癌基因BRAF^V600E突变检测的引物和探针的制作方法

专利名称：癌基因BRAF^V600E突变检测的引物和探针的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，特别涉及用于检测癌基因BRAFv6cicie突变的多条引物和探针。
背景技术：
BRAF基因是一种癌基因，与ARAF、RAF1 (CRAF)基因同属RAF家族，位于7q34，长约 1901Λ。由其翻译的BRAF蛋白由783个氨基酸组成，有CR1、CR2和CR3三个保守区。BRAF 蛋白为丝苏氨酸蛋白激酶raf/mil家族成员，为Ras-Raf-MEK — ERK信号通路中上游重要调节因子。BRAF蛋白位于MAPK/ERK途径的入口处，它将细胞表面的受体和RAS蛋白通过 MEK和ERK与核内的转录因子相连接，从而调节细胞的分化、分裂。该通路被异常激活时，可促进细胞增殖、生长，最终导致肿瘤发生。Braf基因突变与肿瘤发生具有重要关联，对其展开深入研究具有重要价值。研究表明，在人类的多种肿瘤中存在不同频率的BRAF癌基因突变，最常见于恶性黑色素瘤(30-60% )、乳头状甲状腺癌09-83% )、结直肠癌(6-15%)。序列分析BRAF 突变形式共有40余种，主要集中在两个区域①位于exonll上的的突变，约占10%，常为 G463、G465、G468等的点突变；②位于eXonl5上的激活区突变约占90%，多为位于1799核苷酸上T突变(即V600E突变)，导致谷氨酸取代缬氨酸。BRAFv6cicie突变使BRAF蛋白持续激活导致MAPK激酶信号通路的磷酸激酶活性改变从而影响肿瘤的进展。因此，及时检测BRAF 突变发生情况，对早期筛选肿瘤病人以及对肿瘤个性化治疗、预后将具有重要的指导意义。 常用的BRAF突变检测方法主要有直接测序、限制性片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)等，但均存在一定的局限性。等位基因特异扩增实时定量PCR法具有克服序列多态性、高灵敏度的优点，目前在BRAF突变检测上的应用日益广泛。在等位基因特异扩增实时定量PCR检测方法中，引物和探针的设计尤为重要，决定了突变检测结果的有效性。

发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供用于检测癌基因BRAFv-突变的多条引物和探针。基于上述目的，本发明采用以下技术方案提供一种用于检测癌基因BRAFv6cicie突变的引物，包括通用下游引物BRAFR和只扩增突变型模板的突变特异性上游引物BRAFFE ；所述的突变特异性上游引物BRAFFE是下述序列中的任意一条SEQ NO. 1 5SEQ NO. 2 5SEQ NO. 3 5SEQ NO. 4:5SEQ Ν0· 5:5
-GTGATTTTGGTCTAGCTACTGA-3‘； -GTGATTTTGGTCTAGCTACTTA-3‘； -AAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACATA-3‘； -GGTGATTTTGGTCTAGCTACAAA-3‘； -ATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACTTA-3‘；
所述通用下游引物BRAFR是下述序列中的任意一条SEQ NO. 6:5' -GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3‘；SEQ NO. 7:5' -TAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAA-3‘。本发明还提供了一种用于检测癌基因BRAFv6cicie突变的引物，包括通用下游引物 BRAFR和能同时等效地扩增野生型和突变型模板的突变非特异性上游引物BRAFFV ；所述的突变非特异性上游引物BRAFFV是下述序列中的任意一条SEQ NO. 8:5' -AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAG-3‘；SEQ NO. 9:5' -AAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACA-3‘；所述通用下游引物BRAFR是下述序列中的任意一条SEQ NO. 6:5' -GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3‘；SEQ N0. 7:5' -TAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAA-3‘。本发明还提供了一种用于检测癌基因BRAFv6cicie突变的探针，所使用的探针为通用 LNA探针，探针两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸，所述通用LNA探针的序列为SEQ N0. 10:5' -FAM-GGT[+C]CCA[+Τ]CAG[+Τ]TTG[+A]ACA-BHQ 1-3‘。本发明还提供了一种用于检测癌基因BRAFv6cicie突变的探针，所使用的探针为通用TaqMan探针，探针两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸，所述的通用 TaqMan探针的序列为SEQ NO. 11 5' -FAM-ACAACTGTTCAAACTGATGGGACC-BHQ 1-3‘。本发明的具体原理是采用等位基因特异性扩增实时定量PCR方法(AS-PCR)判断肿瘤标本中是否存在癌基因BRAFv6-突变以及突变所占比例。所使用的引物包括一对突变特异性上游引物(只扩增突变型模板)和通用下游引物；一对突变非特异性上游引物(可同时等效地扩增野生型和突变型模板)和通用下游引物。所使用的探针为通用LNA探针或者TaqMan探针，探针两端分别标记荧光报告基团(R) 和荧光淬灭基团(Q)的寡核苷酸。在探针完整时，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收，在 PCR扩增过程中，DNA聚合酶的5’端外切酶活性将特异结合在靶核苷酸片断上的荧光探针酶切降解，使报告基团的荧光信号可以被检测，荧光信号量的变化与扩增产物量成正比，从而可以通过荧光强弱来判断待测样本中靶核苷酸序列的存在。探针部分碱基锁核酸化以增加探针对靶序列的识别能力和亲和力。本发明的有益效果在于(1)本发明提供的突变特异性引物和探针的检测灵敏度可以达到500拷贝/ml，说明其灵敏度良好。(2)本发明提供的突变特异性引物和探针检测不含BRAFv6cicie的样本时，其扩增曲线ct值>36，说明其特异性强。(3)由于本发明同时设计突变非特异性引物用于检测样本的总模板量，避免假阴性结果，方便质控。


图1为BRAFv6cicie突变检测用引物和探针实施案例1检测未突变样本扩增图2为BRAFv6cicie突变检测用引物和探针实施案例1检测突变样本扩增图。
具体实施例方式1.引物和探针的设计根据BRAF基因T1799A序列改变，分别在突变特异性上游引物的3’端引入一个或者多个碱基的突变使其特异性扩增突变型等位基因。在突变位点之外数碱基设计突变非特异性上游引物，用以同时扩增野生型和突变型等位基因。设计并筛选多对引物和探针，引物长度一般为20碱基左右。优化引物探针序列组合，使其达到最佳的特异性和灵敏度。选择如待检样本中没有BRAFV600E，用特异性引物扩增显示(^值> 36 的引物探针序列组合，具体实施案例如下实施案例1 (1)突变特异性上游引物BRAFFE-I序列为5' -GTGATTTTGGTCTAGCTACTGA-3‘。(2)突变非特异性上游引物BRAFFV-I序列为5-AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAG-3‘。(3)通用下游引物BRAFR-I序列为5' -GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3‘。(4)锁核酸探针序列5' -FAM-GGT[+C]CCA[+T]CAG[+T]TTG[+A]ACA-BHQ 1-3'。实施案例2 (1)突变特异性上游引物BRAFFE-I序列为5' -GTGATTTTGGTCTAGCTACTTA-3‘。(2)突变非特异性上游引物BRAFFV-I序列为5-AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAG-3‘。(3)通用下游引物BRAFR-I序列为5' -GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3‘。(4)锁核酸探针序列5' -FAM-GGT[+C]CCA[+T]CAG[+T]TTG[+A]ACA-BHQ1-3'。实施案例3 (1)突变特异性上游引物BRAFFE-I序列为5' -AAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACATA-3'。(2)突变非特异性上游引物BRAFFV-I序列为5' -AAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACA-3'。(3)通用下游引物BRAFR-I序列为5' -TAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAA-3'。(4) TaqMan 探针序列5' -FAM-ACAACTGTTCAAACTGATGGGACC-BHQ1-3‘。实施案例4:(1)突变特异性上游引物BRAFFE-I序列为5' -GGTGATTTTGGTCTAGCTACAAA-3‘。
(2)突变非特异性上游引物BRAFFV-I序列为5' -AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAG-3‘。(3)通用下游引物BRAFR-I序列为5' -GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3‘。(4) TaqMan 探针序列5' -FAM-ACAACTGTTCAAACTGATGGGACC-BHQ1-3‘。实施案例5 (1)突变特异性上游引物BRAFFE-I序列为5' -ATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACTTA-3‘。(2)突变非特异性上游引物BRAFFV-I序列为5' -AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAG-3‘。(3)通用下游引物BRAFR-I序列为5' -TAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAA-3'。(4) TaqMan 探针序列5' -FAM-ACAACTGTTCAAACTGATGGGACC-BHQ1-3‘。实施案例6 (1)突变特异性上游引物BRAFFE-I序列为5' -GTGATTTTGGTCTAGCTACTTA-3‘。(2)突变非特异性上游引物BRAFFV-I序列为5' -AAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACA-3'。(3)通用下游引物BRAFR-I序列为5' -TAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAA-3'。(4) TaqMan 探针序列5' -FAM-ACAACTGTTCAAACTGATGGGACC-BHQ1-3‘。2.反应体系的优化利用实体瘤术后冰冻组织或者石蜡组织作为检测标本，用 DNA抽提试剂盒^lIAamp DNA Mini Kit, Catalog no. 51306)进行提取，DNA溶液分装后贮存于-20°C。2. 1引物浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将引物浓度分别从 0. 1 μ mol/L至1. 6 μ mol/L作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较定最佳引物浓度是 0.3 μ mol/L。2. 2探针浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将探针浓度分别从， 确0. 05 μ mol/L至0. 5 μ mol/L作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较，确定最佳探针浓度是0. 1 μ mol/L。2. 3退火温度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，进行梯度PCR(56° 至64°退火温度)，通过对试验结果的分析比较，确定最佳退火温度是62°。利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定采用的BRAFv6cicie AS-PCR反应体系为25μ 1。按照两步法荧光定量PCR试剂盒说明进行反应液的配置。3.仪器检测通道的选择选择的荧光检测通道应与探针所标记的报告荧光基团一致，具体按照仪器使用说明书进行设置。4. PCR反应条件如下950C Imin ；95°C 15s，62°C lmin，40 个循环，在 62°C Imin 阶段收集荧光。5.检测结果分析如果待检样本中含有BRAFV6°°E，用特异性引物扩增时则显示阳性扩增曲线，其检测灵敏度可以达到500拷贝/ml ；如果待检样本中没有BRAFV6°°E，用特异性引物扩增时则显示阴性扩增曲线，即ct值> 36，提示上述引物对和探针具有良好的特异性和灵敏度。用非特异性引物扩增曲线检测样本的总模板量，总模板量< IO4拷贝/ml的样本视为不合格样本 (丢弃或浓缩后再分析)，总模板量> IO6拷贝/ml的样本适当稀释后重新分析。
权利要求
1.用于检测癌基因BRAFv6cicie突变的引物，包括通用下游引物BRAFR和只扩增突变型模板的突变特异性上游引物BRAFFE ；其特征在于，所述的突变特异性上游引物BRAFFE是下述序列中的任意--条SEQ NO.15'-GTGATTTTGGTCTAGCTACTGA-3‘；SEQ NO.25'-GTGATTTTGGTCTAGCTACTTA-3‘；SEQ NO.35'-AAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACATA-3SEQ NO.45'-GGTGATTTTGGTCTAGCTACAAA-3‘；SEQ NO.55'-ATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACTTA-3‘；所述通用下游引物BRAFR是下述序列中的任意一条SEQ NO. 6:5' -GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3‘；SEQ NO. 7:5' -TAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAA-3'。
2.用于检测癌基因BRAFv6cicie突变的引物，包括通用下游引物BRAFR和能同时等效地扩增野生型和突变型模板的突变非特异性上游引物BRAFFV ；其特征在于，所述的突变非特异性上游引物BRAFFV是下述序列中的任意一条SEQ NO. 8:5' -AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAG-3‘； SEQ NO. 9:5' -AAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACA-3'； 所述通用下游引物BRAFR是下述序列中的任意一条 SEQ NO. 6:5' -GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3‘； SEQ NO. 7:5' -TAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAA-3'。
3.用于检测癌基因BRAFv6cicie突变的探针，所使用的探针为通用LNA探针，其特征在于， 探针两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸，所述通用LNA探针的序列为SEQ NO. 10:5' -FAM-GGT[+C]CCA[+Τ]CAG[+Τ]TTG[+A]ACA-BHQ 1-3'。
4.用于检测癌基因BRAFv6cicie突变的探针，所使用的探针为通用TaqMan探针，其特征在于，探针两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸，所述的通用TaqMan探针的序列为SEQ NO. 11 5' -FAM-ACAACTGTTCAAACTGATGGGACC-BHQ1-3‘。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，旨在提供一种检测癌基因BRAFV600E突变的多条引物和探针。本发明的引物和探针分别包括突变特异性上游引物、突变非特异性上游引物和通用下游引物以及通用探针，如SEQ NO.1～11所示。本发明提供的突变特异性引物和探针的检测灵敏度可以达到500拷贝/ml，灵敏度良好；不含BRAFV600E的样本时，其扩增曲线ct值≥36，特异性强；由于本发明同时设计突变非特异性引物用于检测样本的总模板量，避免假阴性结果，方便质控。
文档编号C12N15/11GK102242207SQ20111018113
公开日2011年11月16日 申请日期2011年6月29日 优先权日2011年6月29日
发明者滕小东, 滕理送, 王伟斌, 王浩浩, 符芳芳, 蒋微琴 申请人:浙江大学