发明中病毒液超滤浓缩方法其特征为选用100 ~ 300KD超滤膜，将病毒合并液超滤浓缩30 ~ 50倍。
7. 权利要求1所述的在本发明中病毒液纯化方法其特征为将浓缩后的病毒液经蔗糖密度梯度30000rpm离心3小时。
8. 权利要求1所迷的本发明中病毒纯化方法，其中病毒纯化液的收集采用紫外检测仪，收集纯化后的病毒。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及一种禽流感病毒的纯化技术，适合用于人用禽流感病毒裂解疫苗的大规模生产，其特征在于将禽流感毒种接种在9-11日鸡胚，培养68-72小时，收取尿囊液，经粗滤、连续流离心、超滤浓缩及蔗糖密度梯度离心进行纯化，该技术具有操作简单，批间差小、质量稳定、收率高、卵清蛋白含量低等特点。
文档编号C12N7/02GK101633911SQ20081013219
公开日2010年1月27日 申请日期2008年7月22日 优先权日2008年7月22日
发明者傅连弟, 蕾 周, 李卫东, 屹 杨, 王敏文, 王飞宇, 飞 聂, 彬 赵, 郭文军, 闫昆明, 楠 陈, 魏传忠 申请人:大连雅立峰生物制药有限公司