专利名称：端粒酶活性的定量测定方法
技术领域：
本发明涉及细胞中端粒酶活性的测定方法，特别涉及一种端粒酶活性的非放射性定量测定方法在真核生物的线性染色体的末端存在一种由一系列串联重复序列及其相关蛋白所组成的结构——端粒，人端粒的重复序列为5’-TTAGGG-3’。端粒具有重要的生物学功能，其中最被关注的是其在细胞衰亡和恶变中的作用。在大多数的真核生物中端粒长度的维持都是依赖一种核糖核蛋白体——端粒酶的作用来实现的。同所有核糖核蛋白体一样，端粒酶也是由RNA组分和蛋白组分共同组成的；同时又是一种特殊的逆转录酶，它可以以其自身的RNA为模板从头合成端粒序列并添加到染色体的末端以维持端粒的长度。除了生殖细胞等少数细胞外，正常体细胞端粒酶活性一般均呈阴性，而85％以上的人体恶性肿瘤细胞端粒酶活性均为阳性。显然，这可以作为临床肿瘤诊断的一个指标，也可作为肿瘤治疗的一个潜在靶点。由于端粒和端粒酶与细胞的寿限控制及恶变有关，它已成为近年来生物学发展的热点(董为人等，生理科学进展.1997,28:274-276)。
端粒酶活性的检测乃是研究端粒酶的基本手段，Kim等于1994创立的TRAP方法(telomere repeat amplification protocol)对于端粒酶研究的发展起到了重要的作用(Kim et al,Science.1994,266:2011-2015)。但TRAP法本身又存在许多问题1．需要应用同位素。2．在细胞蛋白的粗提物中有端粒酶的非特异抑制因子或Taq DNA聚合酶的抑制因子的存在，从而造成假阴性。3．由于引物二聚体(primer dimer)的形成，可以造成假阳性的结果(Krupp et al,Nucleic Acids Res.1997,25:919-921)。4．无法定量，从而使该领域的精确研究无法进行。1997年Kim又发展了端粒酶的定量检测方法-定量TRAP法(Kim et al,Nucleic Acids Res.1997,25:2595-2597)，该方法包括含端粒酶的S-100细胞抽提液的制备，其中洗涤过程为先用洗涤缓冲液洗一次，再用磷酸盐缓冲液洗二次；用[γ-32P]ATP标记TS引物，需要应用放射性同位素；端粒酶介导的端粒重复序列的延伸；PCR扩增端粒酶作用产物，扩增结果的分析，因扩增产物中含有放射性同位素因而电泳时操作不方便，同时通过放射自显影来分析结果增加了实验的操作步骤、延长了实验周期；结果的定量分析利用公式TPG={[(TP-TP’)/TI]/[(R8-B)/RI]}其中TPG为表示端粒酶活性水平高低的指标；TP为待定量的细胞提取液所得条带的放射强度；TP’为热灭活后待定量的细胞提取液所得条带的放射强度；TI为待定量的细胞提取液的内部参照所得条带的放射强度；R8为定量参照所得条带的放射强度(反应体系中的量为0.1amol时为标准)；B为只加裂解液所得条带的放射强度；RI为R8的内部参照所得的条带的放射强度。因该方法仍需要采用放射性同位素示踪，故存在操作不方便、重复性差和周期较长等缺点，从而造成了该方法的局限性。
为此，本发明的目的是在于建立一种操作更方便、重复性更好和实验周期更短的无放射性玷污的端粒酶活性定量测定方法。在灵敏性方面和在避免Taq DNA聚合酶抑制剂所引起的假阴性及引物二聚体引起的假阳性方面同已有技术报道的TRAP放射定量法相比也相当。
本发明端粒酶活性的非放射性定量测定方法对前述的1997年Kim的TRAP方法中存在的缺点进行了改进，本发明方法包括下列步骤1．含端粒酶的S-100细胞抽提液(Kim et al,Science.1994,266:2011-2015)的制备直接取待抽提细胞用磷酸盐缓冲液洗一次，与Kim法相比减少了洗涤缓冲液的洗涤，操作更简便。接着离心沉淀细胞，用冰预冷的裂解缓冲液悬浮细胞，悬浮物在冰上孵育，期间振荡。此后，离心收集上清，此即为S-100细胞抽提液，储存于-20℃--80℃，并进行蛋白定量。
2．端粒酶介导的端粒重复序列的延伸在TRAP缓冲液加入dNTPs,无放射性的TS[5’-AATCCGTCGAGCAGAGTF-3’]引物，和S-100含端粒酶的细胞抽提液。
由于采用无放射性的TS引物，减少了标记步骤，使操作更简便。温育反应混合物，温度在15℃-37℃之间。
3．加入反向引物和内标引物及TaqDNA聚合酶反向引物ACX[5’-GCGCGG[CTTACC]3CTAACC-3’]，内部参照引物NT[5’-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3’]，TSNT,[5’-AATCCGTCGAGCAGAGTFAAAAGGCCGAGAAGCGAT-3’]，TaqDNA聚合酶，4．PCR扩增端粒酶作用产物5．扩增结果的分析聚丙烯酰胺凝胶电泳，可采用SYBR Green I,SYBR Golden或EB等荧光染料染色，其中SYBR Green I为最佳。用SYBR Green I染色(5-30分钟)，在紫外拍照和分析装置上分析。由于使用SYBR Green I等染色来代替Kim的TRAP法中的同位素放射自显影，使本发明方法更方便、实验周期更短、重复性更好，同时消除了放射性同位素的玷污。
6．定量分析利用公式TPG={[(TP-B)/TI]/[(R8-B)/RI]}其中TP为待定量的细胞提取液所得条带灰度TI为待定量的细胞提取液的内部参照所得条带灰度
R8为定量参照所得条带灰度(反应体系中的量为0.1amol时为标准)B为只加裂解液所得条带灰度RI为R8的内部参照所得的条带灰度在定量分析的计算公式中使用B以改进Kim的TRAP法中的端粒酶热灭活后所得条带的放射性强度TP’，这样可避免实验操作造成的误差提高了可重复性。
每组反应均包括空白裂解抽提缓冲液对照和R8定量标准。
本发明参考Kim法中采用的反向引物ACX。通过在反向引物CX的5’端加上既不是定量重复序列又不和端粒序列互补的序列形成，同时对反向引物的内部序列进行改造形成ACX，这样就有效地消除了引物二聚体所造成的假阳性的结果。内部参照引物TSNT的应用，一方面由于它不仅可以被TS引物扩增，还可以被NT引物延伸，而NT引物则不是端粒酶作用的底物，不能被端粒酶延伸，这样就增加了反应的动力学范围。另一方面，内部参照引物的应用可以区别因细胞抽提物中存在Taq DNA聚合酶的抑制因子所造成的假阴性结果。因为如果是上述原因造成的假阴性结果，则作为内部参照的36bp的条带同样不会出现[图1，第3泳道的样品就存在Taq DNA聚合酶的抑制因子]。这对临床检测具有十分重要的意义。而用人工合成的端粒酶作用产物R8作为定量的内部参照，则不会出现因参照的不稳定而影响定量的准确性和可重复性。
以BEL-7404人肝癌细胞为实验材料，用本发明端粒酶活性的定量测定方法检测BEL-7404人肝癌细胞端粒酶抽提物中的端粒酶活性，以验证本发明方法的特异性。结果表明端粒酶抽提物可以产生典型的相隔6bp的电泳条带[图1，第3泳道]；而作为对照的空白抽提液(不含端粒酶)不能产生这种特异条带[图1，第1泳道]；当对端粒酶抽提物进行热处理或同RNase A反应后，端粒酶所介导产生的相隔6bp的条带随即消失[图1，第4,5泳道]。
以SMMC-7721细胞为实验材料，以本发明端粒酶活性的定量测定方法同Kim1997年建立的放射性同位素标记的定量方法进行比较，结果表明本发明建立的非放射性定量方法与放射性同位素标记的TRAP定量方法在灵敏性方面几乎在同一水平，均可检测到相当于10个细胞的端粒酶活性[图2，图3的第8泳道]。用Kim法(1997)重复测定3次，R2值(决定系数)分别为0.9372,0.9431和0.7518，而用本发明的非放射性定量法其R2值则分别为0.9447,0.9444和0.9052，准确性更高。同样，图中的曲线也显示我们的方法重复性更好[参见图4]。
人正常肝细胞和四种人肝癌细胞(BEL-7404,SMMC-7721,QGY-7903和HCCM)为实验材料来检测端粒酶在正常和恶变的肝细胞中的表达。具体操作过程见实施例，结果见图5。图5结果表明端粒酶在正常人肝细胞中为阴性而在四种人肝癌细胞株(BEL-7404,SMMC-7721,QGY-7903和HCCM)中则均有表达，其活性分别为75.0,57.5,51.1和77.3 TPG。说明端粒酶是肝癌细胞特异的。
本发明优点同国际上目前最先进的Kim放射性定量法相比，本发明的优点是1．无放射性玷污。2．端粒酶活性定量测定的步骤更简化。减少了洗涤步骤、放射性探针标记步骤和放射自显影步骤。3．更快速，实验周期更短，可在一天内得到端粒酶活性测定的定量结果(而放射法则至少需要两天)。4．重复性更好。5．在灵敏性方面和在避免Taq DNA聚合酶抑制剂所引起的假阴性及引物二聚体引起的假阳性方面同Kim放射性定量法相比也相当。
图1．以BEL-7404人肝癌细胞为实验材料验证本发明端粒酶活性的定量测定方法的特异性的电泳图。
1．空白裂解抽提液对照2．R8定量标准3．1ug总蛋白的BEL-7404细胞中的端粒酶活性4．RNase A处理的BEL-7404细胞抽提液中的端粒酶活性(5mg/ml,37℃,20分钟)5．热处理的BEL-7404细胞抽提液中的端粒酶活性(75℃,15分钟)图2．以SMMC-7721人肝癌细胞为实验材料用本发明非放射性定量方法测定不同细胞数的端粒酶活性的电泳图1．空白裂解抽提液对照 2．R8定量标准3．2500细胞的端粒酶活性4．1000细胞的端粒酶活性5．500细胞的端粒酶活性 6．100细胞的端粒酶活性7．50细胞的端粒酶活性 8．10细胞的端粒酶活性图3．以SMMC-7721人肝癌细胞为实验材料用放射性同位素标记的定量方法测定不同细胞数的端粒酶活性的电泳图1．空白裂解抽提液对照 2．R8定量标准3．2500细胞的端粒酶活性 4．1000细胞的端粒酶活性5．500细胞的端粒酶活性 6．100细胞的端粒酶活性7．50细胞的端粒酶活性 8．10细胞的端粒酶活性图4．以SMMC-7721人肝癌细胞为实验材料比较端粒酶活性测定的放射性同位素标记的定量方法(RL)与非放射性定量方法(NR)的准确性和可重复性的线性关系5．测定人正常肝细胞和四种肝癌细胞株中端粒酶活性的电泳图1．空白裂解抽提液对照2．R8定量标准3．正常人肝细胞的端粒酶活性4．BEL-7404人肝癌细胞株端粒酶活性5．SMMC-7721人肝癌细胞株端粒酶活性6．QGY-7404人肝癌细胞株端粒酶活性7．HCCM人肝癌细胞株端粒酶活性实施例1以人正常肝细胞为实验材料用本发明方法进行的定量测定1．含端粒酶的S-100细胞抽提液(Kim et al,Science.1994,266:2011-2015)的制备(1)直接取5-10×105的人正常肝细胞用磷酸盐缓冲液洗一次。
(2)在4℃,2,000rpm离心5分钟,使之沉淀。
(3)用冰预冷的裂解缓冲液[10mmol/L tris-HCl(PH7.5),lmmol/LMgCl2,1mmol/L EGTA,0.1mmol/L PMSF,5mmol/Lβ-巯基乙醇，0.5％CHAPS(pierce),10％甘油]悬浮，用量为20微升/104-105细胞。
(4)悬浮物在冰上孵育30min。期间在约20min时振荡。
(5)在4℃,12,000g，用微超速离心机离心30min。
(6)转移上清，上清转移在冰上操作。
(7)储存于-70℃。
(8)取上清用Bradford法进行蛋白定量。
2．端粒酶介导的端粒重复序列的延伸(1)在50ul的TRAP缓冲液[20mmol/L tris-HCl(PH8.3),1.5mmol/LMgCl2,63mmol/L KCl,0.005％Tween-20,1mmol/L EGTA]反应体系中加入50umol/L的dNTPs，无放射性的0.1ug TS[5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’]引物1ug总蛋白的S-100细胞抽提液(2)反应混合物在30℃预热，尔后在30℃温育30分钟。
3．加入反向引物和内标引物及TaqDNA聚合酶0.1ug的ACX[5’-GCGCGG[CTTACC]3CTAACC-3’]引物，0.1ug的内部参照引物NT[5’-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3’]，0.01amol的引物TSNT[5’-AATCCGTCGAGCAGAGTTAAAAGGCCGAGAAGCGAT-3’]，2U的TaqDNA聚合酶，4．PCR扩增端粒酶作用产物94℃,30秒；60℃,30秒；72℃,60秒；循环30次5．扩增结果的分析12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，120v,3小时。
用SYBR Green I(1∶10000)染色15分钟，在紫外拍照和分析装置上分析。
6．定量分析利用公式TPG={[(TP-B)/TI]/[(R8-B)/RI]}其中TP为待定量的细胞提取液所得条带灰度TI为待定量的细胞提取液的内部参照所得条带灰度R8为定量参照所得条带灰度(反应体系中的量为0.1amol时为标准)B为只加裂解液所得条带灰度RI为R8的内部参照所得的条带灰度图5中结果表明端粒酶活性在正常人肝细胞中为阴性。
实施例2以人肝癌细胞株BEL-7404为实验材料用本发明方法进行测定，测定步骤同实施例1。结果见图5，端粒酶在BEL-7404人肝癌细胞中有表达，活性为75.0TPG。
实施例3以人肝癌细胞株SMMC-7721为实验材料用本发明方法进行测定，测定步骤同实施例1。结果见图5，端粒酶在SMMC-7721人肝癌细胞中有表达，活性为57.5TPG。
实施例4以人肝癌细胞株QGY-7903为实验材料用本发明方法进行测定，测定步骤同实施例1。结果见图5，端粒酶在QGY-7903人肝癌细胞中有表达，活性为51.1TPG。
实施例5以人肝癌细胞株HCCM为实验材料用本发明方法进行测定，测定步骤同实施例1。结果见图5，端粒酶在HCCM人肝癌细胞中有表达，活性为77.3TPG。
权利要求
1．一种端粒酶活性的定量测定方法，包括下列步骤含端粒酶的S-100细胞抽提液的制备；端粒酶介导的端粒重复序列的延伸；PCR扩增端粒酶作用产物；扩增结果的分析和利用计算公式进行定量分析，其特征在于在含端粒酶的S-100细胞抽提液的制备步骤中，直接取待抽提细胞用磷酸盐缓冲液洗一次；在端粒酶介导的端粒重复序列的延伸步骤中，在TRAP缓冲液中加入无放射性的TS[5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’]引物；在扩增结果的分析步骤中，电泳结果采用荧光染料染色；在利用计算公式进行定量分析步骤中，利用公式TPG={[(TP-B)/TI]/[(R8-B)/RI]}其中TP为待定量的细胞提取液所得条带灰度TI为待定量的细胞提取液的内部参照所得条带灰度R8为定量参照所得条带灰度(反应体系中的量为0.1amol时为标准)B为只加裂解液所得条带灰度RI为R8的内部参照所得的条带灰度
2．如权利要求1所述的端粒酶活性的定量测定方法，其特征在于在扩增结果的分析步骤中，电泳结果采用荧光染料SYBR Green I进行染色。
全文摘要
一种端粒酶活性的定量测定方法,包括含端粒酶的S－100细胞抽提液的制备;端粒酶介导的引物延伸反应;PCR扩增反应产物以及通过DNA荧光染料染色来进行的结果分析。本发明还具有下列优点:无放射性玷污,端粒酶的定量测定的步骤更简化,实验周期更短,重复性更好。在灵敏性方面和在避免Taq DNA聚合酶抑制剂所引起的假阴性及引物二聚体引起的假阳性方面同Kim放射性定量法相比也相当。
文档编号C12Q1/25GK1319675SQ00111629
公开日2001年10月31日 申请日期2000年1月28日 优先权日2000年1月28日
发明者张如刚, 谢弘, 来文, 王放, 陈中建 申请人:中国科学院上海细胞生物学研究所