专利名称：促树突状细胞成熟的体外培养方法及专用培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种促树突状细胞成熟的体外培养方法及专
用培养基。
背景技术：
目前，全球约有4亿HBV慢性感染者，主要分布在发展中国家，每年分别有超过20和30万HBV慢性感染者死于肝硬化和肝细胞癌(HCC)。抗病毒治疗是慢性乙型肝炎(CHB)治疗的关键，目前主要抗病毒药物包括干扰素(包括普通干扰素和聚乙二醇干扰素)和核苷(酸)类似物如拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦和替比夫定等，但疗效并不满意。干扰素应答比例约为30%，而核苷(酸)类似物治疗应答不持久，停药复发率高，长期治疗存在病毒变异等问题。因此，有必要开发更有效的新型疗法。 大量研究显示，HBV (乙肝病毒)慢性感染者HBV特异性抗病毒免疫低下与树突状细胞(DC)功能受损有关。DC是最强的抗原提呈细胞(APC)，在诱导CD4+和CD8+T细胞抗病毒免疫应答中起重要作用。目前，体外诱导DC的方案已经很成熟，而且以DC为基础的免疫疗法(治疗性DC疫苗)已用于黑色素瘤、恶性淋巴瘤等恶性肿瘤的治疗，此外，治疗性DC疫苗也在HIV感染患者进彳丁了临床试验，并显不出一定的治疗效果。基于DC在免疫应答中的重要作用，治疗性DC疫苗将是很有前景的一种治疗策略。HBV DC疫苗大量体外研究和初步临床试验为其大规模临床应用提供了重要的理论和实践基础。目前，初步临床研究显示HBV DC疫苗可有效抑制慢性乙型肝炎患者病毒复制，提高HBeAg血清转换率，并且安全，不存在耐药等问题。此外，HBV DC疫苗和其它抗病毒药物联合可能进一步提高慢性乙型肝炎治疗效果。HBV DC疫苗除了可用于慢性乙型肝炎的治疗外，在乙肝疫苗无应答者中也有很好的应用前景。尽管HBV DC疫苗有一定的疗效，特别是对HBeAg阴性慢性乙型肝炎效果较好，但是对HBeAg阳性慢性乙型肝炎的疗效较差，因此，对于这些问题还需要进行更深入的研究。此外，在HBV DC疫苗临床应用中还有一些问题需要考虑，如DC的来源，最佳抗原负载方案，体外培养时间，促成熟方案，免疫细胞的数量，免疫的间隔时间，免疫次数以及免疫途径等，这些环节都有可能影响HBV DC疫苗的治疗效果。因此，有必要进行更深入的临床前研究来阐明这些问题。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种制备成熟树突状细胞的促成熟培养基。本发明提供的一种制备成熟树突状细胞的促成熟培养基，按照如下方法制备将雷西莫特(小分子免疫反应调节剂，R848，英文为resiquimod，又可译为瑞喹莫德)、前列腺素E2(PGE2)、青霉素、链霉素和细胞培养基混合，得到培养基，所述雷西莫特在所述促成熟培养基中的浓度为(1-10) μ g/mL ;所述前列腺素E2在促成熟培养基中的浓度为I μ g/mL ；所述青霉素在所述促成熟培养基中的浓度为100U/mL,所述链霉素在所述促成熟培养基中的浓度为100 μ g/mL。
所述促成熟培养基中，所述雷西莫特在所述促成熟培养基中的浓度为(1、2. 5、5、7. 5或10) μ g/mL ;所述细胞培养基为无血清AM-V培养基。所述雷西莫特在所述促成熟培养基中的浓度具体为5 μ g/mL ；本发明的第二个目的是提供一种用所述培养基制备所述成熟树突状细胞的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤I)将单核细胞在培养基A中培养，得到离体未成熟树突状细胞；3)步骤2)获得的细胞在所述培养基中培养，得到成熟树突状细胞；所述培养基A按照如下方法制备将无血清AM-V培养基、青霉素、链霉素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4 (IL-4)混合，所述青霉素在所述培 养基A中的浓度为100U/mL，所述链霉素在所述培养基A中的浓度为100 μ g/mL，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子在所述培养基A中的浓度为1000U/mL，所述白细胞介素_4在所述培养基A中的浓度为500U/mL。所述单核细胞为⑶14阳性的单核细胞；所述单核细胞为从离体的人外周血单个核细胞中分离得到；所述分离的方法具体为用⑶14磁珠分选。步骤I)中，所述培养时间为5-6天，所述培养时间具体为5天；步骤2)中，所述培养时间为1-2天，所述培养时间具体为I天或2天。由所述方法得到的成熟树突状细胞也是本发明保护的范围。所述的成熟树突状细胞在制备こ肝病毒疫苗中的应用也是本发明保护的范围。未成熟的树突状细胞为低表达⑶83的细胞；成熟的树突状细胞为高表达⑶83的的细胞。本发明的实验证明，本发明的促成熟培养基要优于对照标准培养基，本发明的促成熟培养基使用的刺激因子少，促DC成熟的能力強，并且促成熟后DC存活率高。此外，本发明的促成熟培养基促成熟DC可产生高水平IL-12p70同时产生IL-10的水平较低。更重要的是，本发明的促成熟培养基促成熟的抗原肽负载DC具有较强的刺激HBV慢性感染者自体HBV特异性CTL増殖的能力。
图I为不同促成熟方案促成熟2天DC吞噬能力图2为不同促成熟方案促成熟DC刺激异体T细胞増殖的能力图3为不同促成熟方案促成熟DC诱导Thl/Th2应答的能力图4为不同促成熟方案促成熟DC诱导Thl反应的能力图5为不同促成熟方案促成熟DC诱导Th2反应的能力图6为不同促成熟方案促成熟DC诱导⑶4+CD25+fOXp3highTreg细胞反应的能力图7为抗原肽负载DC促成熟后存活率图8为抗原肽负载DC促进HBV特异性CTL増殖图9为抗原肽负载DC诱导CD4+CD25+foxp3highTreg细胞增殖
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中的实验均为重复三次，结果取平均值。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，具体如下从离体的健康人血液(由解放军307医院提供，该人员知情)中采集浓缩白细胞；粒细胞-巨卩遼细胞集落刺激因子(granulocyte -macrophagecolony-stimulatingfactor, GM-CSF)(美国 PeproTech,目录号300-03)；白细胞介素-2 (interleukin-2,IL-2)(美国 P印roTech，目录号200-02);白细胞介素 _4 (interleukin-4, IL-4)(美国 PeproTech,目录号200-04)；白细胞介素-I β (interleukin-1 β , IL-I β )(美国PeproTech,目录号200_01Β);白细胞介素-6 (interleukin-6, IL-6)(美国 PeproTech，目录号:200-06);白细胞介素-15 (interleukin-15, IL-15)(美国 PeproTech,目录号200-15);肿瘤坏死因子- a (tumor necrosis factor- α , TNF- α )(美国 PeproTech,目录号300_01A)；前列腺素-E2 (prostaglandin E2, PGE 2)(美国 sigma aldrich,目录号P6532);聚肌苷-聚胞苷酸(Polyinosinic-Polycytidylic acid)(美国 sigmaaldrich,目录号P9582);雷西莫特(Resiquimod, R848(,目录号ALX-420-038))(美国 Alexis);淋巴细胞分离液(Ficoll-Paque Plus)(英国 GE Healthcare,目录号17-1440-02);无血清 AM-V培养基(美国 Gibco，目录号0870112DK);人0)14磁珠(humanCD14+microbeads)(德国 Miltenyi Biotec,目录号130-050-201)；鼠抗人 CD40, CD86,CDla, IFN-Y-FITC(美国 BD 公司，目录号分别为555588，555657，555806，340449);鼠抗人 CD80，CD83, CD274, CD25, IL-4-PE(美国 BD 公司，目录号分别为:557227,556855,557924,340451);鼠抗人 HLA-DR，CD4，CD8_PerCp (美国 BD 公司，目录号分别为:347364,347324,347314);鼠抗人 CDllb，CDllc，CD14，CD3-APC(美国 BD 公司，目录号分别为340937，340544，555399，340440);鼠抗人 IgGl-FITC(美国 BD 公司，目录号555748);鼠抗人IgGl-PE (美国BD公司，目录号555749);鼠抗人IgG2a_PerCp (美国BD公司，目录号349054);鼠抗人IgGl-APC(美国BD公司，目录号555751);鼠抗人Foxp3_FITC，CCR7-FITC 和鼠抗人 IgG2a-FICT(美国 eBioscience 公司，目录号分别为:11-4776-73,11-1979-73，11-4321-73)；鼠抗人CXCR4-PE和鼠抗人IgG2a_PE (美国BD公司，目录号分别为:555974,555574) ;Annexin_V kit (美国 BD 公司，目录号为556422) ;7_AAD (美国 BD 公司，目录号为:559925) ；PH 7. 2磷酸盐缓冲液(PBS)(美国Gibco,目录号为=20012-027)；TruCount管(美国BD公司，目录号为340334) ;1%的多聚甲醛(美国Sigma公司，目录号为P6148) ;Dextran_FITC(美国 sigma aldrich,目录号为46945) ；CellTiter 96 AQueous non-radioactive reagent (美国 Promega 公司，目录号为G5421) ；Cytof ix/Cytoperm kit (美国 BD 公司，目录号为554715) ;IL_4，IL-10，IL_12p40，IFN-y ELISAkit (美国 BD 公司，目录号分别为550614，550613，551116，550612) ;IL_10，IL_12p40，IL-12p70ELISA kit(美国 Biolegend 公司，目录号分别为:430607,430701,431707)；Fixation permeabilization solution (美国 eBioscience 公司，目录号为00-5123)；丝裂霉素 C(mitomycin-C) (R0CHE,目录号为:10107409001);鼠抗人 HLA-A2-FITC 和IgG2b-FITC(美国 BD 公司，目录号分别为551285，555742) ；HBV 抗原肽HBV Coreantigen 18-27(FLPSDFFPSV), HBV Surface antigen 172-181(WLSLLVPFV), HBV Surfaceantigen 185-194(GLSPTVffLSV), HBV Polymerase 573-581 (FLLSLGIHL)，HBV Envelope183-191 (FLLTRILTI)(美国 Cali-Bio 公司，目录号分别为P01025, P01027, P01026,PO 1023，PO 1022) ；PE标记的HLA-A2限制性HBV特异性五聚体Pentamer-HBVcore 18-27-PE ；Pentamer-HBVsurface172-181-PE ；Pentamer-HBVsurface 185-194-PE ；Pentamer-HBVpoly573-581-PE ;Pentamer-HBVenvl83-191-PE(美国 Proimmunue,目录号分别为F023-82A-G，F031-82A-G，F028-82A-G，F032-82A-G，F027-82A-G)二氧化碳培养箱(德国Heraeus);超净工作台(JTT-7A，北京半导体设备厂);FACSCalibur型流式细胞仪(美国BD公司)；台式离心机(北京六一仪器厂)；架盘天平(JPT-10，北京医用天平厂);倒置显微镜(XSZ-D2，日本Olympus) ;12，24孔培养板(美国Corning);微量加样器(美国Thermo公司)；涡旋振荡器(江苏海门仪器厂)；酶联仪(芬兰 Labsystem 公司)； 实施例I、促树突状细胞成熟的条件摸索及表型检测I、外周血单个核细胞分离(PBMC)(I)将离体的健康人浓缩白细胞分装于IOmL离心管中，每管约4mL，加入PH 7. 2磷酸盐缓冲液等倍稀释并充分混匀；(2)将稀释后浓缩白细胞缓慢加至预装4_5mL淋巴细胞分离液(密度I. 077g/mL)的IOmL离心管中，注意保持两者界面清晰；(3)室温(25°C )离心，1600rpm, 35min ；(4)小心吸取中间白膜层(即为外周血单个核细胞)，加入至预装4_5mL PBS的离心管中并轻轻混匀；(5)室温离心，1500rpm, IOmin ；(6)弃上清,加入PBS轻轻混勻，室温离心，IOOOrpm, IOmin ；(7)弃上清，加入5mL PBS，充分混匀后计数。2、⑶14阳性单核细胞分选(I)计算PBMC总数后，边加PBS边轻轻混匀至8-lOmL ；(2)室温离心，1500rpm, IOmin,彻底吸弃上清；(3)将细胞团悬于PBS中，每IO7细胞加80 μ L PBS ；(4)每IO7细胞加20 μ L⑶14磁珠，充分混匀后，在冰箱中孵育15min (2_8°C )；(5)每IO7细胞加l-2mL PBS充分混匀，室温离心，1500rpm, IOmin,彻底吸弃上清；(6)每IO8细胞加500 μ L PBS充分混匀；(7)将细胞悬液加至LS柱(Miltenyi Biotec,目录号130-042-401)中，收集通过LS柱的未标记细胞即为去掉⑶14+单核细胞的PBMC，每次加入3mL PBS清洗，重复3次；(8)将柱子从分离器上取下，放置于IOmL离心管上，加入5mL PBS后，迅速将柱塞推至柱底，为提高分选纯度可重新过柱，得到CD14+单核细胞。3、GM-CSF/1L-4 诱导获得未成熟 DC (I)将⑶14+单核细胞重悬于无血清AM-V培养液中(含100U/mL青霉素，100 μ g/mL链霉素)，重新计数后种于12孔板中，每孔100万，培养体系2mL (磁珠分选法)，置于37 °C，5% 二氧化碳培养箱中；
(2) 2h后，轻轻吸弃培养液，再加入2mL培养基A，培养基A按照如下方法制备，将新鲜无血清AM-V培养液、青霉素、链霉素、GM-CSF, IL-4混合，青霉素在培养基A中的浓度为100U/mL，链霉素在培养基A中的浓度为100 μ g/mL, GM-CSF在培养基A中的浓度为1000U/mL, IL-4在培养基A中的浓度为500U/mL ；(3)培养第3天半量换液，补充新鲜培养基A，培养第5天，获得imDC。4、未成熟DC (imDC)到成熟DC (mDC)的培养基的摸索对照组将上述得到的imDC加入标准培养基促成熟(37°C，5 % ニ氧化碳培养箱中)2天，得到对照组mDC。标准培养基按照如下方法制备将IL-I β，IL-6，TNF- a，PGE2、青霉素、链霉素和无血清AM-V培养基混合得到培养基，IL-I β，IL-6，TNF- a，PGE2在标准培养基中的浓度均为1000U/mL，PGE2在标准培养基中的浓度为I μ g/mL，青霉素在标准培养基中的浓度为100U/mL，链霉素在标准培养基中的浓度为100 μ g/mL。实验组将上述得到的imDC分别加入促成熟培养基1_5促成熟(37°C，5%ニ氧化碳培养箱中)2天，分别得到实验组mDCl、实验组mDC2、实验组mDC3、实验组mDC4、实验组mDC5。促成熟培养基I按照如下方法制备将R848、PGE2、青霉素、链霉素和无血清AM-V培养液混合，得到促成熟培养基1，所述R848在促成熟培养基I中的浓度为I μ g/mL ;所述PGE2在促成熟培养基I中的浓度为I μ g/mL，青霉素在促成熟培养基I中的浓度为100U/mL，链霉素在促成熟培养基I中的浓度为100 μ g/mL ；促成熟培养基2按照如下方法制备将R848、PGE2、青霉素、链霉素和无血清AM-V培养液混合，得到促成熟培养基2，所述R848在促成熟培养基2中的浓度为2. 5 μ g/mL ;所述PGE2在促成熟培养基2中的浓度为I μ g/mL,青霉素在促成熟培养基2中的浓度为100U/mL，链霉素在促成熟培养基2中的浓度为100 μ g/mL ；促成熟培养基3按照如下方法制备将R848、PGE2、青霉素、链霉素和无血清AM-V培养液混合，得到促成熟培养基3，所述R848在促成熟培养基3中的浓度为5 μ g/mL ;所述PGE2在促成熟培养基3中的浓度为I μ g/mL,青霉素在促成熟培养基3中的浓度为100U/mL，链霉素在促成熟培养基3中的浓度为100 μ g/mL ； 促成熟培养基4按照如下方法制备将R848、PGE2、青霉素、链霉素和无血清AM-V培养液混合，得到促成熟培养基4所述R848在促成熟培养基4中的浓度为7. 5 μ g/mL ;所述PGE2在促成熟培养基4中的浓度为I μ g/mL,青霉素在促成熟培养基4中的浓度为100U/mL，链霉素在促成熟培养基4中的浓度为100 μ g/mL ；促成熟培养基5按照如下方法制备将R848、PGE2、青霉素、链霉素和无血清AM-V培养液混合，得到促成熟培养基5，所述R848在促成熟培养基5中的浓度为10 μ g/mL ;所述PGE2在促成熟培养基5中的浓度为I μ g/mL,青霉素在促成熟培养基5中的浓度为100U/mL，链霉素在促成熟培养基5中的浓度为100 μ g/mL。将得到的对照组成熟DCl、实验组mDCl、实验组mDC2、实验组mDC3、实验组mDC4和实验组mDC5分别进行如下检测I)不同促成熟方案促成熟DC表型检测用流式细胞仪检测表型，具体如下
a、收集的mDC均分至4个流式管中，每管加入ImL PBS,室温(25 °C )离心，1500rpm，5min ；b、上清，调整PBS体积至100 μ L，对照管(C)和试验管(Tl，Τ2，Τ3)中分别加入相应抗体10 μ L后混匀，室温避光孵育20min ；C管加PE-，FITC-, PerCp-, APC-同型对照(即鼠抗人IgGl-FITC(美国BD公司，目录号555748);鼠抗人IgGl-PE (美国BD公司，目录号:555749);鼠抗人IgG2a-PeKp (美国BD公司，目录号:349054);鼠抗人IgGl-APC(美国 BD 公司，目录号:555751)) ,Tl 管加 CD40-FITC，CD80-PE，CD14-APC，T2 管加 CD86-FITC，CD83-PE，CDllb-APC, T3 管加 CDla-FITC, CD274-PE，CDl Ic-APC,同时取少量细胞准备CD86-FITC 和 CD83-PE 单阳管；C、分别加入ImL PBS混勻，室温离心，1500rpm，5min ；d、弃上清，加入200μ 1%多聚甲醛固定，上流式细胞仪检测。
对照组成熟DCl的结果如表I所示，表I对照组促成熟DCl表型
Markers对照组成熟DCl
~CD40%99.63
MFI51.53
CD80%99.68
MFI219.55
CD83%95.85
MFI100.63
CD86%97.35
MFI162.76
CD274 %99.57MFI140.50
CDla%20.26
MFI10.64
HLA-DR %99.60
MFI661.25
CDllc%99.84
MFI760.22
CDllb %98.74
MFI354.55
CD14%1.59
MFI3.87实验组mDCl、实验组mDC2、实验组mDC3、实验组mDC4和实验组mDC5结果如表2所示，表2不同浓度的实验组促成熟DC表型
权利要求
1.一种制备树突状细胞的促成熟培养基，按照如下方法制备将雷西莫特、前列腺素E2、青霉素、链霉素和细胞培养基混合，得到培养基，所述雷西莫特在所述促成熟培养基中的浓度为(1-10) μ g/mL ;所述前列腺素E2在促成熟培养基中的浓度为I μ g/mL ;所述青霉素在所述促成熟培养基中的浓度为100U/mL,所述链霉素在所述促成熟培养基中的浓度为100 μ g/mL。
2.根据权利要求I所述的培养基，其特征在于 所述促成熟培养基中，所述雷西莫特在所述促成熟培养基中的浓度为(1、2.5、5、7.5或 10) μ g/mL ； 所述细胞培养基为无血清AM-V培养基。
3.根据权利要求I或2所述的培养基，其特征在于 所述促成熟培养基中，所述雷西莫特在所述促成熟培养基中的浓度为5 μ g/mL。
4.一种用权利要求1-3中任一所述培养基制备所述树突状细胞的方法，包括如下步骤 1)将单核细胞在培养基A中培养，得到离体未成熟树突状细胞； 2)步骤I)获得的细胞在权利要求1-3中任一所述培养基中培养，得到树突状细胞； 所述培养基A按照如下方法制备将无血清AIM-V培养基、青霉素、链霉素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素-4混合，所述青霉素在所述培养基A中的浓度为100U/mL，所述链霉素在所述培养基A中的浓度为100μ g/mL，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子在所述培养基A中的浓度为1000U/mL，所述白细胞介素-4在所述培养基A中的浓度为500U/mL。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于 步骤I)中，所述单核细胞为CD14阳性的单核细胞； 所述单核细胞为从离体的人外周血单个核细胞中分离得到； 所述分离的方法具体为用CD14磁珠分选。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于 步骤I)中，所述培养时间为5-6天，所述培养时间具体为5天； 步骤2)中，所述培养时间为1-2天，所述培养时间具体为I天或2天。
7.由权利要求4-6中任一所述方法得到的成熟树突状细胞。
8.权利要求7所述的成熟树突状细胞在制备乙肝病毒疫苗中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种促树突状细胞成熟的体外培养方法及专用培养基。本发明提供一种由离体未成熟树突状细胞制备树突状细胞的促成熟培养基。本发明提供的由离体未成熟树突状细胞制备树突状细胞的促成熟培养基，按照如下方法制备将R848、PGE2和无血清AIM-V培养基混合，得到培养基，所述R848在所述促成熟培养基中的浓度为(1-10)μg/mL；所述PGE2在促成熟培养基2中的浓度为1μg/mL。本发明的实验证明，本发明的促成熟培养基要优于对照标准培养基，本发明的促成熟培养基使用的刺激因子少，促DC成熟的能力强，并且促成熟后DC存活率高。
文档编号C12N5/0786GK102851256SQ201110180449
公开日2013年1月2日 申请日期2011年6月30日 优先权日2011年6月30日
发明者王贵强, 吴学杰, 刘永哲, 任媛媛, 李世红 申请人:北京大学第一医院