专利名称：一种用于动物细胞扩大接种的消化反应器的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于动物细胞培养反应器间扩大接种的消化反应器。
背景技术：
用于重组蛋白、基因治疗用重组病毒和病毒疫苗生产的动物细胞大多具有贴壁依赖的特性，这类细胞必须生长在载体的表面上。在工业化动物细胞培养过程中，在达到最终生产规模前，需要应用一系列逐级扩大的反应器培养种子细胞。反应器间的接种是贴壁细胞扩大培养过程中的关键。
目前文献报道的接种方法主要有三种1.消化接种，其主要过程为利用大量的方瓶或滚瓶培养种子细胞，当细胞长满生长表面时，对这些方瓶或滚瓶依次消化，然后将细胞混于一处接入反应器中，完成接种过程。(Wentz D.and Schugerl K.Enzyme Microb.Technol.，1992，14∶68-75)。
2.原位消化接种，其主要过程为当种子反应器中细胞培养结束后，停止搅拌，待微载体沉降后小心地将培养上清排出，再用缓冲液洗涤，同样小心地排出缓冲液，接着加入胰蛋白酶消化液，消化完成后加入含高浓度血清的培养基，使胰蛋白酶失活。最后经过旋转的振动筛板获得单分散的细胞接入下一级反应器，完成接种过程。(Wilktor，T.J.，Bernard J.，Fanget L.V.，et al.USP 4664912，1987.)。
3.直接接种，其主要方法是将上一级的培养物，直接接入下一级的培养反应器中，旨在通过细胞在新旧载体间的转移完成接种过程。(Hu X.，Xiao C.，Huang Z.，et al.Cytotechnology，2000，3313-19；Cong C.，Chang Y.，Deng J.，et al.，Biotechnol.Lett.2001，23881-885)。
但以上这些方法存在以下不足1.第一种方法仅适用小规模的培养(一般培养体积不能超过3升)，劳动强度大，容易染菌，难以适用于工业化培养过程。
2.第二种方法操作烦琐，每一步操作均需等待微载体充分沉降，这需要耗费相当长的时间，并且不可避免地导致细胞的损失。由于每步操作都很难将液体排除干净，使操作效率降低。胰蛋白酶在培养基中的残留不仅会作用于血清蛋白，从而降低血清的作用，而且也可直接作用于细胞，影响细胞的生长。
3.第三种方法由于细胞在新旧载体间的转移速率和效率很低，大多数细胞仍生长于旧载体上，由于接触抑制，细胞的生长速率很慢，新的微载体上细胞数很少，细胞生长缓慢，甚至有的微载体上没有细胞贴附。这样造成在各微载体间生长差异很大，有的正处于对数生长期，有的已发生衰亡，难以控制细胞生长的单层汇合时间，最终所能达到的细胞密度不高，更重要的是将影响产物的产率。
综上所述，以上方法都不适合工业化应用推广。
发明内容
发明目的本发明的目的在于通过提供一种用于动物细胞培养反应器间扩大接种的消化反应器，并克服现有技术中的前述缺陷。
技术方案为了实现本发明的目的，达到本发明的有益效果，本发明提供了一种用于动物细胞培养反应器间扩大接种的消化反应器，它包括(1)由一筒体构成的消化区，该消化区包括与筒体上端密封连接的盖板，安装于盖板中央，与之可转动且密封连接的搅拌装置，与盖板密封衔接且流体相通的至少一个进料口，与盖板密封衔接且流体相通的至少一个出/入气口；(2)由一底封头构成的与消化区下端周缘密封衔接的分离区，该分离区包括固定于底封头上端面的筛网，所述筛网的孔径大于所述动物细胞直径且小于动物细胞所附着的载体直径，与底封头密封衔接且流体相通的至少一个进/出料口，至少一个洗涤液/消化液入口和至少一个洗涤液/消化液出口。
具体地说，构成本发明上段消化区的主体为一筒体。该筒体的形状一般为圆柱形，其容积与种子培养反应器的体积相当，高径比可为0.5～1.5。该筒体的材料可选用不锈钢或玻璃。
筒体的上端是与之密封连接的盖板。所述盖板的材料选用不锈钢。盖板的中央有一让搅拌装置轴通过的孔。盖板的远离中心的周围有至少一个进料口，用于向筒体内引入来自上级种子罐的培养物，至少一个出/入气口，用于向其中引入用于筒体内压力调节或气氛调节的恒压无菌气体。该气体导管在筒体内的出口位置必须高于液面。所述进料口和出/入气口与按常规密封衔接且流体相通。本发明实施方式中，实现所述盖板与筒体的密封的方式为在盖板法兰内安置密封圈，确保筒体上缘位于密封圈槽内。在盖板和底封头之间对称安装若干紧固螺栓，从而均匀地将盖板，筒体和底封头压紧密封。
本发明搅拌装置的搅拌桨可为直叶桨、箭叶桨、弯叶桨、螺旋桨等桨型，其直径为反应器直径的30-95％，单层或多层组合。其中，底层搅拌桨桨叶下缘距离筛网高度0.3-5厘米。搅拌装置与盖板之间的密封性可转动轴封采用机械轴封或磁力传动密封。
构成本发明分离区主体的是与上述筒体密封衔接的底封头。底封头采用常规生物反应器封头，也可改装成锥型封头。其材料选用不锈钢，利用已知方法与筒体的下端周缘实现严格的密封衔接。本发明实施方式中，实现所述盖板与筒体的密封的方式为在底封头法兰内安置密封圈，确保筒体下缘位于密封圈槽内。在盖板和底封头之间对称安装若干紧固螺栓，从而均匀地将盖板，筒体和底封头压紧密封。
本发明所述的筛网紧压、粘接或焊接在固定环上；固定环放置于底封头内，筛网与底封头法兰位于同一平面，如图2所示。筛网可由市售的不锈钢筛网、尼龙筛网中选用。在选择筛网时必需确保其孔径大于种子细胞直径且小于载体直径，从而确保让消化后从载体上分离的动物细胞能通过筛网，而将空载体和带有细胞的载体截留在筛网上。这样，在消化后细胞从载体表面分离前，可以确保在将带有细胞的载体截留在消化区内的同时将消化液彻底排出消化区，从而避免残留消化液对细胞的伤害。而且，在分离后，上述网孔径可确保将空载体截留在消化区，而让分离下来的单细胞通过筛网进入底封头，继而流向下级反应器。对于给定的动物细胞和载体，本领域技术人员很容易获知有关细胞直径和载体大小的信息，从而可方便地确定所述筛网孔径。在本发明的优选实施方式中，为了避免细胞培养载体粘附在筛网上，堵塞网孔，降低过滤效率，本发明还对筛网表面进行了硅化处理，从而有效避免载体的粘附。筛网的硅化可采用一氯三甲基硅烷或二氯二甲基硅烷(《精编分子生物学实验指南》，科学出版社，1998年)，也可采用六甲基乙硅氧烷(《组织培养和分子细胞学技术》，北京出版社，1995年)该底封头上还有与之密封衔接且流体相通的至少一个进/出料口，至少一个洗涤液/消化液入口和至少一个洗涤液/消化液出口。所述进出料口用于在消化后向本发明反应器内引入培养基，形成单细胞悬液，以便放料。同时，该出口也是所得单细胞悬液的出口，用于将其引出本发明消化反应器，然后进入下一级反应器。
所述洗涤液/消化液入口和洗涤液/消化液出口分别根据需要，由相连管线上的阀门控制，将洗涤液或消化液从下往上引入本发明反应器，在完成各自反应后再从本发明反应器底部出口引出反应器。
在本发明反应器的一般运作过程中，在上级反应器中的培养结束后，含有种子动物细胞的培养料液通过所述盖板上的进料口引入消化反应器消化区，向本发明反应器的空气口中通入适当压力(0.01-0.15MPa恒压)的无菌气体，提高反应器内压力，将培养上清经底封头底部的进/出料口压出消化反应器。或者也可用蠕动泵将培养上清从消化反应器的底部排出。上述即其他引流方法可单用也可联用。经洗涤液/消化液入口，从反应器底部引入洗涤液。洗涤后，洗涤液仍经洗涤液/消化液出口从底部排出。经洗涤液/消化液入口，从消化反应器底部引入消化液。消化期间，搅拌器低速运转，使消化区内的相互反应均匀进行，但仍可保持细胞贴附于载体上。消化反应完成后，消化液仍经洗涤液/消化液出口从底部排出。然后，经底封头底部的进/出料口从底部引入培养基。此时，搅拌器高速运转，使得细胞从载体上完全分离，得到均匀的单分散细胞悬浮液。然后，所得单细胞悬液经底封头底部的进/出料口排出，继而引入下一级细胞培养反应器中。
有益效果本消化反应器的应用可有效改变工业化动物细胞培养过程中的接种方式，可大大地提高细胞大规模培养效率，也为贴壁细胞培养规模的扩大创造了条件。本消化反应器应用范围广泛，可用于CHO、BHK等细胞的工业化培养生产重组蛋白、Vero细胞工业化培养生产病毒疫苗和293细胞工业化培养生产基因治疗用重组腺病毒等各种动物细胞贴壁培养过程，而且操作方便。
图1显示了本发明消化反应器的一种实施方式。
图2显示了本发明消化反应器的筛网固定、安装方式。
图3显示了本发明消化反应器一般性运作过程中的物流走向。
图4显示利用本发明消化反应器在5升反应器接种培养Vero细胞的生长曲线。
具体实施例方式
以下将结合附图举例说明本发明的实施方式。但是需要指出的是，以下具体描述仅以说明为目的，不应将其理解成是对本发明范围的限定。因为，根据以下描述，本领域一般技术人员不难根据本发明构思，推导得出许多等效的改换方式，而这些理应涵盖在本发明的范围之内。
实施例1在CHO细胞的培养中，用本发明的消化反应器实现从1升反应器到5升反应器间的接种。1升反应器内为微载体培养，工作体积为0.7升，5升反应器内为固定床培养，工作体积为3.5升。消化反应器结构如图1所示，流程如图3所示。其中，反应器的容积是3.5升。筒体(7)的材料是玻璃，高为186mm，直径为143mm，盖板(8)的材料为不锈钢，通过其中央通孔(未显示)安装搅拌装置(5)，搅拌装置与盖板采用机械轴封。在盖板内安装密封圈(未显示)。法兰外围均匀分布4个紧固螺栓通孔。盖板与筒体，如前所述，通过法兰，密封圈和紧固螺栓(6)实现密封。本实施例选用弯叶型搅拌器(5)，单层桨叶，桨叶直径为筒体直径的95％。搅拌桨桨叶下缘距筛网的高度为5厘米。该搅拌桨通过固定螺钉与驱动电机轴连接。本实施例的底封头(4)的材料为不锈钢，形状为锥型，封头密封圈槽内放入密封圈(13)，封头法兰(14)外围均匀分布4个紧固螺栓通孔。盖板与筒体，如前所述，通过法兰，密封圈和紧固螺栓(6)实现密封。在底封头内放入安装了筛网的筛网固定环(12)。所述筛网(11)为200目316L不锈钢筛网。CHO细胞的平均直径为15μm，所用载体Cytodex-1的平均直径为180μm，所以本实施例选择孔径约为60微米的筛网。用2％的三甲基氯硅烷的氯仿溶液对筛网进行硅化处理。
运行时，首先在消化反应器中装磷酸缓冲液，121℃消毒后分别通过进料口(10)与1升的种子反应器，通过进/出料口(3)与5升反应器无菌连接。当1升反应器中的细胞密度到每毫升1.0×106细胞数时，用无菌空气将1升反应器中的培养料液经进料口(10)压入消化反应器，然后通过出/入气口(9)引入0.1MPa恒压无菌空气，升高反应器内压力，使培养上清经消化反应器的底部的进/出料口(3)排净，同时将吸附有细胞的载体截留在筛网上。经底部洗涤液/消化液入口(1)引入预热到37℃的洗涤液。启动搅拌器，每分钟20转，边搅拌边洗涤1分钟。如前所述升高反应器内压力，令洗涤液通过洗涤液/消化液出口(2)排净。经底部洗涤液/消化液入口(1)引入预热到37℃的消化液。启动搅拌器，每分钟20转，边搅拌边消化6分钟。如前所述升高反应器内压力，令洗涤液通过洗涤液/消化液出口(2)排净。经底封头底部中央的进/出料口(3)向消化反应器内引入预热到37℃的培养基。启动搅拌器，每分钟120转，搅拌6分钟。如前所述升高反应器内压力，使所得的均匀单细胞悬液经进/出料口(3)从本发明消化反应器排出，然后泵送到下一级5升反应器中灌注培养，接种密度为每毫升2×105细胞数。培养11天后细胞密度达到每毫升1.2×107细胞数。
实施例2在Vero细胞的培养中，用本发明的消化反应器实现从1升反应器到5升反应器间的接种。1升反应器为微载体培养，工作体积为0.7升，5升反应器为固定床培养，工作体积为3.5升。消化反应器结构如图1所示，流程如图3所示。其中，反应器的容积是3.5升。筒体(7)的材料是玻璃，高为186mm，直径为143mm，盖板(8)的材料为不锈钢，通过其中央通孔(未显示)安装搅拌装置(5)，搅拌装置与盖板采用机械轴封。在盖板内安装密封圈(未显示)。法兰外围均匀分布4个紧固螺栓通孔。盖板与筒体，如前所述，通过法兰，密封圈和紧固螺栓(6)实现密封。本实施例选用弯叶型搅拌器(5)，单层桨叶，桨叶直径为筒体直径的30％。搅拌桨桨叶下缘距离筛网的高度为0.3厘米。该搅拌桨通过固定螺钉与驱动电机轴连接。本实施例的封头(4)的材料为不锈钢，形状为锥型，封头密封圈槽内放入密封圈(13)，封头法兰(14)外围均匀分布4个紧固螺栓通孔。盖板与筒体，如前所述，通过法兰，密封圈和紧固螺栓(6)实现密封。在底封头内放入安装了筛网的筛网固定环(12)。所述筛网(11)为200目316L不锈钢筛网。Vero细胞的平均直径为15μm，所用载体Cytodex-1的平均直径为180μm，所以本实施例选择孔径约为60μm的筛网。用10％的三甲基氯硅烷的氯仿溶液对筛网进行硅化处理。
运行时，首先在消化反应器中装磷酸缓冲液，121℃消毒后分别通过进料口(10)与1升的种子反应器，通过进/出料口(3)与5升反应器无菌连接。当1升反应器中的细胞密度到每毫升1.3×106细胞数时，用无菌空气将1升反应器中的培养料液经进料口(10)压入消化反应器，然后通过出/入气口(9)引入0.1MPa恒压无菌空气，升高反应器内压力，使培养上清经消化反应器的底部的进/出料口(3)排净，同时将吸附有细胞的载体截留在筛网上。经底部洗涤液/消化液入口(1)引入预热到37℃的洗涤液。启动搅拌器，每分钟20转，边搅拌边洗涤1分钟。如前所述升高反应器内压力，使洗涤液通过洗涤液/消化液出口(2)排净。经底部洗涤液/消化液入口(1)引入预热到37℃的消化液。启动搅拌器，每分钟20转，边搅拌边消化6分钟。如前所述升高反应器内压力，令洗涤液通过洗涤液/消化液出口(2)排净。经底封头底部中央的进/出料口(3)向消化反应器内引入预热到37℃的培养基。启动搅拌器，每分钟120转，搅拌6分钟。如前所述升高反应器内压力，使所得的均匀单细胞悬液经进/出料口(3)从本发明消化反应器排出，然后泵送到下一级5升反应器中灌注培养，接种密度为每毫升2.6×105细胞数。培养4天后细胞密度达到每毫升1.6×106细胞数。图4是利用本实施例消化反应器在5升反应器接种培养Vero细胞的生长曲线。
权利要求
1.一种用于动物细胞培养反应器间扩大接种的消化反应器，它包括(1)由一筒体构成的消化区，该消化区包括与筒体(7)上端密封连接的盖板(8)，安装于盖板中央，与之可转动且密封连接的搅拌装置(5)，与盖板密封衔接且流体相通的至少一个进料口(10)，与盖板密封衔接且流体相通的至少一个出/入气口(9)；(2)由一底封头(4)构成的与消化区下端周缘密封衔接的分离区，该分离区包括固定于底封头上端面的筛网(11)，所述筛网的孔径大于所述动物细胞直径且小于动物细胞所附着的载体直径，与底封头密封衔接且流体相通的至少一个进/出料口(3)，至少一个洗涤液/消化液入口(1)和至少一个洗涤液/消化液出口(2)。
2.根据权利要求1所述的消化反应器，所述筛网是硅化处理过的。
3.根据权利要求1所述的消化反应器，所述搅拌装置的搅拌桨直径为所述筒体直径的30-95％。
4.根据权利要求1所述的消化反应器，所述搅拌装置具有弯叶桨。
5.根据权利要求1所述的消化反应器，所述搅拌装置具有单层桨叶，桨叶下缘距离所述筛网的高度为0.3-5厘米。
全文摘要
本发明提供了一种用于动物细胞培养反应器间扩大接种的消化反应器，它具有消化区和分离区两段式结构，两区间由筛网间隔。
文档编号C12M1/26GK1483805SQ02137069
公开日2004年3月24日 申请日期2002年9月20日 优先权日2002年9月20日
发明者张元兴, 孙祥明, 范卫民, 陆健 申请人:华东理工大学