专利名称：一种peg化重组猪-人尿酸氧化酶融合蛋白的制备及应用方法
技术领域：
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种PEG化重组猪-人尿酸氧化酶融合蛋白的制备及其应用方法。
背景技术：
尿酸酶又称尿酸氧化酶⑴ricase，Urate Oxidase, EC 1. 7. 3. 3，U0)，能催化尿酸氧化生成尿囊素、(X)2和H2O2。大多数脊椎动物的肝脏、肾脏等组织中均发现有此酶的存在， 但人类及一些灵长类动物由于基因突变失去合成有活性尿酸氧化酶的能力[1]。尿酸是人体内嘌呤分解代谢的最终产物，由肾脏排泄，随尿液排出体外。尿酸在体内主要以钠盐形式存在，自由形式的尿酸极其钠盐在水中溶解度很低。如果体内嘌呤代谢紊乱产生过量尿酸，或尿酸排泄受阻，都能使血液中尿酸浓度升高，从而引起高尿酸血症和痛风等疾病。恶性血液疾病和肿瘤化疗也会导致血液尿酸浓度升高。高尿酸血症和痛风不仅能引起关节肿胀，还可诱发和加重脂类代谢紊乱、糖尿病， 增加心脑血管疾病、代谢紊乱综合症及肾脏疾病病人的死亡率。近些年来，随着我国人民生活方式和饮食结构的变化，痛风病患病者迅速增加，并呈现年轻化的趋势。患病率高达约 4%，接近欧美等发达国家水平，已成为严重威胁我国人民健康的常见病、多发病。目前，对于痛风病的治疗，一般使用促进尿酸排泄或抑制尿酸合成的药物。排尿酸药有丙磺舒类药物，通过抑制肾小管对尿酸重吸收，增加其排泄。抑制尿酸合成的主要药物是别嘌呤醇。它是黄嘌呤氧化酶的竞争性抑制剂，能抑制黄嘌呤氧化成尿酸，使得尿酸合成减少。但它可造成尿酸的前体物黄嘌呤浓度升高。而黄嘌呤的水溶性比尿酸更低，有些病人会发生黄嘌呤肾损伤和沉积。别嘌呤醇和丙磺舒类药物都有明显肝肾毒性，且疗效都不够理想[2]。尿酸氧化酶是治疗常规疗法无效的痛风病患者的理想药物。人体内尿酸氧化酶基因中存在2处致死性突变，它们分别位于尿酸氧化酶氨基酸序列的第33位和第187位氨基酸残基，由精氨酸残基变为终止密码(CGA —TGA)。为了得到一种适于人类使用的尿酸氧化酶制剂，本发明使用一段与人类基因比较相似且有较好活力的猪尿酸氧化酶的基因取代人类基因中的无功能部分，制备出猪-人尿酸氧化酶嵌合基因，使用该基因生产制备可用于临床的猪-人尿酸氧化酶融合蛋白。临床观察显示，如果蛋白类药物多次给药，其药效往往难以维持。其原因是蛋白质本身就是天然抗原，注射到体内后会刺激机体产生抗体，通过抗原抗体反应影响后期的治疗效果，严重时还会引起过敏反应。解决这一问题的有效途径之一就是对蛋白质进行聚乙二醇化(PEG化)修饰，以达到降低免疫原性，延长循环半衰期的目的。PEG是一种不带电荷的线性亲水分子，它可以与蛋白质的非必需基团共价结合形成空间构象上的屏障，避免外源蛋白的抗原决定簇诱导产生抗体。由于酶的底物多是小分子物质，可以穿过PEG屏障与活性部位结合，因此PEG化不会显著降低酶的活性。本发明涉及一种方法，能最大限度的屏蔽猪-人尿酸氧化酶的抗原性，并能很好的保存其酶活力，也有很高的生物安全性。
发明内容
本发明的目的是提供PEG化重组猪-人尿酸氧化酶融合蛋白的制备方法，和用PEG 化重组猪-人尿酸氧化酶制备注射液和冻干粉针剂的方法，以及该注射液或粉针剂在降低血尿酸含量中的应用。本发明还提供重组猪-人尿酸氧化酶的核苷酸序列，包含该核苷酸序列的载体， 及包含该载体的宿主细胞。本发明的技术方案一种PEG化的重组猪-人尿酸氧化酶，其特征在于该结合物包括重组猪-人尿酸氧化酶和PEG的共价连接物，二者通过氨基甲酸酯键形式共价连接；所述的重组猪-人尿酸氧化酶可以为四聚体；每个重组猪-人尿酸氧化酶亚基上共价连接8-12个PEG链，比较优选为9-11个PEG链，更优选为9-10个PEG链；所述的PEG可以为线形或分枝形，PEG的分子量可以为2-50KD，比较优选为5-20KD，更优选为IOKD ；所述的重组猪-人尿酸氧化酶的核苷酸序列可以是序列表1中的序列，其氨基酸序列可以是序列表2中的序列。一种降低血浆尿酸含量的组合物，其特征在于包括所述的重组猪-人尿酸氧化酶与PEG的结合物和药学上可接受的载体。该组合物的给药途径包括肌肉注射，静脉注射，痛风红肿部位或痛风石所在部位局部注射等；该组合物可以以注射液或冻干粉针等制剂形式存在。所述的PEG化重组猪-人尿酸氧化酶以及包含该结合物的药物组合物可以在制备用于降低血浆尿酸含量的药物中应用，可用于临床上高尿酸血症的治疗和痛风病的全身和局部治疗。一种编码重组猪-人尿酸氧化酶蛋白的核酸分子，其核苷酸序列可以为序列表1 中的序列；一种含有编码所述的重组猪-人尿酸氧化酶蛋白的质粒载体及含有该载体的宿主细胞；该载体可以为质粒载体，宿主细胞可以为大肠杆菌。下面对本发明做详细描述本发明提供的重组猪-人尿酸氧化酶融合蛋白，尤其是PEG与重组猪-人尿酸氧化酶的结合物，基本上无免疫原性，且基本保持尿酸氧化酶活性，优选的可保留85%的酶活性，比较优选的可保留90%的酶活性，更优选的可保留95%，甚至为98%以上的酶活性。本发明提供的重组猪-人尿酸氧化酶是融合蛋白，自N端起第1-222个氨基酸残基由猪尿酸氧化酶基因序列编码，第223-305个氨基酸序列由人尿酸氧化酶基因编码。该融合蛋白的氨基酸全长序列见序列表2。N端优选为猪核苷酸序列N端的X-222核苷酸序列，其中X为1-10，比较优选的X为2-9，进一步优选的X为3-8，更进一步优选的X为4_7， 最优选的X为7。本发明现用的猪尿酸氧化酶基因序列中，有3个部位与国外报道猪尿酸氧化酶序列有差异。它们分别是第Illbp处由T变为C，第456bp处由C变为T，第669bp处由 T变为G。本发明的猪尿酸氧化酶基因序列为附表3的序列。但其编码的氨基酸序列没有变化。融合蛋白第223-305个氨基酸序列由人尿酸氧化酶基因编码。人尿酸氧化酶全长序列见附表4。优选部分人尿酸氧化酶核苷酸序列为人尿酸氧化酶核苷酸序列的第223-305氨基酸残基的编码基因序列。为了方便基因操作，在重组猪-人尿酸氧化酶基因的5’端加上ACC使之能用限制性核酸内切酶Nco I切下基因片段；在3’端加上限制性核酸内切酶Bio I的序列etc gag。猪-人重组尿酸氧化酶基因可采用全基因人工合成的方法，或采用RT-PCR的方法分别从猪和人的肝组织中克隆。如果人的新鲜肝组织不易获得也可用RT-PCR的方法克隆猪的尿酸氧化酶基因的N端序列，而用人工合成的方法获得人的尿酸氧化酶基因的C端序列。将N端序列和C端序列连接成重组猪-人尿酸氧化酶嵌合基因。将重组序列插入T载体中，转化大肠杆菌DH5ci。从克隆质粒载体上获取重组基因插入到pET28a质粒载体中，构建成表达质粒，并转化大肠杆菌BL21，得到表达工程菌E. coli BL21/pET28a-PHU0。用发酵培养的方法生产表达工程菌，待OD值达1. 4左右时加入诱导剂α _乳糖至工作浓度为5-6mmol/L。诱导培养5小时。收菌后用超声波破碎或用高压均质机破碎至 98%以上菌体破碎。分别用离子交换柱(DEAE Sepharose Fast Flow)，疏水柱(Phoenyl Sepharose 6 Fast Flow)，凝胶过滤柱(S^hacryl S 300HR)进行表达产物纯化。本申请所述的重组猪-人尿酸氧化酶可以为四聚体。四聚体表面的Lys侧链的游离氨基与mPEG-SC分子中带活性基团的PEG链进行偶联反应。本发明所述的每个重组猪-人尿酸氧化酶亚基上共价连接平均为8-12个PEG链，比较优选的为9-11个PEG链，更优选的为9-10个PEG链；所述的PEG可以为线形或分枝形，PEG的分子量可以为2-50KD，比较优选为5-20KD，更优选为10KD。每个猪-人尿酸氧化酶融合蛋白的亚基含有28个游离赖氨酸残基，加上末端氨基酸共有四个游离氨基。修饰12个赖氨酸残基以下其酶活性没有明显降低。本发明还包括一种降低尿酸含量的组合物，其特征在于包括以上所述的PEG化重组猪-人尿酸氧化酶和药学上可接受的载体。所述的药学上可接受的载体包括药学领域常规的稀释剂，赋形剂等。非肠道给药制剂包括注射剂等，也包括冻干粉针制剂。本发明比较优选剂型为注射剂，最优选为的冻干粉针制剂，其中冻干粉针制剂可以通过注射用水或者特定的溶液复溶，能保持原结合物的活性；优选的给药途径包括肌肉注射，静脉注射和痛风红肿部位局部注射等。上述各种剂型均可以按照药学领域的常规方法制备。根据动物实验结果，本发明的结合物适合在血尿酸含量高于正常值50%以上时使用，剂量一般控制在2-8单位/公斤体重。在血尿酸含量低于正常值后停止使用。二次给药的间隔时间在7天以上。每个治疗周期给药2-3次。本发明提供一种编码所述的重组猪-人尿酸氧化酶蛋白的核酸分子，其核苷酸序列可以为序列表1中的序列。一种含有编码所述的重组猪-人尿酸氧化酶蛋白的DNA分子载体，包括克隆载体和表达载体，优选载体为质粒载体，其中优选的克隆载体为PMD 18-T，优选的表达载体为 pET28a。本发明提供一种包含这些载体的宿主细胞，包括细菌，真菌，植物细胞，动物细胞等，优选为大肠杆菌。本发明提供表达重组猪-人尿酸氧化酶的核酸分子的制备方法，所述方法包括根据核酸序列进行全基因人工合成方案，RT-PCR扩增方案和RT-PCR扩增猪尿酸氧化酶基因加人工合成人尿酸氧化酶基因部分片段三种方案。本发明提供扩增重组猪-人尿酸氧化酶的核酸分子的方法，所述方法包括PCR扩增方法。可采用常规的PCR扩增方法，包括根据该核酸分子的序列设计合成引物。在适量的靶核酸分子以及过量的核苷酸和聚合酶存在下，加入适量引物，通过将靶核酸分子反复变性，与引物退火以及与引物延伸至子链的多个循环，从而将靶核酸分子指数扩增。将扩增后的产物通过电泳回收，连接到载体上，再导入宿主细胞中。将扩增产物连接到质粒载体上， 按照常规的转化方法将该质粒载体导入大肠杆菌DH5 α或BL21中。挑选包含重组猪-人尿酸氧化酶的核苷酸序列的转化子，低温冷冻保存。本发明提供重组猪-人尿酸氧化酶融合蛋白的制备方法。所述方法包括用含有该蛋白的核酸序列的载体转化或转染宿主细胞，根据宿主细胞和表达载体的特性，选择合适的诱导表达条件，诱导基因高效表达该蛋白。所述方法包括采用本领域内常规提取纯化蛋白的方法提取纯化该蛋白。优选采用色谱技术纯化蛋白。本发明提供独特的重组猪-人尿酸氧化酶的沉淀方法。本发明提供制备PEG化重组猪-人尿酸氧化酶结合物的方法。将纯化重组猪-人尿酸氧化酶用北京凯正生物工程发展有限责任公司生产的活化PEG产品(mPEG-SC，分子量10K)进行修饰。待重组猪-人尿酸氧化酶与PEG连接完成后用凝胶过滤层析方法或者超滤的方法，将PEG化重组猪-人尿酸氧化酶与其它小分子物质分离。本发明提供PEG化重组猪-人尿酸氧化酶注射剂和冻干粉针剂的制备方法。将纯化后的PEG化重组猪-人尿酸氧化酶用药物学上常规的蛋白类药物制剂的制备方法，制备成注射剂和冻干粉针剂。
图1纯化蛋白SDS-PAGE1 :1、2、3、4、泳道为纯化蛋白的4个取样管分别命名为①②③④，上样的蛋白量为10 μ g ；第5泳道为蛋白Marker ；第6、7、8泳道，为③号取样管纯化蛋白，上样量分别为 10μ g、20y g、30y g0图2纯化猪-人尿酸氧化酶高效液相色谱纯度检测
权利要求
1.一种重组猪-人尿酸氧化酶融合蛋白，其特征在于该融合蛋白的N端第1-222个氨基酸残基由猪尿酸氧化酶基因序列编码，第223-305个氨基酸序列由人尿酸氧化酶基因编码。将该融合蛋白与聚乙二醇(PEG)共价连接形成结合物，即PEG化重组猪-人尿酸氧化酶。
2.权利要求1所述的结合物，其特征在于重组猪-人尿酸氧化酶与单甲氧基聚乙二醇甲酸琥珀酰亚胺酯反应，mPEG上活化的PEG与重组猪-人尿酸氧化酶融合蛋白分子中的部分游离氨基通过共价键连接，形成PEG化重组猪-人尿酸氧化酶。
3.权利要求2所述的结合物，其特征在于每个重组猪-人尿酸氧化酶亚基上共价连接8-12个PEG链，PEG的平均分子量为2-50KD，PEG为线形或分枝形。
4.权利要求3所述的结合物，其特征在于每个重组猪-人尿酸氧化酶亚基上共价连接9-11个PEG链，PEG的平均分子量为5-20KD，PEG为线形或分枝形。
5.权利要求4所述的结合物，其特征在于每个重组猪-人尿酸氧化酶亚基上共价连接 9-10个PEG链，PEG的平均分子量为10KD，PEG为线形或分枝形。
6.权利要求2所述的结合物，其特征在于重组猪-人尿酸氧化酶为四聚体，核苷酸序列见序列表1，氨基酸序列见序列表2。
7.—种核酸分子，编码权利要求1所述的重组猪-人尿酸氧化酶。
8.质粒载体，含有权利要求7所述的核苷酸序列。
9.宿主细胞，含有权利要求8所述的质粒载体，为大肠杆菌BL21，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2011161。
10.一种降低人和动物血液尿酸含量的组合物，其特征在于包括权利要求1所述的PEG 化重组猪-人尿酸氧化酶和药学上可接受的载体。
11.权利要求10所述的组合物，其特征在于该组合物以注射液或冻干粉针制剂形式存在。
12.权利要求1-11所述的结合物在制备用于降低人和动物血液尿酸含量的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了PEG化重组猪-人尿酸氧化酶融合蛋白的制备方法，用PEG化重组猪-人尿酸氧化酶制备注射液和冻干粉针剂的方法，及其降低血尿酸含量的应用。本发明还提供了重组猪-人尿酸氧化酶的核苷酸序列，包含核苷酸序列的载体，及包含该载体的宿主细胞。本发明提供的PEG化重组猪-人尿酸氧化酶融合蛋白基本上无免疫原性，且基本保持尿酸氧化酶PEG化之前的活性，具有较好的降低血液中尿酸含量的治疗效果。
文档编号C12N11/08GK102260653SQ20111018144
公开日2011年11月30日 申请日期2011年6月30日 优先权日2011年6月30日
发明者匡红艳, 孙中杰, 荣俊 申请人:北京盛宏生物技术有限公司