专利名称：一种端粒酶活性的检测方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种端粒酶活性的检测方法。
背景技术：
端粒酶是一种核糖核蛋白，含有蛋白质及与端粒DNA互补的自身RNA模板，催化合成并维持端粒的一定序列。端粒在不同物种细胞中对于保持染色体稳定性和细胞活性有重要作用，端粒酶能延长缩短的端粒(缩短的端粒其细胞复制能力受限)，从而增强体外细胞的增殖能力，在保持端粒稳定、基因组完整、细胞长期活性和潜在的继续增殖能力等方面有重要作用。但是，在正常人体细胞中，端粒酶的活性受到相当严密的调控，只有在造血细胞、 干细胞和生殖细胞，这些必须不断分裂克隆的细胞之中，才可以侦测到具有活性的端粒酶。 当细胞分化成熟后，必须负责身体中各种不同组织的需求，各司其职，于是，端粒酶的活性就会渐渐的消失。“端粒-端粒酶假说”认为端粒酶的激活与细胞永生化和恶性肿瘤的发生、发展密切相关。研究发现，绝大多数肿瘤细胞都成端粒酶阳性，而在癌旁组织和正常组织中端粒酶阳性率很低，基于上述原因，端粒酶可以作为肿瘤标志物应用于临床研究和检验。因此，端粒酶活性的检测已经成为生物科学和肿瘤学研究的热点。最早的端粒酶活性检测方法是 1985年提出的，该方法通过细胞提取物与合成的寡核苷酸保温，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和进行放射自显影，检测寡核苷酸末端加入的端粒重复片段，并由此在四膜虫中首次发现了端粒酶的存在。由于这个方法的灵敏度较低，检测时需要大量的细胞抽提物，因此其应用受到了很大的限制，只能检测少数种类样本的端粒酶活性，如低等真核生物或一些永生化细胞，对于高等生物端粒酶活性检测则无能为力。TRAP法出现后，端粒酶研究有了飞速发展，可以大量应用到各种临床样本检测。该方法分为两步，首先端粒酶延伸非端粒引物TS，生成端粒重复序列，然后在TS和端粒序列互补引物CX作用下，进行PCR扩增，产物再经电泳和放射性显影检测。但由于PCR反应的反向引物是端粒重复的互补序列，可结合在端粒重复序列的任意部位，导致PCR产物长度发生变化(变长或变短)，不能如实反映端粒酶的持续合成能力。 TRAP法中PCR扩增要求在每个扩增循环中，两个引物结合到模板DNA的3'末端，这样扩增产物才能表现为不均一长度的电泳条带。在TRAP反应中，引物TS是随机序列，它与模板专一结合；引物CX是端粒互补序列，它可结合在端粒酶延伸产物的任何部位。因此PCR扩增产物的长度发生变化，这种变化有一定随机性，在扩增的每一个循环中CX的结合位点都会发生改变。结果是扩增的产物越来越短。另一方面，PCR扩增产物也可能比原初端粒酶产物长，因为CX引物是4个CCCTAA构成的重复，在PCR引物退火时，它可以用其中3个重复与模板的3’末端发生交错退火，最后一个重复作为模板延伸端粒酶产物的3'末端。这样每一个循环后，PCR产物将延伸6个bp，多个循环后，将使原初产物的长度有较大的延长。因此TRAP法无法反映端粒酶延伸产物最初的性质，包括产物的长度和含量。
其次，由于在TRAP反应中，反向引物CX是端粒重复互补序列，而端粒酶底物 TS虽然被称为非端粒序列，但为了实现端粒酶对底物的识别和延伸，TS引物的3'末端 (AGAGTT)实际上是端粒序列，有5个与端粒序列一致，只有中间的A不同于端粒序列。因此TS在PCR反应中很容易与反向引物CX形成3'末端互补，进而形成引物二聚体。这个二聚体较短，在随后的PCR扩增中很容易形成优势，干扰真正端粒酶产物的扩增。而且引物二聚体还可通过上面所述与CX交错退火的延长机制，形成人工产物(artifact)，人工产物经 PCR扩增后也表现为间隔6个bp的ladder，与真正的扩增产物无法区分，造成假阳性结果。再次，利用TRAP法检测持续合成能力较差的端粒酶活性时由于其末端较短，不利于PCR扩增，因而检测不到端粒酶活性，限制了 TRAP反应的实际应用效果。此外，TRAP技术检测端粒酶活性需要电泳及银染或者放射性同位素标记，方法十分繁杂，比较费时，而且使用放射性同位素，有一定的危害，且污染物处理比较困难，限制了 TRAP法应用。因此，提供一种灵敏度更高、特异性更强的端粒酶检测方法具有现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种端粒酶活性的检测方法。该检测方法从待测样品中获得具有活性的端粒酶后，延伸TS引物得到端粒酶延伸产物，将端粒酶延伸产物作为模板， 在四个引物的存在下，进行缺刻连接酶链式反应扩增，得到扩增产物，将该扩增产物与分子信标混合反应后荧光检测或电泳检测得到端粒酶活性。该检测方法灵敏度高、特异性好，能够有效检测待测样品中的端粒酶活性。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案一种端粒酶活性的检测方法，包括步骤1 从待测样品中获得端粒酶；步骤2 在所述端粒酶的作用下延伸具有如SEQ ID NO=I所示核苷酸序列的TS引物，得到端粒酶延伸产物；步骤3 将所述端粒酶延伸引物作为模板，在引物存在下进行缺刻连接酶链式反应扩增，得到扩增产物；步骤4 对所述扩增产物进行检测，得到所述端粒酶活性。连接酶链式反应(LigaseChain Reaction, LCR)是 Landegren 等人于 1988 年为检出序列中点突变而设计、发明的。合成一对引物A、B，它们完成覆盖了靶序列。经退火与靶序列结合后，A、B间留下一个缺刻(nick)，加入连接酶封闭缺品，两引物与靶序列完整的互补链。Wu等人又引入PCR的原理，在连接反应后，变性、退火、再连接，少量的靶序列就被扩增出来。Barany于1991年报道了耐热连接酶-Taq连接酶的发现及其在LCR中的应用， 为LCR的实用化奠定了基础。实际操作时引物为4个，A、A’和B、B’，分别与靶序列的正负链互补。每次连接反应的产物又可在下一轮反应中当模板，靶序列以指数形式扩增出来。连接酶链式反应的特异性首先取决于引物与模板的特异结合，其次Taq连接酶作用的特异性，即Taq连接酶是否仅连接与靶序列完全互补的引物。实验表明Taq连接酶的非特异连接活性是较低的(< )。控制模板、酶的浓度，使反应在接近Taq酶的温度下进行，还可进一步降低非特异连接率。连接酶链式反应的扩增效率与PCR相当。由于有很高的信噪比，其敏感性也很高，产物检测也非常方便、敏感。
本发明提供的检测方法中，设计了具有如SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的TS引物 (5' AATCCGTCGAGCAGAGTT3')，随后将端粒酶延伸引物作为模板，在引物存在下进行缺刻连接酶链式反应扩增，得到扩增产物，检测得到端粒酶活性，避免了 TS在PCR反应中很容易与反向引物CX形成3'末端互补，进而形成引物二聚体，在随后的PCR扩增中很容易形成优势，干扰端粒酶产物的扩增，同时避免了引物二聚体通过与CX交错退火的延长机制形成的人工产物经PCR扩增后造成的假阳性结果。为了提高本发明提供的检测方法的特异性，涉及并筛选了大量引物。作为优选，步骤3中所述缺刻连接酶链式反应扩增的引物为Ρ”Ρ2、Ρ3和P4，其中P1具有SEQ ID NO 2所示核苷酸序列(5 ‘ -GCAATCCGTCGAGCA-3' )，P2具有SEQ ID NO 3所示核苷酸序列(5 ‘-AGTTAGGGTTAGGGGCTCTCTTTACTGTG-3' )，P3 具有 SEQ ID NO :4 所示核苷酸序列(5 ‘ -CACAA TGGGCGCACCCCCTAACCCTAAC-3 ‘ )，P4具有SEQ ID NO 5所示核苷酸序列的所示核苷酸序列 (5 ‘ -TCTGCTCGACGGATTGC-3‘)。分子信标(molecular beacon)是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针， 两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。分子信标的茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团标记在探针的一端，而淬灭剂则标记在另一端。在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构，当加热变性会互补配对的茎环双链解开，如果有模板存在环序列将与模板配对，与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭剂分开。因此该探针可以灵敏的检测目标序列，具体到本发明中，可以灵敏地检测步骤3中所述扩增产物。与底物相比扩增产物为具有较长茎结构的双链信标靶序列，可以在作为信标靶序列打开信标，通过荧光检测，可以获得端粒酶活性。作为优选，本发明步骤4中所述检测为将步骤3中所述扩增产物与如SEQ ID NO 6 所示核苷酸序列(5' FAM-CGTTGCACAAAGACCCGGGACACAAGTGCAACG-DABCY3')的分子信标混合反应后进行荧光检测。优选地，本发明提供的端粒酶活性检测方法具体可以包括步骤1 从待测样品中获得具有活性的端粒酶；步骤2 在所述端粒酶的作用下延伸具有如SEQ ID NO=I所示核苷酸序列的TS引物，得到端粒酶延伸产物；步骤3:将所述端粒酶延伸引物作为模板，在？1、？2、&、？4四个引物的存在下，进行缺刻连接酶链式反应扩增，得到扩增产物；其中，P1具有如SEQ ID NO :2所示核苷酸序列， P2具有如SEQ ID NO 3所示核苷酸序列，P3具有如SEQ ID NO 4所示核苷酸序列，P4具有如SEQ ID NO 5所示核苷酸序列。步骤4:将所述扩增产物与如SEQ ID NO :6所示核苷酸序列的分子信标混合反应后，荧光或电泳检测所述端粒酶活性。本发明提供的端粒酶活性的检测方法，先从提取细胞或者组织的端粒酶产物，然后在端粒酶作用下延伸TS引物，使得TS引物延伸两个以上的TTAGGG重复序列，取部分端粒酶延伸引物作为模板进行缺刻连接酶链式反应扩增，与底物相比扩增产物为具有较长茎结构的双链信标靶序列，可以在作为信标靶序列打开信标，通过荧光检测，可以获得端粒酶活性。端粒酶的提取方法2X IO6个细胞沉淀/组织0. Img加CHAPS裂解液(lOmmol/ L Tris-HCl, pH 7. 5, lmmol/L MgCl2, lmmol/L EGTA，0. lmmol/L PMSF，5mmol/L 巯基乙醇， 0. 5 % w/v CHAPS (3- [ (3-胆酰胺丙 基)-二乙铵]-丙磺酸)，10 % w/v甘油)200 μ L，冰浴裂解30min，期间用移液器反复抽吸3次，保证充分裂解。HOOOrpm离心20min，吸取上清置-80°C保存备用。作为优选，所述步骤2中延伸的体系为50 μ L体系中，10XTRAP缓冲液 (200mmol/L Tris-HCl, pH 8. 3,15mmol/L MgCl2,1% Tween-20,630mmol/L KCl,lOmmol/L EGTA) 5 μ L，dATP、dTTP 和 dGTP 各 50 μ mol/L, TS 引物为 150nmol/L，余量为无菌 DEPC 水。作为优选，所述步骤2中延伸的反应条件为25°C保温20min。优选地，所述步骤2中延伸的反应条件为48 μ L延伸反应体系中加入2 μ L端粒酶抽提物(ι μ g)，25°c保温20min，反转录合成端粒酶延伸产物。作为优选，所述步骤3中扩增的反应条件为90°C 30 60s，45 61°C 3 8min， 22 35个循环。作为优选，所述步骤3中扩增的反应体系为10XTaq ligase buffer IOv%, 50% PEG 0. 05 12. 5v%, P1, P2、P3、P4 终浓度分别为 100 500nmol/L，Went (exo-)DNA polymerase 0. 2 0. 5U/20 μ L 体系，9° N ligase 2 4U/20 μ L 体系，所述步骤 2 得到的端粒酶延伸产物0. 05ν%，余量为无菌水。作为优选，所述步骤3中扩增的体系为20μ 体系中，IOXTaq ligase buffer 2μ L,50% PEG 1 2· 5 μ I^PpPyPyP4 各 100 500nmol/L，Went (exo_)DNA polymerase 0. 2 0. 5U，9° N ligase 2 4U，所述步骤2得到的端粒酶延伸产物1 μ L，余量为无菌水。优选地，所述步骤3中扩增的体系为20yL体系中，IOXTaq ligase buffer 2μ L,50% PEG 2μ L, P1^ P2> P3> P4 # 500nmol/L, Went (exo-)DNA polymerase 0.4U，9° N ligase 4U，所述步骤2得到的端粒酶延伸产物1 μ L，余量为无菌水。作为优选，所述步骤3中扩增前，还包括90°C加热3min灭活端粒酶后补充dGTP 2 8μ mol/L的步骤。优选地，所述步骤3中扩增前，还包括90°C加热3min灭活端粒酶后补充dGTP 5 μ mol/L的步骤。优选地，反应液90°C加热3min灭活端粒酶，然后补充dGTP 5 μ M0然后进行连接酶链式扩增，反应条件90°C 30s, 48°C 8min,22 24个循环。连接酶链式反应过程要连续进行，任何中断将导致反应失败。为了避免银染或者放射性同位素标记操作繁琐且危害人体，本发明提供的检测方法，步骤4中采用荧光检测或电泳检测的方法，对扩增产物进行检测。作为优选，所述步骤4中荧光检测的反应条件为61°C水浴锅温浴30min，加入所述扩增产物平衡5min。作为优选，以体积分数计，所述步骤4中荧光检测的反应体系为10% 50 IOOmmol/L 的 Tris，0. 04% 1 5μ mol/L 的所述分子信标，0. 004 0. 008% 250mmol/L 的 MgCl2，余量为无菌水。
作为优选，所述步骤4中荧光检测的反应体系为250μ 体系中，25μ 50 IOOmmol/L 的 Tris，10 μ L 1 5 μ mol/L 的所述分子信标，1 2 μ L250mmol/L 的 MgCl2,余量为无菌水。优选地，所述步骤4中荧光检测的反应体系为250μ L体系中，25 μ L 1 OOmmo 1/L 的Tris，10 μ L 1 μ mol/L的所述分子信标，1 μ L 250mmol/L的MgCl2，余量为无菌水。作为优选，所述步骤4中荧光检测条件为以495nm荧光激发，510 620nm荧光检测。优选地，将检测体系于61°C水浴锅温浴，30min，加入连接产物平衡5min后以 495nm荧光激发，510 620检测荧光。端粒酶活性越强，荧光值越高。端粒酶端粒酶活性越弱则荧光值越低。同时可以通过电泳的方式检测长链产物的多少印证荧光检测的准确性。本发明提供的端粒酶活性检测方法，从待测样品中获得具有活性的端粒酶后，延伸TS引物得到端粒酶延伸产物，将端粒酶延伸产物作为模板，在四个引物的存在下，进行缺刻连接酶链式反应扩增，得到扩增产物，将该扩增产物与分子信标混合反应后，利用扩增产物为具有较长茎结构的双链信标靶序列，能够打开信标，同时打开信标后产生的荧光值也越高，从而通过荧光检测间接反应端粒酶活性，或通过电泳检测得到端粒酶活性。该检测方法灵敏度高、特异性好，能够有效检测待测样品中的端粒酶活性。
图1示实施例2中检测200个Hella细胞端粒酶活性的电泳图。其中，泳道1为 200个Hella细胞端粒酶延伸连接后的条带，连接后产生一条明显特异性的大片段条带；泳道2为没有端粒酶延伸的的产物连接扩增后的条带，该条带无任何可见的连接大片段，仅仅有未连接的小片段存在；泳道3为连接反应的阳性对照。
具体实施例方式本发明公开了一种端粒酶活性的检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容， 适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明提供的检测方法中所用的Went(exo_)DNA polymerase、9° N Iigase购自 New England biolabs (NEB)，人工核酸序列、dATP、dGTP、dCTP、dGTP、来自上海生工生物工程(上海)有限公司。PEG6000等化学试剂购自sigma公司。下面结合实施例，进一步阐述本发明实施例12X106个293T细胞加CHAPS裂解液(10mmol/L Tris_HCl，pH 7. 5, lmmol/L MgCl2, lmmol/L EGTA，0. lmmol/L PMSF，5mmol/L 巯基乙醇，0. 5 % w/v CHAPS (3-[ (3-胆酰胺丙基)-二乙铵]-丙磺酸)，10% w/v甘油)200 μ L，冰浴裂解30min，期间用移液器反复抽吸 3次，保证充分裂解。HOOOrpm离心20min，吸取上清置-80°C保存备用。延伸反应体系50μ L 体系，包括 10 X TRAP 缓冲液(200mmol/L Tris_HCl，pH 8. 3，15mmol/L MgCl2,1% Tween-20,630mmol/L KCl, 10mmol/L EGTA) 5 μ L, dATP、dTTP 和 dGTP 各50 μ mol/L, TS引物为150nmol/L,补加无菌DEPC水至46 μ L，加入2 μ L端粒酶提取物作为阳性延伸，加入重蒸水为阴性延伸，在25°C保温20min，反转录合成端粒酶延伸产物。吸取延伸产物1 μ L作为缺口连接酶链式反应的模板进行20 μ L体系扩增扩增体系20 μ L 体系10XTaq ligase buffer 2μ L,50% PEG 2 μ L、P” P2、P3、 卩4各 500nmol/LJent (exo_) DNA polymerase 0. 4U、9° N ligase 4U、延伸产物 1 μ L、无菌水补充至20 μ L0反应液90°C加热:3min灭活端粒酶，然后补充dGTP 5 μ mol/L。然后进行连接酶链式扩增，反应条件90°C 30s,48°C 8min,24个循环。检测体系250μ L 体系25 μ L Tris (1 OOmmo 1/L) UO μ L 分子信标(1 μ mol/L)、 1 μ L MgCl2(250mmol/L)、214yL 无菌水。将检测体系于61 °C水浴锅温浴30min，加入连接产物平衡5min后以495nm荧光激发，510 620nm检测荧光。结果显示有端粒酶延伸的连接产物能通过形成的长的双链分子信标靶序列打开分子信标，在520nm产生明显的荧光发射峰，而没有端粒酶延伸的连接产物由于形成的双链靶序列分子的茎较短，因而打不开分子信标，所以在520nm没有任何荧光发射峰。实施例22X IO6 个 Hella 细胞力口 CHAPS 裂解液(10mmol/L Tris-HCl, pH 7. 5，lmmol/L MgCl2, lmmol/L EGTA，0. lmmol/L PMSF，5mmol/L巯基乙醇，0. 5% w/v CHAPS (3-[ (3-胆酰胺丙基)-二乙铵]-丙磺酸)，10% w/v甘油)200 μ L，冰浴裂解30min，期间用移液器反复抽吸3次，保证充分裂解。HOOOrpm离心20min，吸取上清置_80°C保存备用。延伸反应体系50μ L 体系，包括 10 X TRAP 缓冲液(200mmol/L Tris_HCl，pH 8. 3， 15mmol/L MgCl2,1% Tween-20,630mmol/L KCl, lOmmol/L EGTA) 5 μ L, dATP、dTTP 和 dGTP 各50 μ mol/L, TS引物为150nmol/L,补加无菌DEPC水至46 μ L，加入2 μ L端粒酶提取物作为阳性延伸，加入重蒸水为阴性延伸，在25°C保温20min，反转录合成端粒酶延伸产物。吸取延伸产物1 μ L作为缺口连接酶链式反应的模板进行20 μ L体系扩增扩增体系20 μ L 体系10 X Taq ligase buffer2 μ L，50% PEG2 μ L、P” P2、P3、P4 各 500nmol/L、Went(exo-)DNA polymerase 0. 4U、9° N ligase 4U、延伸产物 1 μ L、无菌水补充至20 μ L0反应液90°C加热:3min灭活端粒酶，然后补充dGTP 5 μ mol/L。然后进行连接酶链式扩增，反应条件90°C 30s,48°C 8min,22个循环，得到扩增产物。取10 μ L扩增产物进行PAGE电泳，经银染后结果如图1所示。由图1可以看出，200个Hella细胞的端粒酶延伸产物就能在扩增后产生明显的特性连接片段，而端粒酶延伸的产物无任何连接。说明该方法具有非常高的灵敏度，可以检测到约100左右的Hella细胞的端粒酶活性，且特异性强，端粒酶活性的延伸产物没有任何非特异性连接。实施例32X106f^3T细胞加CHAPS裂解液(10mmol/L Tris-HCLpH 7. 5, lmmol/L MgCl2, lmmol/L EGTA，0. lmmol/L PMSF，5mmol/L 巯基乙醇，0. 5 % w/v CHAPS (3-[ (3-胆酰胺丙基)-二乙铵]-丙磺酸)，10% w/v甘油)200 μ L，冰浴裂解30min，期间用移液器反复抽吸 3次，保证充分裂解。HOOOrpm离心20min，吸取上清置-80°C保存备用。延伸反应体系50μ L 体系，包括 10 X TRAP 缓冲液(200mmol/L Tris_HCl，pH 8.3， 15mmol/L MgCl2,1% Tween-20,630mmol/L KCl, lOmmol/L EGTA) 5 μ L, dATP、dTTP 和 dGTP 各50 μ mol/L, TS引物为150nmol/L,补加无菌DEPC水至46 μ L，加入2 μ L端粒酶提取物作为阳性延伸，加入重蒸水为阴性延伸，在25°C保温20min，反转录合成端粒酶延伸产物。吸取延伸产物1 μ L作为缺口连接酶链式反应的模板进行20 μ L体系扩增扩增体系20 μ L 体系10 X Taq ligase buffer2 μ L, 50% PEG 2· 5 μ L、P”P2、P3、 P4 各 100nmol/L、Went (exo_) DNApolymerase 0. 2U、9° N ligase 2U、延伸产物 1 μ L、无菌水补充至20 μ L0反应液90°C加热3min灭活端粒酶，然后补充dGTP 8 μ mol/L。然后进行连接酶链式扩增，反应条件90°C 60s,45°C 8min,35个循环。检测体系250μL 体系25μ L Tris (50mmol/L)、10 μ L 分子信标(5 μ mol/L)、 2μ L MgCl2(250mmol/L)、214yL 无菌水。将检测体系于61 °C水浴锅温浴30min，加入连接产物平衡5min后以495nm荧光激发，510 620nm检测荧光。结果显示有端粒酶延伸的连接产物能通过形成的长的双链分子信标靶序列打开分子信标，在520nm产生明显的荧光发射峰，而没有端粒酶延伸的连接产物由于形成的双链靶序列分子的茎较短，因而打不开分子信标，所以在520nm没有任何荧光发射峰，仅有分子信标本身在520nm的背景荧光。实施例4结肠癌组织0. Img,在液氮中研磨成粉末，(癌旁组织作为对照)加预冷的CHAPS 裂解液(10mmol/L Tris-HCl, pH 7. 5, lmmol/L MgCl2, lmmol/L EGTA, 0. lmmol/L PMSF, 5mmol/L巯基乙醇，0. 5 % w/v CHAPS (3-[ (3-胆酰胺丙基)-二乙铵]-丙磺酸)，10 % w/v 甘油)200 μ L，冰浴裂解30min，期间用移液器反复抽吸3次，保证充分裂解。HOOOrpm离心 20min,吸取上清置-80°C保存备用。延伸反应体系:50μ L 体系，包括 10 X TRAP 缓冲液(200mmol/L Tris_HCl，pH 8. 3， 15mmol/L MgCl2,1% Tween-20,630mmol/L KCl, lOmmol/L EGTA) 5 μ L, dATP、dTTP 和 dGTP 各50 μ mol/L, TS引物为150nmol/L,补加无菌DEPC水至46 μ L，加入2 μ L端粒酶提取物作为阳性延伸，加入重蒸水为阴性延伸，在25°C保温20min，反转录合成端粒酶延伸产物。吸取延伸产物1 μ L作为缺口连接酶链式反应的模板进行20 μ L体系扩增扩增体系20μ L 体系10 X Taq ligase buffer2 μ L, 50% PEG 1 μ L, P1, P2, Ρ3> P4 各 300nmol/L、Went(exo-)DNA polymerase 0. 5U、9° N ligase 3U、延伸产物 1 μ L、无菌水补充至20 μ L0反应液90°C加热3min灭活端粒酶，然后补充dGTP 8 μ mol/L。然后进行连接酶链式扩增，反应条件:90°C 45s，61°C 3min,28个循环。检测体系250μL 体系25μ L Tris (80mmol/L)、10 μ L 分子信标(3 μ mol/L)、 2μ L MgCl2(250mmol/L)、214yL 无菌水。将检测体系于61 °C水浴锅温浴30min，加入连接产物平衡5min后以495nm荧光激发，510 620nm检测荧光。结果显示结肠癌组织端粒酶延伸产物的连接产物能通过形成的长的双链分子信标靶序列打开分子信标，在520nm产生明显的荧光发射峰，而癌旁组织端粒酶延伸产物的连接产物由于形成的双链靶序列分子的茎较短，因而打不开分子信标，所以在520nm没有任何荧光发射峰。实施例5乳腺癌组织0. Img在液氮中研磨成粉末，(癌旁组织作为对照)加预冷的CHAPS 裂解液(10mmol/L Tris-HCl, pH 7. 5, lmmol/L MgCl2, lmmol/L EGTA，0. lmmol/L PMSF, 5mmol/L巯基乙醇，0. 5 % w/v CHAPS (3-[ (3-胆酰胺丙基)-二乙铵]-丙磺酸)，10 % w/v 甘油)200 μ L，冰浴裂解30min，期间用移液器反复抽吸3次，保证充分裂解。HOOOrpm离心 20min,吸取上清置_80°C保存备用。延伸反应体系:50μ L 体系，包括 10 X TRAP 缓冲液(200mmol/L Tris_HCl，pH 8. 3， 15mmol/L MgCl2,1% Tween-20,630mmol/L KCl, lOmmol/L EGTA) 5 μ L, dATP、dTTP 和 dGTP 各50 μ mol/L, TS引物为150nmol/L,补加无菌DEPC水至46 μ L，加入2 μ L端粒酶提取物作为阳性延伸，加入重蒸水为阴性延伸，在25°C保温20min，反转录合成端粒酶延伸产物。吸取延伸产物1 μ L作为缺口连接酶链式反应的模板进行20 μ L体系扩增扩增体系20μ L 体系 JOXiTaq ligase buffer2 μ L, 50% PEG L 5 μ L、P”P2、P3、 P4 各 400nmol/L、Went(exo-)DNA polymerase 0. 3U、9° N ligase 2U、延伸产物 1 μ L、无菌水补充至20 μ L0反应液90°C加热:3min灭活端粒酶，然后补充dGTP 8 μ mol/L。然后进行连接酶链式扩增，反应条件:90°C 60s, 53°C 5min,30个循环。检测体系250μ L 体系25 μ L Tris (50mmol/L)、10 μ L 分子信标(1 μ mol/L)、 2μ L MgCl2(250mmol/L)、214yL 无菌水。将检测体系于61 °C水浴锅温浴30min，加入连接产物平衡5min后以495nm荧光激发，510 620nm检测荧光。结果显示乳腺组织端粒酶延伸产物的连接产物能通过形成的长的双链分子信标靶序列打开分子信标，在520nm产生明显的荧光发射峰，而乳腺癌旁组织端粒酶延伸产物的连接产物由于形成的双链靶序列分子的茎较短，因而打不开分子信标，所以在520nm没有任何荧光发射峰。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种端粒酶活性的检测方法，其特征在于，包括步骤1 从待测样品中获得端粒酶；步骤2:在所述端粒酶的作用下延伸具有如SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的TS引物， 得到端粒酶延伸产物；步骤3 将所述端粒酶延伸引物作为模板，在引物存在下进行缺刻连接酶链式反应扩增，得到扩增产物；步骤4 对所述扩增产物进行检测，得到所述端粒酶活性。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤3中所述缺刻连接酶链式反应扩增的引物为P” P2> P3和P4，其中P1具有SEQ ID NO 2所示核苷酸序列，P2具有SEQ ID NO 3 所示核苷酸序列，P3具有SEQ ID NO 4所示核苷酸序列，P4具有SEQ ID NO 5所示核苷酸序列的所示核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤3中扩增的反应条件为 900C 30 60s，45 61°C 3 8min，22 35 个循环。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤3中扩增前，还包括90°C加热 3min灭活端粒酶后，补充dGTP 2 8 μ mol/L的步骤。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤3中扩增的反应体系为 IOXTaq ligase buffer 10v%,50% PEG 0· 05 12. 5v%，P” P2、P3、P4 终浓度分别为 100 500nmol/L，Went(exo-)DNA polymerase 0· 2 0. 5U/20 μ L 体系，9° N ligase 2 4U/20 μ L体系，所述步骤2得到的端粒酶延伸产物0. 05ν%，余量为无菌水。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤4中所述检测包括荧光检测或电泳检测。
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤4中所述检测为将步骤3中所述扩增产物与如SEQ ID NO :6所示核苷酸序列的分子信标混合反应后进行荧光检测。
8.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，以体积分数计，所述步骤4中反应体系为10% 50 100mmol/L 的 Tris，0. 04% 1 5 μ mol/L 的所述分子信标，0. 004 0. 008% 250mmol/L的MgCl2，余量为无菌水。
9.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤4中反应条件为ere水浴锅温浴30min，加入所述扩增产物平衡5min。
10.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤4中荧光检测条件为以 495nm荧光激发，510 620nm荧光检测。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种端粒酶活性的检测方法。该检测方法从待测样品中获得具有活性的端粒酶后，延伸TS引物得到端粒酶延伸产物，将端粒酶延伸产物作为模板，在四个引物的存在下，进行缺刻连接酶链式反应扩增，得到扩增产物，将该扩增产物与分子信标混合反应后，荧光检测得到端粒酶活性。该检测方法灵敏度高、特异性好，能够有效检测待测样品中的端粒酶活性。
文档编号C12Q1/25GK102260739SQ20111018206
公开日2011年11月30日 申请日期2011年6月30日 优先权日2011年6月30日
发明者于聪, 刘丹, 廖冬丽, 张玉静, 张青峰, 李文英, 杨越, 焦虎平, 王斌, 王方远, 陈健 申请人:中国科学院长春应用化学研究所