专利名称：一种基于脲醛树脂涂层的蛋白酶解微流控芯片及其制备方法
技术领域：
本发明属微流控芯片技术领域，具体涉及一种基于脲醛树脂涂层的蛋白酶解微流控芯片及其制备方法。
背景技术：
微流控芯片以微机电加工技术为依托，以微管道网络为结构特征，以生命科学为目前主要应用对象，是当前微全分析系统领域发展的重点。微流控芯片是把生物、化学、医学分析过程中的采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块几个平方厘米大的芯片上，自动完成分析全过程。由于它在生物、化学、医学等领域的巨大潜力，已经发展成为一个崭新的研究领域。自从瑞士 Cih-Geigy公司的Manz和Widmer [1]首次提出微型全分析系统 (μ-TAS)以来，微流控芯片就以其高效、快速、试剂用量少、低耗以及集成度高等优点引起了国内有关专家的广泛关注，在其方法学研究迅速发展的基础上，微流控芯片在生物医学研究、临床诊断、药物分析、环境监测、法医和军事等领域显示了良好的应用前景[，4]。蛋白质的酶解是蛋白组学中蛋白质分析的一个关键步骤，待测样品中的蛋白通过电泳分离后用蛋白水解酶水解成肽，然后用质谱测定其分子量得肽质量图谱，经检索有关数据库后完成对蛋白的鉴定。由于传统的溶液酶解灵敏度低而且耗时(12小时以上)，加上溶液酶解酶自身酶解产生的肽也会干扰目标蛋白的鉴定，溶液酶解时蛋白和酶的比例要求在2(Γ40:1。所以建立高效快速的新型蛋白质酶解方法具有重要意义。微流控芯片微流通道尺寸在微米级，是纳升到微升级小体积样品的理想操作和分析平台，特别适用于生物医药分析和临床检测小体积样品的酶法和免疫法分析和检测。其中一个很重要的用途是用于蛋白质的酶解和分析。解决上述问题的途径之一就是使用固定化酶技术，通常使用的微流控芯片酶反应器是将蛋白酶如胰蛋白酶通过溶胶-凝胶包埋技术固定在芯片微流通道内表面。存在的问题是由于酶不是通过共价键固定，容易流失，影响酶解效果。脲醛树脂系尿素与甲醛反应制得的的常用聚合物，价格低廉。通常采用尿素与甲醛在碱性条件下加热生成脲醛树脂预聚物水溶液，然后在酸性条件下进一步缩聚成脲醛树脂。由于脲醛树脂预聚物含有大量的羟甲基，可以与酶中的谷氨酰胺和天门冬酰胺残基交联生成共价键，从而实现酶的共价键固定[7]。本发明将蛋白水解酶通过脲醛树脂预聚物表面的羟甲基固定在插入微流控芯片中的玻璃纤维芯表面或者微流控芯片通道内表面，制得蛋白酶解微流控芯片，由于酶通过共价键固定，其自身酶解被抑制，可以使用较大的酶量，该反应器可将蛋白质的酶解时间从传统溶液酶解的12小时以上大幅度降低到10秒，大大节约了酶解时间，提高了工作效率。 为蛋白组学中蛋白的高效酶解和高通量鉴定提供新的技术手段。本发明提出的基于脲醛树脂涂层的蛋白酶解微流控芯片具有制作简便、价格低廉和稳定性高的优点，可采用浸涂和注射涂布的技术批量加工。通过更换固定的酶的种类还可在此基础上开发新的微流控芯片酶反应器，如血糖测定用微流控芯片酶反应器等。参考文献ManzA, Graber N, Widmer HM. Sens. Actuators B 1990，1，244 248.Dittrich,PS, Tachikawa K, Manz A. Anal. Chem. 2006，78，3887 3908.AurouxPA, Iossifidis D, Reyes DR, and Manz A. Anal. Chem. 2002, 74, 2637^2652.VerpoorteE. Electrophoesis 2002， 23， 677 712.Qu HY, Wang H. , Huang Y, et al. Anal. Chem. 2004，76WuHL, Tian YP, Liu BH, et al. J. Proteome Res. 2004VinodVP, Shinde S, D'Britto V, et al. Biotechnol 1585 - 1590.。
发明内容
本发明的目的在于提出一种制作简便、价格低廉和稳定性高的基于脲醛树脂涂层的蛋白酶解微流控芯片及其制备方法。本发明提出的基于脲醛树脂涂层的蛋白酶解微流控芯片，是通过蛋白水解酶与脲醛树脂预聚物表面的羟甲基反应，将酶固定在插于微流控芯片中玻璃纤维芯表面或者微流控芯片通道内表面而制备获得。本发明可简化芯片制作步骤和降低芯片制作成本，为蛋白的高效酶解和高通量鉴定提供新的技术手段。本发明提出的基于脲醛树脂涂层的蛋白酶解微流控芯片制备方法，具体步骤为
(1)通过数控机械雕刻机在有机玻璃板上加工带有开口通道的微流控芯片基片，其中通道结构由计算机辅助设计软件设计；
(2)微流控芯片基片带有开口通道的一面与一片相同大小的有机玻璃盖片合上并夹于两片玻璃片后，通过热压键合得有机玻璃微流控芯片；
(3)将尿素溶于pH值为7.5^8. O的甲醛溶液中，然后加热一定时间形成脲醛树脂预聚物水溶液，并用水稀释到需要的浓度；
(4)将玻璃纤维浸于脲醛树脂预聚物水溶液中一定时间后取出晾干，然后浸入含有蛋白水酶的溶液水酸性中1-10小时，取出后插入有机玻璃微流控芯片中，即得可换芯蛋白酶解芯片；或者
将脲醛树脂预聚物水溶液注入有机玻璃微流控芯片通道中，然后用压缩空气吹干，得脲醛树脂预聚物表面修饰通道，然后将含有蛋白水酶的酸性水溶液注入，反应1-10小时， 即得一次性蛋白酶解微流控芯片。本发明步骤(1)中数控机械雕刻机雕刻的通道深度为1(Γ500微米，底部宽度 25 200，上部宽度10(Γ500微米。上部宽度大于底部宽度。本发明步骤(2)中，要求在有机玻璃盖片对应于微流控芯片基片上通道的末端的位置钻有直径为广3毫米的圆形小孔，用于进样和收集反应产物。本发明步骤(2)中，热压封装温度为105-110°C，施加在两片玻璃板上的压力为 0. 5飞公斤/平方厘米，热压时间为1(Γ20分钟。
，6426 - 6433. ，3，1201 - 1209. Prog. 2006， 22，
本发明步骤(3)中，脲醛树脂预聚物水溶液的重量浓度可以为5 50%。本发明步骤(4)中玻璃纤维的直径应小于微流控芯片通道宽度和高度的最小值， 以便纤维能插入通道。本发明步骤(4)中含有蛋白水酶的酸性水溶液中的酸是促进脲醛树脂预聚物进一步交联和促进酶与脲醛树脂预聚物表面的羟甲基反应的催化剂，可以是三氟乙酸、三氯乙酸，草酸、氯化铵等。本发明中步骤(4)中含有蛋白水酶的酸性水溶液中的蛋白水解酶的含量为广10
毫克/毫升。本发明提出的基于脲醛树脂涂层的蛋白酶解微流控芯片制备方法，具体操作如下
采用计算机辅助设计软件设计芯片结构，典型的设计如附图1所示，由单十字交叉微流通道和溶液连接孔构成，将设计的图形用数控机械雕刻机雕刻到有机玻璃片表面得微流控芯片基片。根据需要选用不同尖端宽度和角度的刻刀，以获得不同尺寸的通道，采用本方法可加工的通道尺寸范围为通道深度为1(Γ500微米，底部宽度25 200微米，上部宽度 10(Γ500微米。上部宽度大于底部宽度。将基片和盖片用水冲洗，吹干后立即将微流控芯片基片带有开口通道的一面与一片相同大小的有机玻璃盖片夹于两片玻璃片后，通过热压键合得有机玻璃微流控芯片。要求有机玻璃盖片在基片上通道末端对应的位置钻有直径为广3毫米的圆形小孔，用于样品引入和收集反应产物。热压封装温度为105-110°C，施加在两片玻璃板上的压力为0. 5飞公斤/平方厘米，热压时间为1(Γ15分钟。将一定量浓氨水加入37%的甲醛水溶液中，调节溶液ρΗ值为7. 5^8. 0，加入一定量固体尿素，溶解，在5(T70°C水浴中加热1(Γ20分钟，然后加入少量尿素于9(T10(TC水浴中加热4(Γ80分钟，得脲醛树脂预聚物水溶液，并用水稀释到需要的重量浓度(5飞0%)。将硬质玻璃棒在煤气灯上加热拉制成玻璃纤维，直径为40到100微米，将玻璃纤维于50 1的0. 1 mol/L NaOH溶液水溶液处理5_15分钟后，用蒸馏水清洗后，浸于脲醛树脂预聚物水溶液中1-10分钟，取出后自然晾干20-60分钟，然后浸入含有广10毫克/毫升蛋白水酶的酸性水溶液中1-10小时，取出后插入有机玻璃微流控芯片3中得可换芯蛋白酶解芯片。也可将上述脲醛树脂预聚物水溶液注入有机玻璃微流控芯片3通道中，停留1-10 分钟用压缩空气吹干，得表面修饰有脲醛树脂预聚物修饰的通道，然后将含有广10毫克/ 毫升蛋白水酶的酸性水溶液注入通道内使其反应1-10小时后用水清洗通道后得一次性蛋白酶解微流控芯片。本发明将蛋白水解酶通过与脲醛树脂预聚物反应固定在可以更换的玻璃纤维表面或微流控芯片通道内表面，提高了酶试剂的使用效率，节约了资源，不仅降低了蛋白酶解的成本，也大幅提高了其效率。本发明中使用的微流控芯片酶解反应器可采用浸涂和注射涂布工艺批量加工，具有工艺简单和价格低廉的特点在蛋白质研究、临床诊断、环境监测、 生命科学研究和食品分析等领域有良好的应用前景。本发明采用这个方法将蛋白水解酶通过脲醛树脂预聚物表面的羟甲基固定在插入微流控芯片中的玻璃纤维芯表面或者微流控芯片通道内表面，制得蛋白酶解微流控芯片，由于酶通过共价键固定，其自身酶解被抑制，可以使用较大的酶量，该反应器可将蛋白
5质的酶解时间从传统溶液酶解的12小时以上大幅度降低到10秒，大大节约了酶解时间，提高了工作效率。为蛋白组学中蛋白的高效酶解和高通量鉴定提供新的技术手段。本发明提出的基于脲醛树脂涂层的蛋白酶解微流控芯片具有制作简便、价格低廉和稳定性高的优点，可采用浸涂和注射涂布的技术批量加工。通过更换固定的酶的种类还可在此基础上开发新的微流控芯片酶反应器，如血糖测定用微流控芯片酶反应器等。
图1为本发明涉及的(A)可换芯蛋白酶解微流控芯片和(B) —次性蛋白酶解微流控芯片示意图。图2为本发明中(A)可换芯蛋白酶解微流控芯片照片和(B)通道内固定有蛋白水解酶的脲醛树脂涂层修饰玻璃纤维显微镜照片。图3为本发明中在脲醛树脂预聚物涂层表面固定蛋白水解酶的反应示意图。图4为本发明中(A)固定有蛋白水解酶的脲醛树脂涂层修饰玻璃纤维断面(A)和断面边缘部分(B)扫描电子显微镜照片。图5为(A)玻璃纤维表面和(B)固定有蛋白水解酶的脲醛树脂涂层修饰玻璃纤维表面的扫描电子显微镜照片。图6为本发明中蛋白微流控芯片酶解装置示意图。图7为使用本发明技术制备的微流控芯片酶反应器酶解㈧血红蛋白和⑶溶菌酶产物的MALDI-T0F质谱图。流速2.0 PL/min，酶解时间<10 s，蛋白质溶液浓度200 ng/ μ (溶于20 mmol/L NH4HCO3水溶液(pH 8. 1)中)，所有匹配的肽段用“*”标出；㈧使用可换芯蛋白酶解微流控芯片，(B)使用一次性蛋白酶解微流控芯片。图中标号1、5和6为样品溶液孔，2为微流控芯片主通道，3为微流控芯片，4为酶解液收集孔，7为进样微流通道，8为固定有蛋白水解酶的脲醛树脂涂层修饰玻璃纤维，9为石蜡填充的小孔，10为固定有蛋白水解酶的脲醛树脂涂层修饰微流控芯片主通道，11为玻璃纤维断面，12为固定有蛋白水解酶的脲醛树脂涂层断面，13为注射泵，14为待测蛋白质样品溶液，15为硅橡胶连接管，16为微流控芯片酶反应器，17为质谱点样板，18为样品蛋白酶解后获得肽段的质谱图示意图。
具体实施例方式下面通过实施例和附图进一步描述本发明
1、基于脲醛树脂涂层的可换芯蛋白酶解微流控芯片
采用计算机辅助设计软件设计芯片结构，典型的微流控芯片(75毫米X 16毫米)设计如附图1所示，由单十字交叉微流通道和溶液连接孔1、4、5和6构成，将设计图用数控机械雕刻机雕刻到1毫米厚有机玻璃片(75 mm X 16 mm)表面得微流控芯片基片。选用尖端宽度为150微米和角度为30度的刻刀，加工的通道尺寸为通道深度为95微米，底部宽度150微米，上部宽度200微米。其中主通道2长66 mm，进样通道5长10 mm，其中主通道2和进样通道7交叉点到最近的三个溶液连接孔1、5和6的距离均为5 mm。取一片有机玻璃片(75毫米X16毫米X 1毫米)，在其对应于微流控芯片基片通道末端的位置上钻直径为2毫米的圆形小孔作为盖片，用于进样和收集反应产物。然后将基片和盖片用水冲洗，吹干后立即将微流控芯片基片带有开口通道的一面与盖片对准合上，夹于两片玻璃片后， 通过热压键合得有机玻璃微流控芯片3。热压封装温度为108°C，施加在两片玻璃板上的压力为2公斤/平方厘米，热压时间为10分钟。将1. 5毫升浓氨水(28%)加入35毫升37%的甲醛水溶液中，调节溶液pH值为 7. 5^8. 0，加入11. 4克尿素，待溶解后于60°C水浴中加热15分钟，然后加入0. 6克尿素于 95°C水浴中加热60分钟，得脲醛树脂预聚物水溶液，浓度约为50%，使用前用水稀释到浓度为 25%。将硬质玻璃棒在煤气灯上加热拉制成玻璃纤维，直径为75微米。然后将其于50 °〇的0. 1 mol/L NaOH溶液水溶液处理10分钟后，用蒸馏水清洗后，浸于脲醛树脂预聚物水溶液中2分钟，取出后自然晾干40分钟，然后浸入含有5毫克/毫升胰蛋白酶的1%三氟乙酸水溶液中5小时得固定有胰蛋白酶的脲醛树脂涂层修饰玻璃纤维酶芯8，取出后通过附图1 (A)所示的小孔9插入有机玻璃微流控芯片主通道2中，然后用石蜡封闭小孔得可换芯蛋白酶解芯片，保存于4 °C冰箱中备用。附图2为本发明中可换芯蛋白酶解微流控芯片照片和主通道2内固定有蛋白水解酶的脲醛树脂涂层修饰玻璃纤维8的显微镜照片。可见可换芯蛋白酶解微流控芯片中固定有胰蛋白酶的玻璃纤维芯8在主通道2的中央。附图 3为本发明中在脲醛树脂预聚物涂层表面固定蛋白酶的反应示意图，主要是利用脲醛树脂预聚物表面的羟甲基，与蛋白酶中的谷氨酰胺和天门冬酰胺残基中的酰胺基交联生成共价键，从而实现酶的共价键固定。附图4为本发明制备的固定了蛋白水解酶的玻璃纤维断面的扫描电子显微镜照片，可见在玻璃纤维表面的确修饰了一层厚度在2. (Γ2. 5微米的修饰层12。附图5为玻璃纤维表面和固定有蛋白水解酶的脲醛树脂涂层修饰玻璃纤维表面的扫描电子显微镜照片，可见当固定有蛋白水解酶的脲醛树脂涂层修饰到玻璃纤维表面后，表面粗糙度上升，比表面积增加，提高了酶与蛋白的作用效率。将可换芯蛋白酶解芯片16通过硅橡胶管15与注射泵13连接构成流动注射蛋白酶解系统(附图6)，流速为2.0 PL/min，根据流速估算酶解时间约为10秒，其中溶液连接孔 1和6用塞子堵住。从酶反应器16流出的酶解液滴在质谱点样板17上，通过MALDI-T0F质谱仪测定。其中酶解牛血红蛋白的产物的MALDI-T0F质谱图见图7 (A)，可见在谱图中出现了酶解肽段的质谱峰，通过检索网上数据库，发现有15条肽段匹配，得到鉴定的氨基酸有117个，蛋白序列覆盖度为80%，而传统溶液酶解的牛血红蛋白的蛋白序列覆盖度为75%， 表明本发明可换芯式微流控芯片酶反应器在10秒内的酶解效果与溶液酶解12小时的结果相当，具有良好的酶解能力。2、基于脲醛树脂涂层的一次性蛋白酶解微流控芯片
也可将上述25%的脲醛树脂预聚物水溶液注入上述有机玻璃微流控芯片3主通道2 中，停留2分钟后用压缩空气吹干，得表面修饰有脲醛树脂预聚物修饰的通道10，然后将含有5毫克/毫升胰蛋白酶的1%三氟乙酸水溶液中注入通道内使其反应5小时后，用水清洗通道后得一次性蛋白酶解微流控芯片。将该可换芯蛋白酶解芯片16通过硅橡胶管15与注射泵13连接构成流动注射蛋白酶解系统，流速为2.0 PL/min，根据流速估算酶解时间约为10秒，其中溶液连接孔1和6 用塞子堵住。从酶反应器16流出的酶解液滴在质谱点样板17上，通过MALDI-T0F质谱仪测定。其中溶菌酶酶解的产物的MALDI-T0F质谱图见附图7 (B)，可见在谱图中出现了酶解肽段的质谱峰，通过检索网上数据库，发现有8条肽段匹配，得到鉴定的氨基酸有63个， 蛋白序列覆盖度为42%，而传统溶液酶解的牛血红蛋白的蛋白序列覆盖度为41%，表明本发明可换芯式微流控芯片酶反应器在10秒内的酶解效果与溶液酶解12小时的结果相当，进一步证明本发明涉及的酶反应器具有良好的酶解能力。3、基于固定有靡蛋白酶脲醛树脂涂层的一次性蛋白酶解微流控芯片
此外，采用本发明的方法，还制备了基于固定有靡蛋白酶脲醛树脂涂层的一次性蛋白酶解微流控芯片。具体方法为将上述25%的脲醛树脂预聚物水溶液注入有机玻璃微流控芯片通道中，停留2分钟后用压缩空气吹干，得表面修饰有脲醛树脂预聚物修饰的通道，然后将含有5毫克/毫升靡蛋白酶的1%三氟乙酸水溶液中注入通道内使其反应5小时后，用水清洗通道后得一次性蛋白酶解微流控芯片，已成功将此反应器用于蛋白的高效酶解和鉴定。通过更换固定的酶的种类还可在此基础上开发新型微流控芯片酶反应器，如血糖测定用微流控芯片酶反应器等。
权利要求
1.一种基于脲醛树脂涂层的蛋白酶解微流控芯片，其特征在于是通过蛋白水解酶与脲醛树脂预聚物表面的羟甲基反应，将酶固定在插于微流控芯片中玻璃纤维芯表面或者微流控芯片通道内表面而制备获得。
2.一种如权利要求1所述的基于脲醛树脂涂层的蛋白酶解微流控芯片的制备方法，其特征在于具体步骤如下(1)通过数控机械雕刻机在有机玻璃板上加工带有开口通道的微流控芯片基片，其中通道结构由计算机辅助设计软件设计；(2)微流控芯片基片带有开口通道的一面与一片相同大小的有机玻璃盖片合上并夹于两片玻璃片后，通过热压键合得有机玻璃微流控芯片；(3)将尿素溶于pH值为7.5^8. 0的甲醛溶液中，然后加热，形成脲醛树脂预聚物水溶液，并用水稀释到需要的浓度；(4)将玻璃纤维浸于脲醛树脂预聚物水溶液中，然后取出晾干；再浸入含有蛋白水酶的溶液水酸性中1-10小时，取出后插入有机玻璃微流控芯片中，即得可换芯蛋白酶解芯片； 或者将脲醛树脂预聚物水溶液注入有机玻璃微流控芯片通道中，然后用压缩空气吹干，得脲醛树脂预聚物表面修饰通道，然后将含有蛋白水酶的酸性水溶液注入，反应1-10小时， 即得一次性蛋白酶解微流控芯片。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中数控机械雕刻机加工的通道深度为1(Γ500微米，底部宽度25 200，上部宽度10(Γ500微米，且上部宽度大于底部宽度；步骤(2)中，在有机玻璃盖片对应于微流控芯片基片上通道的末端的位置钻有直径为 Γ3毫米的圆形小孔，用于进样和收集反应产物；步骤(2)中，热压封装温度为105-110°C，施加在两片玻璃板上的压力为0. 5飞公斤/ 平方厘米，热压时间为1(Γ20分钟。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(3)中脲醛树脂预聚物水溶液的重量浓度为5 50%。
5.根据权利要求2、3或4所述的制备方法，其特征在于步骤(4)中玻璃纤维的直径小于微流控芯片通道宽度和高度的最小值，以便纤维能插入通道。
6.根据权利要求2、3或4所述的制备方法，其特征在于步骤(4)中含有蛋白水酶的酸性水溶液中的酸是三氟乙酸、三氯乙酸，草酸或氯化铵。
7.根据权利要求2、3或4所述的制备方法，其特征在于步骤(4)中含有蛋白水酶的酸性水溶液中的蛋白水解酶的含量为广10毫克/毫升。
全文摘要
本发明属微流控芯片技术领域，具体为一种基于脲醛树脂涂层的蛋白酶解微流控芯片及其制备方法。本发明将尿素溶于甲醛溶液后加热得脲醛树脂预聚物溶液，将玻璃纤维浸于该溶液中，取出晾干后在其表面形成含活性基团的脲醛树脂预聚物涂层，然后将其浸入含蛋白水解酶的溶液中进一步缩合得固定有蛋白水解酶的脲醛树脂涂层，将修饰后的纤维插入微流控芯片通道内得可换芯蛋白酶解微流控芯片。或者将脲醛树脂预聚物溶液注入微流控芯片通道内，吹干后形成的涂层与含蛋白水解酶的溶液作用得一次性蛋白酶解微流控芯片。本发明可简化芯片制作步骤和降低芯片制作成本，为蛋白的高效酶解和高通量鉴定提供新的技术手段。
文档编号C12M1/40GK102277296SQ20111018058
公开日2011年12月14日 申请日期2011年6月30日 优先权日2011年6月30日
发明者张鲁雁, 樊惠芝, 陈刚 申请人:复旦大学