专利名称：：南非Ⅱ型口蹄疫抗原表位多肽及其筛选方法
技术领域：
：本发明属于基因工程
技术领域：
，具体地说，涉及南非Ii型口蹄疫病毒主要抗原表位上的六条多肽及筛选方法。
背景技术：
：口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus，FMDV)引起的偶蹄动物的一种急性、高度接触性传染病，一度被世界动物卫生组织(OIE)列为A类疫病之首。口蹄疫属于世界流行性传染病，它的暴发给全球人类健康以及畜牧业生产造成了极大的危害。口蹄疫病毒属于小RNA病毒科，口蹄疫病毒(aphthovirus)属。FMDV是由单股正链RNA组成的140S颗粒，它由VPl(ID)、VP2(IB)、VP3(IC)和VP4(1A)四种结构蛋白各60拷贝组成。FMDV基因组全长约8500bp，依次由5'UTR、0RF和3'UTR及Poly(A)尾组成。5'UTR长约1300bp，它包括在病毒翻译和RNA复制中起作用的5个功能区S片段、Poly(C)、ere区、IRES(内部核糖体进入位点)等。3'UTR可以结合参与RNA复制某些小RNA病毒蛋白，因此它对于病毒基因组复制具有重要作用。Poly(A)尾可能也在FMDV翻译和小RNA病毒的RNA复制中起作用。FMDV的ORF长约6500bp，由L基因、Pl结构蛋白基因、P2和P3非结构蛋白基因以及起始密码子和终止密码子组成，编码一个大的聚蛋白。L区包括Lab、Lb两种蛋白。结构蛋白Pl区包含了FMDV的主要抗原位点。Pl基因编码4种病毒的结构蛋白，即VP1、VP2、VP3和VP4。VPlVP3组成衣壳蛋白亚单位，VP4位于病毒颗粒内部。P2基因编码3种病毒的非结构蛋白，2A、2B、2C。P3基因编码非结构蛋白3A、Vpg、3CpM和3DP<)1。目前，关于FMDV结构蛋白的研究主要集中在VPl上，对VPl结构和功能的研究表明，FMDV的0、A、C型和AsiaI型，其主要抗原位点都在VPl上。VPl暴露于病毒颗粒的表面，承受的选择压力最大，关键氨基酸的改变可导致抗原位点和单克隆抗体反应性的改变，使得VPl最容易发生变异，其变异常可导致毒株抗原性的变化，在口蹄疫免疫预防、遗传演化中一直是研究的主要对象。但目前已有研究表明，在病毒的抗原结构中VPlVP3都显示了重要作用。Archarya对FMDV颗粒空间构型的研究表明，VPlVP3都有氨基酸位于病毒粒子表面，都能参与抗原位点的形成。口蹄疫病毒的抗原结构十分复杂，不同的血清型有着不同的抗原位点。在口蹄疫病毒的七个血清型中，以0、A、C和AsiaI型的抗原位点研究最多，而对南非型的研究较少。在FMDV的四种结构蛋白VPl、VP2、VP3、VP4中，VPl是诱导产生中和抗体的主要成分，VPl上的G-H环和保守的RGD(Arg-Gly-Asp)基序参与构成了重要的抗原位点。此外，对FMDV空间构型的研究发现VP2、VP3都能参与抗原位点的形成。
发明内容本发明的目的是提供南非II型口蹄疫病毒主要抗原表位的六条多肽。本发明的另一目的是提供南非II型口蹄疫病毒主要抗原表位六条多肽的筛选方法。为了实现本发明目的，本发明提供南非II型口蹄疫病毒主要抗原表位的六条多肽，分别位于抗原VPl的132146和199211位点；VP2的6073和163176位点；VP3的5871和127140位点，其氨基酸序列分别为GECKYTQTSTAIRGD、HQSRDRFDAPIGV；RFFKEKLFDffTSDK,LGVNRHDQGKRHQA；DGKPYWTKNNGDK、PGVNTDELPKTPEA,或这六条氨基酸序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。前述的南非II型口蹄疫病毒主要抗原表位六条多肽的筛选方法，包括如下步骤1)采用软件分析南非II型口蹄疫病毒的三种结构蛋白VP1、VP2和VP3的氨基酸特性，根据这些氨基酸特性设计并合成多肽片段；2)对合成的多肽进行抗原性分析，筛选出6条多肽，其氨基酸序列分别为GECKYTQTSTAIRGD、HQSRDRFDAPIGV、RFFKEKLFDffTSDK,LGVNRHDQGKRHQA、DGKPYWTKNNGDK和PGVNTDELPKTPEA。前述的方法，其中合成多肽的抗原性分析包括反应原性检测及免疫原性检测。前述的方法，其中反应原性检测采用间接ELISA法。南非II型口蹄疫主要抗原表位的六条多肽在检测南非II型口蹄疫病毒中的应用。本发明采用DNAstar软件分析三种结构蛋白VP1、VP2、VP3上每个氨基酸的亲水性、柔韧性来判断南非II型(SATII型)FMDVPl抗原可能存在的表位，用Kyte-Doolittle法分析各结构蛋白的亲水性(结果如图1所示)，用Emini法分析各结构蛋白的表面可能性(结果如图2所示)，用Jameson-Wolf法分析各结构蛋白的抗原指数(结果如图3所示)，通过分析这些氨基酸残基的特性，综合评价FMDV三种结构蛋白VP1、VP2和VP3上可能成为抗原表位的多肽片段。同时，结合国内外大量有关抗原表位的研究报道，共合成了8条长度在14个氨基酸左右的小肽，并进行抗原性分析。将这8条多肽与载体蛋白KLH偶联免疫BALB/c小鼠，三免后用裸肽作为包被抗原进行间接ELISA检测血清抗体，结果有6条多肽免疫小鼠后产生了高效价的特异性抗体，效价较高，证实其具有良好的免疫原性；且这8条多肽与SATII型FMDV的阳性血清都能结合，显示了良好的反应原性，由此本发明筛选出了6条抗原性良好的多肽。本发明的优点在于，筛选出的6条多肽抗原性良好，对6条多肽进行动物免疫试验，免疫后的动物产生了高效价的特异性抗体，效价较高，证实其具有良好的免疫原性。图1为用Kyte-Doolittle法分析本发明南非II型口蹄疫病毒的三种结构蛋白VPUVP2和VP3氨基酸的亲水性图谱；图2为用Emini法分析本发明南非II型口蹄疫病毒的三种结构蛋白VP1、VP2和VP3氨基酸的表面可能性图谱；图3为用Jameson-Wolf法分析本发明南非II型口蹄疫病毒的三种结构蛋白VP1、VP2和VP3氨基酸的抗原指数图谱；图4为本发明合成多肽与SATII型FMDV阳性血清的反应原性检测结果示意图；图5为本发明合成多肽的小鼠免疫试验间接ELISA检测结果示意图。具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1六条多肽的筛选方法1材料和方法1.1抗原和血清多肽由上海生工生物工程有限公司合成，经HPLC鉴定纯度在95%以上；SATII型FMDV阳性血清由英国口蹄疫参考实验室提供，本实验室保存；HRP标记山羊抗小鼠IgG、HRP标记兔抗牛IgG购自北京鼎国生物技术公司。1.2试验动物2月龄BALB/c雌性小鼠，购自军事医学科学研究院。1.3主要试剂及溶液配制弗氏完全佐剂(Freud，scompleteadjuvant)、弗氏不完全佐剂(Freud，sincompleteadjuvant)；(SigmaChemicalCo.St.Louis,Mo,USA)ELISA部分相关试剂的配制(1)包被缓冲液(ρΗ9·6,0.lmol/L碳酸盐缓冲液)Na2CO33.18gNaHCO35.86g加蒸馏水至IOOOmL(2)洗涤缓冲液(ρΗ7·4,0.01mol/LPBST，含0·05%Tween-20)Na2HPO4.12H202.91gNaH2PO4.2H200.30gNaCl8.50gTween-200.5mL加蒸馏水至IOOOmL(3)封闭液明胶Ig溶于IOOmLPBS中(4)稀释液鸡卵清白蛋白(OVA)0.Ig加洗涤缓冲液至IOOmL(5)底物缓冲液(0.05mol/LρΗ5·0磷酸-柠檬酸)0.2mol/LNa2HPO4(28.4g/L)25.7mL0.lmol/L柠檬酸(19.2g/L)24.3mL加蒸馏水至IOOmL(6)TMB使用液TMB(10mg/mL，溶解于二甲基甲酰胺DMF)150μL底物缓冲液IOmLH2O26μL(7)终止液(lmol/LH2SO4)蒸馏水578.3mL,逐滴加入浓硫酸(98%)217.7mL。1.4方法1.4.ISATII型FMDV结构蛋白抗原表位的筛选及合成利用DNAstar软件分析SATII型FMDV(GenBank登录号EF134951)结构蛋白VPlVP3上每一个氨基酸的亲水性、柔韧性、表面可及性等参数，用Kyte-Doolittle法分析各结构蛋白的亲水性(结果如图1所示)，用Emini法预测各结构蛋白的表面可能性(结果如图2所示)，用Jameson-Wolf法预测各结构蛋白的抗原指数(结果如图3所示)，然后通过这些参数综合评价FMDV三种结构蛋白上可能的抗原表位，并结合研究较多的0、A、C和AsiaI型FMDV抗原位点的分布和关键氨基酸残基的位置，选择蛋白亲水性和抗原指数均较高(^0)且刚好处于蛋白表面可能性区域的8条多肽人工合成，其中4条位于结构蛋白VPl上，2条位于VP2上，2条位于VP3上，每条多肽具体的氨基酸序列及残基位置如表1所示。表18条多肽的氨基酸残基位置及序列<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>1.4.2合成多肽的反应原性检测采用间接ELISA方法进行，具体步骤如下(1)包被抗原用包被缓冲液(pH9.BNa2CO3-NaHCO3)将8组未偶联的合成多肽分别稀释成50μg/mL的浓度，每孔加入100μL，4°C过夜；(2)封闭次日除去包被液，在纸上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤缓冲液(PBST)300μL/孔，共洗涤3次；加入1%明胶(先于37°C使其溶解)，200μL/孔，37°C温育2h;(3)洗涤封闭完成后弃去板内液体，用PBST洗涤5次；(4)加入血清加入1200稀释的SATII型FMDV标准阳性血清，以胎牛血清作为阴性对照血清，100μL/孔，37°C温育Ih；(5)洗涤弃去板内液体，用PBST洗涤5次；(6)加入酶标二抗加入11000稀释的HRP-兔抗牛IgG,100μL/孔，37°C温育lh；(7)加底物液显色用PBST洗涤5次后，在纸上轻轻扣干板内残留液体，加入新鲜配制的TMB使用液，100μL/孔，37°C避光反应15min；(8)终止反应每孔加入50μLIMH2SO4终止反应，在酶标仪下检测OD45tlnm的值。1.4.3合成多肽的动物免疫试验将2月龄的BALB/c雌性小鼠，随机分成9组，每组6只。以合成的8组KLH偶联多肽分别免疫BALB/c雌性小鼠，免疫剂量为60μg/只，阴性组以PBS免疫作为对照。用PBS将多肽抗原稀释到300yg/mL，加入等量的弗氏完全佐剂，于2mL注射器内进行乳化(以塑胶管连接两个注射器，在两注射器间来回推送抗原佐剂混合物，直至形成均勻的乳浊液，放置半小时后不分层表明已乳化成功)。于小鼠颈部、背部皮下多点注射进行初次免疫，然后每隔三周，取同样量抗原加入等量的弗氏不完全佐剂同上法乳化后进行二免，再三周后加强免疫。1.4.4合成多肽的免疫原性检测3免后8天自BALB/c小鼠尾部各采血0.lmL，室温静置lh，4°C放置2h，3000rpm离心lOmin，收集血清，4°C保存。将8组未偶联的合成多肽分别以10μg/mL的浓度包被ELISA板，将每组多肽免疫小鼠分离的抗血清以11000稀释后，按照间接ELISA方法，检测OD45tlnm的值，再从各组中选择OD45tlnm值最高的小鼠抗血清按1IOOOU2000,14000、18000...进行倍比稀释，进行血清抗体效价的测定，计算出P/N值，以P/N值彡2.1的血清最高稀释度作为该血清抗体的效价。间接ELISA方法步骤如下(1)包被抗原用包被缓冲液(pH9.BNa2CO3-NaHCO3)将8组未偶联的合成多肽分别稀释成ομg/mL的浓度，每孔加入100μL，4°C过夜；(2)封闭次日除去包被液，在纸上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤缓冲液(PBST)300μL/孔，共洗涤3次；加入1%明胶(先于37°C使其溶解)封闭，200μL/孔，37°C温育2h；(3)洗涤封闭完成后弃去板内液体，用PBST洗涤5次；(4)加入待检血清加入11000稀释的小鼠血清，以PBS免疫组的小鼠血清作为阴性对照血清，100μL/孔，37°C温育Ih；(5)洗涤弃去板内液体，用PBST洗涤5次；(6)加入酶标二抗加入11000稀释的HRP-山羊抗小鼠IgG,100μL/孔，37°C温育Ih；(7)加底物液显色用PBST洗涤5次后，在纸上轻轻扣干板内残留液体，加入新鲜配制的TMB使用液，100μL/孔，37°C避光反应15min；(8)终止反应每孔加入50μLIMH2SO4终止反应，在酶标仪下检测OD45tlnm的值。2结果2.1合成多肽的反应原性检测将8组未偶联的合成多肽用包被缓冲液稀释成50μg/mL,包被ELISA板，加入SATII型FMDV的标准阳性血清，以胎牛血清作为阴性对照血清，间接ELISA法检测OD45tlnm的值并计算出P/N值如表2所示。将8组合成多肽与SATII型FMDV标准阳性血清的反应原性检测结果作成柱形图，如图4所示。经统计学分析，各组多肽的阳性值与阴性值相比差异显著(P<0.05)，且1935组与其它组相比差异显著(P<0.05)。结果表明，8组多肽与SATII型FMDV的标准阳性血清都能结合，与阴性对照的比值(P/N)大于2.1，且1935组的反应性最强，故8组多肽均具有较好的反应原性。表2间接ELISA检测合成多肽与SATII型FMDV标准阳性血清的反应原性(0D45Clnm、Ρ/Ν)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2.2合成多肽的免疫原性检测将8组未偶联的合成多肽分别以10μg/mL包被酶标板，检测每组小鼠的抗血清在11000稀释时的OD45tlnm值，将各组OD45tlnm取平均数并计算出P/N值如表3所示，并将合成多肽小鼠免疫试验间接ELISA检测结果作成柱形图，如图5示。由此可见19281931、1933、1935这六组多肽与阴性对照的比值(P/N)大于2.1，均能引起较强的免疫反应，经统计学分析差异显著(P<0.05)；再从各组中选择OD45tlnm值最高的小鼠抗血清按1;1000、1;2000,1；4000,18000...倍比稀释，测定其效价，OD45tlnm及P/N值如表4和表5所示其中1928、1929组效价达到了1128000，1933、1935组效价达到164000，1930组效价达到了132000，1931组效价达到1128000以上。因此，8条多肽中有6条多肽免疫小鼠后产生了高效价的特异性抗体，具有良好的免疫原性。表3合成多肽的小鼠免疫试验间接ELISA检测结果(0D45Qnm、P/N)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表4间接ELISA检测合成多肽免疫小鼠的效价(OD45tlnm)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表5间接ELISA检测合成多肽免疫小鼠的效价(P/N值)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>3结论综合反应原性试验和免疫原性试验结果，本研究采用间接ELISA方法成功的筛选出了六条抗原性良好的多肽。实施例2六条多肽在检测南非II型口蹄疫病毒中的应用将筛选出的六条抗原性良好的多肽采用柔性Linker连接后化学合成相应的DNA片段插入到pGEX-6p-l原核表达载体中构建成原核表达质粒表达蛋白，并进行纯化。利用获得的纯化蛋白建立南非II型间接ELISA检测方法，采用此方法对中国检科院动检实验室保存的多批国内临床样品中随机抽取的39份样品进行检测，调查国内南非型FMDV的感染情况。试验结果显示，39份样品中，OD45tl均小于0.502，根据判定标准=OD45tl>0.562时，为阳性；OD45tl介于0.5020.622之间为可疑，介于可疑区间的结果需要重复检测，如重复检测结果仍为可疑则判为阳性；OD45tl<0.502时，为阴性，此次检测结果均可判为阴性，如表6所示。表6临床血清样品的检测结果(OD450)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。权利要求南非II型口蹄疫主要抗原表位的六条多肽，其氨基酸序列分别为GECKYTQTSTAIRGD、HQSRDRFDAPIGV、RFFKEKLFDWTSDK、LGVNRHDQGKRHQA、DGKPYVVTKNNGDK和PGVNTDELPKTPEA，或这六条氨基酸序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。2.权利要求1所述的南非II型口蹄疫病毒主要抗原表位六条多肽的筛选方法，包括如下步骤1)采用软件分析南非II型口蹄疫病毒的三种结构蛋白VP1、VP2和VP3的氨基酸特性，根据这些氨基酸特性设计并合成多肽片段；2)对合成的多肽进行抗原性分析，筛选出6条多肽，其氨基酸序列分别为GECKYTQTSTAIRGD、HQSRDRFDAPIGV、RFFKEKLFDffTSDK,LGVNRHDQGKRHQA、DGKPYVVTKNNGDK禾口PGVNTDELPKTPEA。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，合成多肽的抗原性分析包括反应原性检测及免疫原性检测。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，反应原性检测采用间接ELISA法。5.权利要求1所述的南非II型口蹄疫主要抗原表位的六条多肽在检测南非II型口蹄疫病毒中的应用。全文摘要本发明涉及南非II型口蹄疫病毒主要抗原表位上的六条多肽及筛选方法。六条多肽的氨基酸序列分别位于VP1的132～146和199～211位点，VP2的60～73和163～176位点，VP3的58～71和127～140位点，序列依次为GECKYTQTSTAIRGD、HQSRDRFDAPIGV；RFFKEKLFDWTSDK、LGVNRHDQGKRHQA；DGKPYVVTKNNGDK、PGVNTDELPKTPEA。本发明筛选出的6条多肽抗原性良好，对6条多肽进行动物免疫试验，免疫后的动物产生了高效价的特异性抗体，效价较高，证实其具有良好的免疫原性。文档编号G01N33/53GK101812120SQ201010111010公开日2010年8月25日申请日期2010年2月10日优先权日2010年2月10日发明者吴绍强,李雅静,林祥梅,王彩霞申请人:中国检验检疫科学研究院