专利名称：Δ-6脂肪酸脱氢酶突变基因及其表达载体和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及脂肪酸脱氢酶突变基因及其应用，尤其涉及将来源于琉璃苣(Borage officinalis)的Δ-6脂肪酸脱氢酶基因进行密码子优化后得到的Δ-6脂肪酸脱氢酶突变基因、含有该突变基因的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞，本发明还涉及它们在制备或转化Y-亚麻酸(GLA)中的应用，属于△-6脂肪酸脱氢酶突变基因及其应用领域。
背景技术：
Y-亚麻酸(y-Iinolenic acid, GLA, 18:3)是一种n_6多不饱和脂肪酸，具有广泛的生物学功能，它与多种影响健康和慢性疾病的生理过程有关。研究发现，饮食中添加￥-亚麻酸出1^，18:3 n-6)可以抑制体内平滑肌细胞增殖，推迟apoE敲除小鼠饮食诱导动脉粥样硬化的发展(Fan YY, Ramos KS, Chapkin RS. Dietary gamma-Iinolenic acid suppresses aortic smooth muscle cell proliferation and modifies atherosclerotic lesions in apolipoprotein E knockout mice. J Nutr 2001 ; 131 :1675-1681.),改变细胞表面的粘附分子从而抑制人肠癌细胞的运动力和侵袭力(Jiang WG, Hiscox S，Hallett MB,Scott C,Horrobin DF,Puntis MC. Inhibition of hepatocyte growth factor-induced motility and in vitro invasion of human colon cancer cells by gamma-Iinolenic acid. Br. J Cancer 1995 ；71 :744-752.)。y-亚麻酸(GLA)还具有降低凝血反应、预防血栓形成、抗癌、防止钙流失等作用。GLA是人体和动物饮食中具有营养作用的重要的多不饱和脂肪酸。Δ-6脂肪酸脱氢酶最先在蓝藻(Synechocystis)中克隆得到(Reddy AS, Nuccio ML, Gross LM, Thomas TL. Isolation of a delta 6—desaturase gene from the cyanobacterium Synechocystis sp.strain PCC 6803by gain-of-function expression in Anabaena sp. strain PCC 7120. Plant Mol. Biol. 1993 ;22 :293-300.)，随后又相继在琉璃苣(Borage officinalis) (Sayanova 0, Smith MA, Lapinskas P, Stobart AK, Dobson G, Christie WW, Shewry PR, Napier JA. Expression of a borage desaturase cDNA containing an N-terminal cytochrome b5 domain results in the accumulation of high levels of delta6-desaturated fatty acids in transgenic tobacco. Proc. Natl.Acad. Sci. U. S. A 1997；94 :4211-4216.)> ^ ^ (Caenorhabditis elegans)(Napier JA, Hey SJ, Lacey DJ, Shewry PR. Identification of a Caenorhabditis elegans Delta6-fatty-acid-desaturase by heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae. Biochem. J 1998 ；330 (Pt 2) :611-614.) ,AM (Cho HP, Nakamura MT, Clarke SD.Cloning, expression, and nutritional regulation of the mammalian Delta-6 desaturase. J Biol.Chem. 1999 ；274 :471-477.)> 小鼠(Cho HP, Nakamura MT，Clarke SD.Cloning, expression, and nutritional regulation of the mammalian Delta-6 desaturase. J Biol. Chem. 1999 ；274 :471-477.)禾口大鼠(Aki T， Shimada Y, Inagaki K, Higashimoto H, Kawamoto S, Shigeta S, Ono K, Suzuki 0. Molecular cloning andfunctional characterization of rat delta-6 fatty acid desaturase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999 ；255 :575-579.)中用与 Synechocystis Δ-6 脂肪酸脱氢酶或其它脱氢酶的同源的序列克隆得到。Δ-6脂肪酸脱氢酶作用是在脂肪酸羧基端和已存在的双键之间引入另一个双键， 如催化亚油酸(LA，18:2 n-6)和α -亚麻酸(LNA，18:3 n_3)脱氢分别生成Y-亚麻酸 (GLA，18:3 n-6)和十八碳四烯酸(0ΤΑ，18:4 η-3)。Δ-6脂肪酸脱氢酶是动物体内将亚油酸转化为Y-亚麻酸(GLA)的关键酶。其活性降低将导致GLA的含量减少，并随之引起一系列健康问题。目前，Y-亚麻酸(GLA)的主要来源是植物油，如琉璃苣(Borage officinalis, 20-26 % GLA)、月见草(Oenoethera biennis L，8-12 % GLA)、黑加仑(Ribes nigrum, 15-18%)等(Kapoor R,Huang YS. Gamma linolenic acid -.an antiinflammatory omega-6 fatty acid. Curr. Pharm. Biotechnol. 2006 ；7 :531-534.)。但这些天然来源的 GLA 作为食物补充，存在生产纯化费用高、口味气味不佳、有效性波动大等缺陷。从天然产生Y-亚麻酸的物种中(如从琉璃苣中)获取其基因，将其密码子优化后转入哺乳动物体内表达将具有重要意义。在分析Genebank上琉璃苣(Borago officinalis)的Δ-6脂肪酸脱氢酶基因的cDNA序列(U79010)时，发现其使用的许多密码子为哺乳动物的稀有密码子或中度使用频率的密码子，直接采用此序列可能对哺乳动物表达不利。由于密码子的简并性，每个氨基酸对应的密码子可以有多个。研究发现物种具有密码子偏爱性，即不同物种对密码子的使用频率是不同的，有些密码子甚至从来不使用，那些不经常使用甚至从不使用的密码子称为稀有密码子或非偏爱型密码子。非偏爱型密码子形成的原因主要是细胞内缺乏识别这些密码子的tRNA。对于不同的表达系统，如毕赤酵母和大肠杆菌，其密码子偏好性是不同的。若外源基因含有较多的宿主菌非偏爱型密码子，尤其是连续出现的话，将会严重影响其在宿主菌中的表达量。为了消除稀有密码子对蛋白表达量的影响，可采用对异源基因的密码子进行优化来实现，即在不改变外源基因氨基酸序列的情况下，将外源基因中的稀有密码子替换为宿主常用的密码子。该方法具有简单易行， 重复性好的特点，得到了广泛的使用。
发明内容
本发明目的之一是将来源于琉璃苣(Borage officinalis)的Δ -6脂肪酸脱氢酶基因进行密码子优化，得到一种适合在哺乳动物体内高效表达的Δ-6脂肪酸脱氢酶突变基因。本发明目的之二是将所获得的Δ-6脂肪酸脱氢酶突变基因应用于制备Y-亚麻酸或提高人体或哺乳动物体内Y-亚麻酸的含量。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的本发明将来源于琉璃苣(Borage officinalis)的Δ-6脂肪酸脱氢酶基因在不改变蛋白质氨基酸序列的前提下，综合考虑密码子使用频率，GC含量的调整，不稳定序列的删除等影响因素，按照人的密码子偏爱性将其改为高度或中度使用频率的密码子，此外，还在起始密码子ATG上游添加了 kozak序列，更有利于突变基因在真核细胞中表达，优化后所得到的Δ-6脂肪酸脱氢酶突变基因(命名为Delta6基因)，其核苷酸序列为SEQ ID N0:1所示(其编码的多肽为SEQ ID N0:2所示)。密码子优化后的Delta6基因与原Δ-6脂肪酸脱氢酶基因编码区进行比对，其一致度达86. 7 %，原序列GC含量为39. 2 %，密码子优化后序列GC含量提高为51. 1%。此外，与SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的核苷酸序列，并且该核苷酸序列所编码的蛋白质也具有△-6脂肪酸脱氢酶的功能，那么该核苷酸序列也包括在本发明的保护范围之内。含有SEQ ID NO. 1所示突变基因的表达载体以及含有该表达载体的重组宿主细胞株也当然属于本发明的保护范畴之列。可以将本发明Δ-6脂肪酸脱氢酶突变基因(Delta6基因)与真核载体可操作性的相连接，构建得到重组真核表达载体；为获得突变基因的高水平表达，通常将所述突变基因亚克隆到含有用于指导转录的强启动子、转录/翻译终止子和(如果对于编码蛋白的核酸而言)用于翻译起始的核糖体结合位点的表达载体。载体视情况包含含有至少一个独立的终止子序列的一般表达盒、允许在真核生物中复制表达盒的序列(包括(但不限于) 穿梭载体)和用于真核生物系统的选择标记。参看Giliman & Smith，Gene 8 :81(1979)； Roberts·入，Nature, 328 :731 (1987) ；Schneider, B.等)κ, Protein Expr. Purif. 6435 10(1995) ；Ausubel, Sambrook, Berger0作为本发明的一个较优的实施方式，所述的重组真核表达载体可以是含有Δ-6 脂肪酸脱氢酶突变基因和绿色荧光蛋白基因序列的真核表达载体PIRES2-ACGFP1-Delta6， 其中，所述Delta6的核苷酸序列为SEQ ID NO. 1所示。将含有Delta6基因的真核表达载体转染到宿主细胞中，即获得含有Delta6基因的重组宿主细胞株；其中所述的宿主细胞优选为哺乳动物细胞(例如HEK293细胞等)。可通过各种方式将Delta6基因导入到真核细胞中，这些方法包括将受体细胞与含有DNA的细菌原生质体融合、电穿孔法、抛射物轰击以及病毒载体注射等。一旦建立了重组宿主细胞菌株(即，将表达构载体引入了宿主细胞且分离具有合适表达构筑体的宿主细胞)，则在适于产生△ -6脂肪酸脱氢酶的条件下培养所述重组宿主细胞菌株。这些方法为所属领域的技术人员是所熟知，培养所述重组宿主细胞菌株的方法依赖于所用表达载体的性质和宿主细胞本身。重组宿主菌株通常使用所属领域众所周知的方法培养。重组宿主细胞株通常培养于含有碳、氮和无机盐的可吸收源和视情况含有维生素、氨基酸、生长因子及其它所属领域众所周知的蛋白培养添加物的液体培养基中。用于培养宿主细胞的液体培养基可视情况含有抗生素和抗真菌素以防止不希望的微生物生长和/ 或包括(但不限于)抗生素的化合物以选择含有所述表达载体的宿主细胞。重组宿主细胞可以分批或连续方式培养，同时以分批或连续方式收集细胞(在其中hGH多肽累积于细胞中的情形下)或收集培养上清液。在添加底物亚油酸的条件下，本发明通过气相色谱方法对所获得的重组宿主细胞株进行脂肪酸成分分析。实验结果发现，重组宿主细胞中Y-亚麻酸(GLA)水平有显著增加，这表明除了内源性的△-6脱氢酶外，所转入的密码子优化的Δ-6脂肪酸脱氢酶突变基因在哺乳动物细胞中是有活性的，催化底物亚油酸生成Y-亚麻酸(GLA)。因此，通过基因工程技术在动物细胞中引入本发明的Δ-6脂肪酸脱氢酶突变基因，可以实现下游长链多不饱和脂肪酸的调控或促进Y-亚麻酸的生物转化。因此，本发明的Δ-6脂肪酸脱氢酶突变基因(即Delta6基因)可以有以下方面的应用1、制备Δ-6脂肪酸脱氢酶构建含有本发明Delta6基因的真核表达载体；将所构建的真核表达载体转染到宿主细胞中，诱导外源基因表达，收集并纯化所表达的蛋白。2、一种提高人或哺乳动物体内Y -亚麻酸的含量的方法，包括将本发明Delta6 基因导入到人或哺乳动物细胞内。定义本发明不限于本文中所述的特定方法、实验方案、细胞系和试剂。也应了解本文中所用的方法是仅用于描述特定实施例的目的，且并不意欲限制本发明的范畴，本发明的范畴将仅由随附权利要求书所限制。除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包括外源性多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。术语“核酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA (肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer 等人，Nucleic Acid Res. 19 :5081 (1991) ；Ohtsuka 等人，J. Biol. Chem. 260 :2605-2608(1985)；和 Cassol 等人，(1992) ；Rossolini 等人，Mol Cell. Probes 8 :91-98(1994))。术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。艮口， 针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。术语“氨基酸”意指天然产生及非天然产生氨基酸，以及以类似于天然产生氨基酸的方式发挥功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟剂。术语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针将杂交到核酸的复合混合物(包括(但不限于)总细胞或文库DNA 或RNA)中的其目标子序列上，但并不杂交到复合混合物中的其它序列上。严谨条件是序列依赖性的并且在不同环境中将有所不同。较长的序列在较高温度下特异性杂交。对于核酸杂交的详尽指导发现于 Tijssen，Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Probes, " Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)中。PiSH牛ifi胃被选择为低于特异序列在规定离子强度PH下的热熔点(Tm)约5-10°C。Tm为在平衡状态下50%与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在Tm下在平衡状态下50%的探针被占据)。严谨条件可为以下条件其中在PH7. 0到8. 3下盐浓度低于约1. OM钠离子浓度，通常为约0. 01到 1. OM钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30°C，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60°C。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下50%甲酰胺，5XSSC和SDS，在42°C下培养；或5XSSC，1% SDS，在65°C下培养， 在0.2 X SSC中洗涤和在65°C下于0. 1% SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。术语“真核生物”意指属于种系发生真核领域的有机体，诸如动物(包括(但不限于)哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟类等)、纤毛虫、植物(包括(但不限于)单子叶植物、双子叶植物、藻类等)、真菌、酵母、鞭毛虫、微孢子虫、原生生物等。
图1 pIRES2-AcGFPl_Delta6真核表达载体的结构示意图。图2表达绿色荧光蛋白的HEK293转基因细胞。图3 Delta6基因在HEK293转基因细胞中表达的RT-PCR结果。图4 Delta6基因在HEK293转基因细胞中表达的脂肪酸气相色谱分析。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。说明以下具体实施例中所用到重组遗传学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中未作详细介绍的技术，均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分来进行，包括Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第 3 版· 2001) ;Kriegler, Gene Transfer and Expression :A Laboratory Manual(1990)； 禾口 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等人编，1994)。描述分子生物技术的一般文本包括Berger和Kimmel，Guide to Molecular Cloning ；Techniques, Methods in Enzymology,第 152 卷，Academic Press, Inc. , San Diego, CA(Berger) ；Sambrook 等人’ Molecular Cloning-Α Laboratory Manual (第 2 版)，第 1~3 卷.Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989(" Sambrook")禾口 Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel 等人编，Current Protocols,a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc.and John Wiley &Sons, Lie, (1999 年增补)(〃 Ausubel “)。实施例1密码子优化的琉璃苣脂肪酸脱氢酶真核表达载体 pIRES2-AcGFPl-Delta6 的制备包括EcoRI和BioI酶切位点、kozak序列、密码子优化的琉璃苣脂肪酸脱氢酶 Delta-6编码区的核苷酸序列由hvitrogen公司合成。骨架载体pIRES2_AcGFPl (购自Clontech)载体通过EcoRlAhoI双酶切得到线性化载体序列；同样用EcoRlAhoI 双酶切含目的片段的载体得到Delta6基因片段，切胶回收目的片段，T4 DNA Iigase 室温连接池；将连接产物转化至感受态细胞；酶切和测序鉴定获得正确的新质粒 pIRES2-AcGFPl-Delta6(图 1)。实施例2密码子优化的琉璃苣Delta6基因转染HEK293细胞转染前一天，在M孔板上以1. 5X105/孔的比例接种昍以93(购自ATCC) (0. 5mL/ 孔)，第二天细胞密度达到90%-95%后，将细胞培养基换成无抗生素的培养基。将0. 8-1. 2 μ g 的 pIRES2-AcGFPl-Delta6 质粒 DNA 稀释到 50 μ L 无血清 0ΡΤΙ-ΜΕΜ 中；另将2 μ L脂质体稀释到50 μ L OPTI-MEM中。5分钟后，将二者混合，室温静置20分钟以形成DNA-脂质体复合物。再将形成的DNA-脂质体复合物加入培养孔中，轻轻混勻。将培养板置37°C、5% CO2的培养箱中培养。转染4-6小时后换新的含10%胎牛血清的完全培养基。转染M小时后，将细胞以至少1 10的比例稀释后传代，并在传代后M小时加 0. 7mg/ml的G418筛选14天。再将GFP阳性细胞从G418抗性细胞中分离出来，通过细胞正常传代，获得稳定的阳性细胞株(图2)。以pIRES2-AcGFPl载体转染的细胞为对照。实施例3GFP阳性细胞的RT-PCR检测按照Trizol (Invitrogen)说明书提取GFP阳性细胞的总RNA。按照以下步骤反转录合成cDNA第一链1) DNase (Promega)处理 RNA 样品A. RNase-free PCR管中加入表1所示的反应体系表 权利要求
1. Δ -6脂肪酸脱氢酶突变基因，其特征在于，其核苷酸为以下(a)或(b)所示(a) SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列；(b)与SEQ ID NO: 1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的核苷酸序列，该核苷酸序列所编码的蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID N0:2所示。
2.含有权利要求1所述△-6脂肪酸脱氢酶突变基因的表达载体。
3.按照权利要求2所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体是真核表达载体。
4.按照权利要求3所述的表达载体，其特征在于所述的真核表达载体是哺乳动物表达载体。
5.按照权利要求4所述的表达载体，其特征在于所述的哺乳动物表达载体是 pIRES2-AcGFPl-Delta6 ；其中，所述Delta6的核苷酸序列为SEQ ID NO. 1所示。
6.含有权利要求2-5任何一项所述表达载体的重组宿主细胞株。
7.按照权利要求6所述的重组宿主细胞株，其特征在于所述的宿主细胞是哺乳动物细胞。
8.权利要求1所述的Δ-6脂肪酸脱氢酶突变基因在制备Δ-6脂肪酸脱氢酶中的应用。
9.按照权利要求8所述的应用，包括构建含有权利要求1所述△-6脂肪酸脱氢酶突变基因的真核表达载体；将所构建的真核表达载体转染到宿主细胞中，诱导目的基因表达， 收集并纯化所表达的蛋白，即得。
10.一种提高哺乳动物细胞内Y-亚麻酸含量的方法，包括构建含有权利要求1所述 Δ-6脂肪酸脱氢酶突变基因的哺乳动物表达载体；将所构建的哺乳动物表达载体导入到哺乳动物细胞内。
全文摘要
本发明公开了Δ-6脂肪酸脱氢酶突变基因及其表达载体和应用。本发明将来源于琉璃苣的Δ-6脂肪酸脱氢酶基因在不改变氨基酸序列的前提下，按照人的密码子偏爱性将其密码子改为高度或中度使用频率的密码子，此外，还在其起始密码子ATG的上游添加了kozak序列，优化后的突变基因核苷酸序列为SEQIDNO:1所示。将本发明突变基因导入到宿主细胞中，在添加底物亚油酸的条件下，通过气相色谱方法对所获得的重组宿主细胞株进行脂肪酸成分分析，结果发现，重组宿主细胞中γ-亚麻酸水平有显著增加，本发明Δ-6脂肪酸脱氢酶突变基因能应用于提高或改善哺乳动物细胞内的γ-亚麻酸含量。
文档编号C12N9/02GK102250928SQ20111017993
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月29日 优先权日2011年4月7日
发明者曹文广, 陈青 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所