专利名称：人原癌基因kg-20和其中编码的蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的原癌基因和其中编码的蛋白质，其可以用于各种癌症的诊断，转基因动物的制备，反义基因治疗和抗癌药物的开发。
背景技术：
包括人类的高等动物各自携带大约100,000个基因，但其只有大约15％被表达，并且取决于哪个基因被表达来决定个体的生物过程的特性，例如生殖，分化，体内稳态，对刺激的响应，细胞分裂周期的控制，老化和细胞程序死亡(编程性细胞死亡)(Liang，P.和A.B.Pardee，Science257967-971，1992)。
致病现象如肿瘤发生是由致使基因表达模式改变的基因突变所导致的。因此，已经进行在各种细胞中基因表达的比较研究以为建立理解不同生物学现象的可行方法提供基础。
已经报导肿瘤发生是由各种遗传变化如染色体杂合性的丢失，癌基因的激活和抑癌基因例如p53基因的失活所导致的(Bishop，J.M.，Cell64235-248，1991；和Hunter，T.，Cell 64249-270，1991)。另外，已经报导10-30％的人类癌症起因于通过原癌基因扩增的癌基因的激活。
因此，原癌基因的激活在许多肿瘤的病原学中起重要作用，存在鉴定原癌基因的需要。
本发明人已经努力阐明了子宫颈癌的肿瘤发生中涉及的机制；并且已经意外地发现新的原癌基因，人子宫颈癌原癌基因1(HCCR-1)(韩国专利申请2000-16757(3月31日，2000年))和HCCR-2(韩国专利申请2000-71202(11月28日，2000年))在癌细胞中特异性地过表达。原癌基因通过构象变化导致对应的蛋白质产物表达的定量和定性变化(Weinberg，R.A.，Cancer Research 493713-3721，1989)。构象改变的癌蛋白质破坏细胞表面，细胞质或细胞核中的信号转导途径；当缺乏抑癌基因产物时，它与其它癌蛋白质一起刺激细胞增殖，扰乱细胞周期和破坏细胞死亡(编程性细胞死亡)机制(Todd，R.，Anticancer Research194729-4746，2000)。
由Fields等(Fields，S.和Song，O.，Nature 340245-246，1989)在1989年为检测这种蛋白质-蛋白质相互作用而开发的酵母双杂交方法已经被广泛应用来阐明细胞死亡机制(Wallach，D.等，Curr.Opin.Immunol.10131-136，1989)以及使用各种遗传工具的其它生物过程(Pandey，A.和Mann，M.，Nature 405837-846，2000)。
在使用酵母双杂交方法筛选与原癌基因KG-19结合的新的蛋白质期间，本发明人已经发现新的人原癌基因，表达与原癌基因KG-19特异性结合的蛋白质的KG-20。原癌基因KG-20可以有利地用于各种癌症，例如白血病，淋巴瘤，结肠癌，乳癌，肾癌，胃癌，肺癌，卵巢癌和子宫癌的诊断，预防和治疗。
发明概述因此，本发明的一个目的是提供新的原癌基因及其片段。
本发明的其它目的是提供包含所述原癌基因或其片段的重组载体和以此转化的微生物；在所述原癌基因和其片段中编码的蛋白质；用于诊断癌症的试剂盒，其包含所述原癌基因或其片段；用于诊断癌症的试剂盒，其包含所述蛋白质或其片段；具有与所述原癌基因或其片段互补的碱基序列的反义基因；通过使用所述反义基因治疗或预防癌症的方法；和通过使用所述原癌基因或其片段筛选候选抗癌药物的方法。
按照本发明的一个方面，提供具有SEQ ID NO1核苷酸序列的新的原癌基因或其片段。
按照本发明的另一方面，提供包含所述原癌基因或其片段的重组载体和用所述载体转化的微生物。
按照本发明的另一方面，提供一种具有衍生于所述原癌基因或其片段的SEQ ID NO2的氨基酸序列或其片段的蛋白质。
附图简述当与分别显示的附图结合时，本发明的上述和其它目的与特征将从本发明的下列描述中变得明显。
图1A在人癌细胞系(早幼粒细胞白血病HL-60细胞，Hela子宫颈癌细胞，慢性骨髓性白血病K-562细胞，成淋巴细胞白血病MOLT-4细胞，伯基特淋巴瘤Raji细胞，SW480结肠癌细胞，A549肺癌细胞和G361黑素瘤细胞)中表达的原癌基因KG-20的RNA印迹分析结果；图1B在用β-肌动蛋白与图1A相同的样品杂交后获得的结果；图2A单层培养的野生型人胚肾293细胞的相差特征；图2B单层培养的KG-20-转染的人胚肾293细胞的相差特征；图3单层培养的KG-20-转染的人胚肾293细胞的苏木精-伊红染色；图4裸鼠中KG-20细胞的肿瘤发生；图5显示在KG-20转染的人胚肾293细胞中在IPTG诱导之前和之后的蛋白质表达图谱的十二烷基硫酸钠(SDS)-PAGE结果。
发明详述本发明的新原癌基因，命名为KG-20，包括622个碱基对并且具有SEQID NO1的DNA序列。该KG-20原癌基因与在韩国专利公开出版物2002-41553中描述的人原癌基因KG-19(以下“KG-19”)特异性结合。
在SEQ ID NO1中，对应于碱基74-613的可读框是全长蛋白质编码区，从那里衍生的预测的氨基酸序列在SEQ ID NO2中显示，其包括179个氨基酸(“KG-20蛋白质”)。然而，考虑到密码子的简并性和在其中将表达本发明的原癌基因的特定动物中的优选密码子，例如在其编码区中不有害地改变表达的蛋白质的氨基酸序列，或者在非编码区中不有害地影响原癌基因的表达可以进行SEQ ID NO1的DNA序列的各种改变和修饰。因此，本发明在它的范围内还包括具有与本发明的原癌基因及其片段基本上相同的碱基序列的多核苷酸。如这里所用，“基本上相同的多核苷酸”指其碱基序列显示与本发明的原癌基因80％或更高，优选90％或更高，最优选95％或更高的同源性的多核苷酸。
由本发明的原癌基因表达的蛋白质包含179个氨基酸，具有SEQ IDNO2的氨基酸序列。该蛋白质的分子量大约为20kDa。本发明的原癌基因KG-20不同于人计时蛋白质(timing protein)，CLK-1(Vajo，Z.等，Am.J.Hum.Genet.61A263-A263，1997)，因为在CLK-1的第34和第134位的精氨酸残基分别被在SEQ ID NO2中丙氨酸和赖氨酸(lycine)所替代。
然而，可以进行蛋白质氨基酸残基的各种置换，添加和/或者缺失而不有害地影响蛋白质的功能。另外，当实现特定的目的时可以使用蛋白质的一部分。这些修饰的氨基酸及其片段也包括在本发明的范围内。因此，本发明在它的范围内包括具有与衍生于本发明的癌基因及其片段的蛋白质基本上相同的氨基酸序列的多肽。如这里所用，“基本上相同的多肽”指其氨基酸序列显示与SEQ ID NO2的氨基酸序列80％或更高，优选90％或更高，最优选95％或更高的同源性的多肽。
本发明的原癌基因，或蛋白质可以从人胎盘组织获得或使用常规的DNA或肽合成方法合成。另外，可以将这样制备的基因插入常规载体中以获得表达载体，其反过来可以导入适当的宿主中，例如，如大肠杆菌或酵母的微生物，或者如小鼠或人细胞的动物细胞。将用原癌基因KG-20转化的细胞命名为“KG-20细胞”。
转化的宿主然后可以用于大规模生产本发明的DNA或蛋白质。例如，用包含本发明的KG-20基因的表达载体pCEV-LAC(Miki，T.等，Gene83137-146，1989)转化大肠杆菌DH5α以获得命名为DH5α/KG-20/pCEV-LAC的大肠杆菌转化子，按照布达佩斯条约关于用于专利程序目的的国际认可的微生物存放，于2001年6月2日保藏在韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(地址韩国生物科学和生物技术研究院(KRIBB)，#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，305-333，韩国)，保藏号为KCTC1028BP。
在制备载体中，根据所用宿主细胞适当地选择和组合表达控制序列，例如启动子，终止子，自复制序列和分泌信号。
本发明的原癌基因的过量表达在癌组织，例如白血病，淋巴瘤，肾癌，肺癌，胃癌和皮肤癌细胞系中发生，其提示本发明的原癌基因诱导这些癌症。另外，当用本发明的原癌基因转染正常的人胚肾(HEK)293细胞时，产生异常细胞。用光学和电子显微镜观察的形态特征显示异常细胞具有肿瘤细胞的形态。通过使用苏木精-伊红染色方法，可以证实该肿瘤细胞是癌性的(癌)。
当用本发明的原癌基因转染正常的HEK293细胞并将其注入裸鼠的背部时，在从注射大约21天后观察到肿瘤发生，肿瘤大小在35天内变成2.0cm×2.0cm。
因此，认为本发明的原癌基因是所有形式的癌症共同的因子，并且它可以有利地用于各种癌症的诊断和转基因动物的生产，以及反义基因治疗和抗癌药物的开发中。
可以使用本发明的原癌基因进行的诊断方法可包含例如，用包含本发明的原癌基因或其片段的探针与分离自受试者体液的核酸杂交，和通过使用本领域的常规检测方法确定该受试者是否具有原癌基因的步骤。通过用放射性同位素或酶标记探针可以容易地检测原癌基因的存在。因此，包含本发明的原癌基因或其片段的癌症诊断试剂盒也被包括在本发明的范围内。
通过将本发明的原癌基因引入哺乳动物例如大鼠中生产的转基因动物也被包括在本发明的范围内。在生产该转基因动物的过程中，优选在第8细胞周期阶段之前将本发明的原癌基因导入动物的受精卵。该转基因动物可以有利地用于致癌剂或抗癌剂如抗氧化剂的筛选。
本发明还提供用于基因治疗的反义基因。如这里所用，术语“反义基因”指包含与mRNA序列完全或部分互补的碱基序列的多核苷酸，所述mRNA是由具有SEQ ID NO1碱基序列的原癌基因或其片段转录而来，通过将它自己附着在mRNA的蛋白质结合位点上所述核苷酸能够抑制原癌基因可读框(ORF)的表达。
本发明在它的范围内还包括通过对需要其的受试者给药治疗有效量的本发明的反义基因治疗或预防癌症的方法。
在本发明的反义基因治疗中，将本发明的反义基因以常规方法对受试者给药以抑制原癌基因的表达。例如，根据由Kim，J.S.等公开的方法(J.Controlled Release 53175-182，1998)通过静电相互作用将疏水化的聚-L-赖氨酸衍生物与反义寡脱氧核苷酸(ODN)混合，并将得到的混合的反义ODN对受试者静脉内给药。
本发明在它的范围内还包括包含本发明的反义基因作为活性成分，如果需要，结合药用载体，赋形剂或其它添加剂的抗癌组合物。优选配制本发明的药物组合物来通过注射给药。
实际给药的反义基因的量应该根据包括治疗的疾病，所选的给药途径，个体患者的年龄和体重，以及患者症状的严重性的各种相关因素来确定。
由本发明的原癌基因表达的蛋白质可以用于生产用作诊断工具的抗体。本发明的抗体可以按照本领域已知的任何方法，通过使用具有SEQ IDNO2的氨基酸序列或其片段的蛋白质以单克隆或多克隆抗体的形式制备。可以使用本领域已知的任何方法，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射免疫测定(RIA)，夹心式测定，免疫组织化学染色，蛋白质印迹或者在聚丙烯凝胶上的免疫测定印迹来评估在受试者的体液中是否表达该蛋白。因此，包含具有SEQ ID2的氨基酸序列或其片段的蛋白质的癌症诊断试剂盒也被包括在本发明的范围内。
通过使用本发明的原癌基因可以建立可连续存活的癌细胞系，该细胞系可以例如通过注射用本发明的原癌基因转化的成纤维细胞从在裸鼠背部形成的肿瘤组织中获得。如此制备的细胞系可以有利地用于抗癌剂的搜索。
本发明在它的范围内还包括通过使用所述原癌基因或其片段筛选候选抗癌药物的方法。
下列实施例和检验实施例是仅为举例说明而给出的，并不是意欲限制本发明的范围。
实施例1酵母双杂交鉴定为了发现人原癌基因KG-19(Genebank登记号AF283671)蛋白质产物的结合蛋白，通过按照先前报导的方法(Golemis，E.A.，等，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.第20.0和20.1章，1996)使用MATCHMAKER LexA双杂交系统(Clontech Laboratories，Inc.，U.S.A.)进行酵母双杂交试验。
下列实验中所用的细胞系和载体在Clontech Laboratories，Inc.的目录号K1609-1试剂盒中列出。
用载体p8op-lacZ转化酵母菌株EGY48并在SD/-尿嘧啶/葡萄糖平板，不含尿嘧啶的合成漏失培养基(dropout medium)上培养。选择在该平板中生长的菌落，在SD/-尿嘧啶/葡萄糖培养基中培养，并用通过将KG-19基因插入作为“诱饵质粒”的载体pLexA的SalI和BamHI位点而制备的载体转化。
为了检验克隆在载体pLexA中的KG-19基因的表达，进行使用LexA抗体的蛋白质印迹。结果显示37kDa的条带。
在SD/-尿嘧啶，-组氨酸/葡萄糖培养基中培养表达KG-19基因的菌落，用载体pBD42AD转化，所述载体pBD42AD是人胎脑-衍生的AD(激活区)融合文库。为了证实诱饵与文库的结合，进行菌落转移试验(Breeden，L.和Nasmyth，K.，Cold Spring Harbor Symposium Quant.Bio.50643-650，1985)。诱饵与文库的相互作用诱导在X-gal平板中蓝色菌落的形成。使用玻璃珠从培养的酵母中纯化DNA，通过电穿孔用纯化的DNA转化大肠杆菌KC8并涂布在M9基本培养基上以选择转化体。从选择的转化体中纯化质粒DNA并转化于大肠杆菌DH5α中。然后，将从选择的大肠杆菌转化体中纯化的DNA进行HindIII消化，以获得含有0.6kbDNA的克隆。
实施例2原癌基因KG-20的总cDNA测序分析按照双脱氧链终止法使用Sequenase 2.0版DNA测序试剂盒(UnitedStates Biochemical，Cleveland，OH，U.S.A.)将在实施例1中获得的克隆进行测序分析。该克隆被鉴定为新的原癌基因，其包括如SEQ ID NO1中所述的622个碱基对，并且它被命名为“KG-20”。将全长KG-20 cDNA克隆的核苷酸序列登记在GenBank中，登记号为AF374413。
在SEQ ID NO1中，对应于碱基74-613的KG-20的完整的可读框是蛋白质编码区，从其中衍生的预测的氨基酸序列在包括179个氨基酸的SEQ ID NO2中显示。
从噬菌体λ中分离包含KG-20基因的λpCEV，并用NotI切割以获得抗氨苄青霉素的pCEV-LAC。用DNA连接酶连接pCEV-LAC以获得表达KG-20基因的重组载体。用重组载体转化大肠杆菌DH5α以获得命名为DH5α/KG-20/pCEV-LAC的转化的大肠杆菌，其在2001年6月2日保藏在韩国典型培养物保藏中心(地址，#52，Oun-dong，Yusong-ku，大田，305-333，韩国)，保藏号为KCTC 1028BP。
实施例3RNA印迹分析为了测定KG-20基因在各种组织中的表达水平，如供应商(Clontech)所推荐使用包含被印迹在尼龙膜上、纯化的8种癌细胞的RNAs的人癌细胞系样品还进行RNA印迹分析(图1A和1B)。
印迹在68℃与32P-标记的随机引物KG-20 cDNA探针杂交过夜，所述随机引物KG-20 cDNA探针是使用Rediprime II随机引物标记系统(Amersham，England)制备。重复RNA印迹分析两次，结果通过光密度测定法定量。将相同的印迹与β-肌动蛋白探针杂交以标准化mRNA的量。
图1A显示使用KG-20 cDNA探针，在人癌细胞系，即早幼粒细胞白血病HL-60细胞，Hela子宫颈癌细胞，慢性骨髓性白血病K-562细胞，成淋巴细胞白血病MOLT-4细胞，伯基特淋巴瘤Raji细胞，SW480结肠癌细胞，A549肺癌细胞和G361黑素瘤细胞中表达的KG-20基因的RNA印迹分析；图1B，与β-肌动蛋白探针杂交的相同印迹。如图1A所示，在伯基特淋巴瘤Raji，早幼粒细胞白血病HL-60，Hela子宫颈癌细胞，慢性骨髓性白血病K-562，成淋巴细胞白血病MOLT-4细胞，SW480结肠癌细胞，A549肺癌细胞，和G361黑素瘤细胞中检测到KG-20的0.6kb的转录物。特别是Raji显示与其它癌细胞相比更高的转录水平。
实施例4表达载体的构建和动物细胞的转染(步骤1)包含KG-20的载体的制备如下构建包含KG-20编码区的表达载体。
首先，用SalI/BamHI消化通过将Flag基因插入真核表达载体pcDNA3(Invitrogen，U.S.A.)构建的融合载体N-末端pFlag-CMV。用SalI/BamHI消化含有全编码序列(对应于SEQ ID NO1中的碱基74-613)的KG-20基因，将产生的SalI/BamHI片段插入SalI/BamHI消化的N-末端pFlag-CMV。使用脂质转染胺(Gibco BRL)将产生的载体N-末端pFlag-CMV/KG-20导入HEK 293上皮细胞(ACTC CRL 1753，U.S.A.)，然后在补充以G418(Gibo，U.S.A)的培养基上筛选。用KG-20转染产生的HEK293细胞被命名为“KG-20细胞”。
(步骤2)用原癌基因KG-20转染的人胚肾293上皮细胞将野生型HEK 293细胞和在步骤1中获得的KG-20细胞各自在包含10％血清的DMEM培养基中单层培养，用相差显微镜(Olympus，U.S.A.)观察生长特征。图2A和2B显示单层培养的野生型HEK 293细胞和KG-20-转染的HEK 293细胞的相差特征。如图2A所示，野生型HEK293细胞作为上皮细胞增殖，每个具有纺锤形，长的细小的细胞核和不足的细胞质。在KG-20细胞的情形中，细胞形状变成具有卵圆形的细胞核和饱满的细胞质的多角形，如图2B所示。
用苏木精-伊红(H&E)染色的单层培养的KG-20细胞显示如图3所示的核的多形性，清晰的核仁(distinct nucleoli)，颗粒状染色质图案，肿瘤巨细胞和非典型的有丝分裂图形。
实施例5原癌基因KG-20在动物中的致肿瘤性为了分析致肿瘤性，将5×106KG-20细胞皮下注射于9只裸鼠(5周龄无胸腺nu/nu在BALB/c背景下)的背部。在21天后所有注射KG-20细胞的9只小鼠显示可触知的肿瘤，在35天内肿瘤大小变成2.0cm×2.0cm，如图4所示。
实施例6在用原癌基因KG-20转染大肠杆菌后表达的蛋白质大小的测定将对应于SEQ ID NO1碱基74-613的原癌基因KG-20的全长编码序列区，其编码SEQ ID NO2的氨基酸1-179，插入与GST基因融合的载体pGEX 4T-3(Amersham Pharmacia Biotech.，U.S.A.)的多克隆位点的BamHI/NotI识别位点，将产生的载体pGEX 4T-3/KG-20转染于大肠杆菌BL21(ATCC 47092)之中。将转染的大肠杆菌接种于LB肉汤培养基并在旋转振荡培养箱中37℃培养16小时。在相同的培养基中1/100(v/v)稀释培养液并温育3小时。往那里加入1mM异丙基β-D-硫代半乳糖-吡喃糖苷(IPTG，Sigma)以诱导蛋白质的合成。
在IPTG诱导之前和之后，通过超声处理使培养物中的大肠杆菌细胞破裂并使用12％十二烷基硫酸钠(SDS)进行凝胶电泳。图5显示SDS-PAGE的结果，其显示用载体pGEX 4T-3/KG-20转染的大肠杆菌BL21菌株的蛋白质表达图谱。在IPTG诱导之后，在大约46kDa处观察到显著的蛋白质条带。该46kDa融合蛋白包含由载体pGEX 4T-3的基因表达的大约26kDa的GST蛋白。
尽管已经描述和举例说明了主题发明的实施方案，明显的是其中可以进行各种变化和改进而不背离应该仅由后附权利要求的范围限定的本发明的精神。
生物材料国际保藏和存活证明(译文)
序列表<110>金振宇<120>人原癌基因KG-20和其中编码的蛋白质<130>PCA20848/KJW<160>2<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>622<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(74)..(610)<400>1ggcgcgggaa ttcgattgga tccggacaca ctttataatc tttccagttg atattgtcta 60aagtcatgtc gacatg act tta gac aat atc aac ctg gca gct gtg106Met Thr Leu Asp Asn Ile Asn Leu Ala Ala Val1 5 10gat cga ata atc cgg gtg gat cat gca ggc gaa tat gga gca aac cgc 154Asp Arg Ile Ile Arg Val Asp His Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Asn Arg15 20 25atc tat gcc ggg cag atg gct gtc ctg ggt cgg acc agc gtc ggg cca 202Ile Tyr Ala Gly Gln Met Ala Val Leu Gly Arg Thr Ser Val Gly Pro30 35 40gtc att cag aaa atg tgg gat caa gaa aag gac cat ttg aaa aag ttc 250Val Ile Gln Lys Met Trp Asp Gln Glu Lys Asp His Leu Lys Lys Phe45 50 55aat gag ttg atg gtt atg ttc agg gtc cgg cca aca gtt ctg atg ccc 298Asn Glu Leu Met Val Met Phe Arg Val Arg Pro Thr Val Leu Met Pro60 65 70 75ttg tgg aac gtg ctg ggg ttt gca ctg ggg gcg ggg acc gcc ttg ctc 346Leu Trp Asn Val Leu Gly Phe Ala Leu Gly Ala Gly Thr Ala Leu Leu80 85 90ggg aag gaa ggt gcc atg gcc tgc acc gtg gcg gtg gaa gag agc ata 394Gly Lys Glu Gly Ala Met Ala Cys Thr Val Ala Val Glu Glu Ser Ile95 100 105
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Asn Gln Ile Arg Thr Leu Met Glu Glu Asp Pro Glu Lys Tyr Glu Glu115 120 125Leu Leu Gln Leu Ile Lys Lys Phe Arg Asp Glu Glu Leu Glu His His130 135 140Asp Ile Gly Leu Asp His Asp Ala Glu Leu Ala Pro Ala Tyr Ala Val145 150 155 160Leu Lys Ser Ile Ile Gln Ala Gly Cys Arg Val Ala Ile Tyr Leu Ser165 170 175Glu Arg Leu权利要求
1.一种具有SEQ ID NO1的碱基序列的人KG-20原癌基因或其片段。
2.权利要求1的原癌基因或片段，其中所述片段具有对应于SEQ IDNO1的碱基74-613的碱基序列。
3.一种具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白质或其片段。
4.一种包含权利要求1的原癌基因或片段的载体。
5.一种用权利要求4的载体转化的微生物。
6.权利要求5的微生物，其是大肠杆菌DH5α/KG-20/pCEV-LAC(保藏号KCTC 1028BP)。
7.一种制备权利要求3的蛋白质或片段的方法，其包含培养权利要求5或6的微生物。
8.一种用于诊断癌症的试剂盒，其包含权利要求1或2的原癌基因或片段。
9.一种用于诊断癌症的试剂盒，其包含权利要求3的蛋白质或片段。
10.一种反义基因，其具有与由权利要求1或2的原癌基因或片段转录的完整或部分mRNA序列互补的碱基序列，并且能够与所述mRNA结合以抑制所述原癌基因或片段的表达。
11.一种用于预防或治疗癌症的组合物，其包含治疗有效量的权利要求10的反义基因和药用载体。
全文摘要
具有SEQ ID1碱基序列的人原癌基因或其片段在各种癌组织中被过量表达并且可以用于诊断各种癌症，与其互补的反义基因可以用于治疗癌症。
文档编号C12N1/21GK1541269SQ02815848
公开日2004年10月27日 申请日期2002年8月10日 优先权日2001年8月13日
发明者金振宇 申请人:金振宇