专利名称：石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽基因及其成熟肽的表达系统、生产方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽基因及其 成熟肽的表达系统、生产方法与应用。
背景技术：
垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pituitary adenylate cyclase activatingpolypeptide,简称PACAP)，是下丘脑分泌的38个氨基酸的肽类物质。自1989 年被发现以来，随着对其越来越深入的研究，表明PACAP作为一个神经肽类激素，对中枢神 经系统和周围神经系统都有着重要的调控作用。由于其广泛的生物活性和生理活性所以对 脊椎动物的生长、发育、繁殖都有重要作用。
石斑鱼是海洋珊瑚礁鱼类，属魚旨科(Serranidae)石斑鱼属(Epin印helus))，有 30多种，石斑鱼是一种名贵的海水鱼类，具有极高的经济价值。石斑鱼的苗种培育是养殖生 产持续发展的关键，但目前在石斑鱼人工养殖中还没有一种能有效促进其苗种生长的饵料 添加剂，因此，迫切需要提供一种可以有效促进石斑鱼苗种生长的饵料添加剂。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种经人工改造的，有利于在酵母 中高效表达的重组石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因；本发明另一目的在于提供含有上述酵母表达的重组石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激 活多肽基因的表达载体；本发明另一目的是提供上述表达载体转化的重组工程菌株；本发明另一目的是提供上述重组石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽的成熟肽的 生产方法；本发明还有一个目的是提供上述石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽的成熟肽在 制备海水鱼类使用的生长和繁殖调控剂中的应用。本发明上述目的是通过以下技术方案予以实现的本发明酵母表达的重组石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因，如SEQ IDNO 1 所示，该基因序列是通过引物SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5经PCR扩增得到的。本发明构建了含有石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽的成熟肽基因序列的表达 载体，该载体的构建方法如下将通过引物搭桥PCR方法合成的斜带石斑鱼垂体腺苷酸 环化酶激活多肽基因经酶切和分离纯化后，接入到已有的相应载体的相应酶切位点(即 ECORI和Ν0ΤΙ)之间，即构建成所需的含有斜带石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因的 表达载体。其中，上述表达载体优选毕赤酵母表达载体pPICZ α Α,将斜带石斑鱼垂体腺苷酸 环化酶激活多肽基因经酶切和分离纯化后，接入到毕赤酵母表达载体PPICZ α A中，得到含有斜带石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因序列的表达载体pPICZ α A-PACAP。通过上述含有石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因序列的表达载体构建了能 高效表达石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽的成熟肽的重组毕赤酵母工程菌株。其中，上述重组毕赤酵母工程菌株优选含有斜带石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因序列的表达载体PPICZ α A-PACAP转化毕赤酵母X-33而得到的菌株 pPICZa A-PACAP-X-33。利用上述重组毕赤酵母工程菌株生产斜带石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽的 成熟肽的方法，包括如下步骤(1)菌种的培养发酵将菌种接种在含有zeocin的BMGY液体培养基中培养；(2)菌种的诱导表达将菌液沉淀去上清，收集的菌体重悬于BMGY液体培养基中 培养，加入甲醇进行诱导后收集上清，得到表达产物；(3)将表达产物进行分离纯化，得到重组石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽的成 熟肽。上述方法优选为如下步骤(1)菌种的培养发酵将菌种接种在含有zeocin的BMGY液体培养基中，30°C培养 过夜；(2)菌种的诱导表达将菌液沉淀去上清，收集的菌体重悬于BMGY液体培养基中， 30°C培养，每隔24小时加入0. 5%的甲醇进行诱导，36小时后收集上清，得到表达产物；(3)将表达产物进行分离纯化，得到重组石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽的成 熟肽。上述重组石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽的成熟肽可以直接用于制备适合海水鱼 尤其是石斑鱼属使用的生长和繁殖调控剂，也可以通过适当的赋形剂、保护剂按一定比例 形成组合物来应用。本发明提供的石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽基因通过与适当的载体连接后可在 相应的微生物菌株中高效表达，分离纯化后即可得高纯度的重组石斑鱼腺苷酸环化酶激活 多肽的成熟肽，而且具有表达水平高，容易纯化的优点。通过本发明，可以方便地大量生产 重组石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽的成熟肽，成本降低，这种来源稳定、成本便宜的重组石 斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽的成熟肽可进一步应用于制备适合海水鱼类尤其是石斑鱼属 使用的生长与繁殖调控剂。
图1是为斜带石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因设计的两段引物及PCR扩增 产物的凝胶电泳分析图；图2为重组表达载体pPICZ a A-PACAP的构建过程示意图；图3为是质粒pPICZ a A-PACAP的PCR鉴定和酶切分析，其中M为分子量标准；1、 2为PCR鉴定；NC为阴性对照；3、4为pPICZ a A/ECOR I+NOTI酶切鉴定；图4为重组毕赤酵母的PCR鉴定。其中M为分子量标准；NC为阴性对照；广9为不 同酵母转化子的PCR鉴定；图5为重组石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因表达产物的SDS-PAGE凝胶电泳图谱，其中M是蛋白分子量，Γ8是SDS-PAGE甲醇诱导的pPICZ α A-PACAP-X-33,NC是阴 性对照 pPICZ α Α-Χ-33 ；图6为重组石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因表达产物的Western blot图 谱，其中NC是阴性对照，1、2和3是甲醇诱导的pPICZ α A-PACAP_X_33 ；图7为投喂的石斑鱼的GHRH(生长激素释放激素)做的定量PCR分析的柱状图， 其中lug/ul的表达量具有显著差异；图8为对投喂的石斑鱼的SS (生长激素抑制激素)做的定量PCR分析的柱状图， 其中2ug/ul的表达量具有显著差异；图9为对投喂的石斑鱼的GH(生长激素)做的定量PCR分析的柱状图，其中Iug/ ul的表达量具有显著差异。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何限定。实施例1酵母表达的重组石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因上游引物和下 游引物的设计由于斜带石斑鱼的垂体腺苷酸环化酶激活多肽的成熟肽的片段长度只有114bp， 故通过一次PCR就可以完成对原序列的基因突变。因此，根据已知的斜带石斑鱼垂体腺苷 酸环化酶激活多肽基因(如SEQ ID N0:6所示)，结合和酵母密码子偏好性设计两端75bp 左右的引物，经PCR扩增垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因的成熟肽。上游引物序列如SEQ ID NO 4所示，下游引物序列如SEQ IDNO 5所示。实施例2重组石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因的人工合成用上游引物和下游引物搭桥，普通的PCR反应就可以扩出目的基因，PCR反应体系 如下IOXbufferIOuldNTP(10mmol/L)8ul上游引物IOOpmol下游引物IOOpmol聚合酶(5u/ul)0. 2ulddH20加至 IOOul。反应条件为95°C预变性3min，95°C变性15s，从56°C退火15s，72°C延伸20s，最 后72°C延伸2min，扩增35个循环，得到序列如SEQ ID N0:1所示。通过SEQ ID N0:1和 SEQ ID NO :6对比可以看出，核苷酸序列有了很大的改变，但是氨基酸序列完全一样，如SEQ ID NO 3 所示。实施例3含石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因的毕赤酵母表达载体 pPICZ α A-PACAP 的构建质粒pPICZ α A经限制酶EcoR I和NOT I双酶切后，酶切产物用Ε. Ζ. N. A. Gel Extraction Kit回收后分离纯化3. 6kb的片段。接着再将实施例1的PCR产物用ECOR I和 NOT I进行双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳(图1)，酶切产物用Ε. Ζ. N. A. Gel Extraction Kit回收，分离纯化约120bp的斜带石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因片段。将这两段回收产物用MBI T4连接酶22°C连接16小时后用标准氯化钙转化法转入大肠杆菌Diitb 中，筛选具zeocin抗性的转化子，以标准方法提取质粒，用限制酶ECOR I及NOT I双酶切 重组质粒，得到120bp和3. 6kb的两个片段，大小分别与斜带石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活 多肽基因片段和表达载体PPICZ α A大小相同，证明斜带石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多 肽基因已克隆入表达载体PPICZ α A中，重组质粒命名为pPICZ α A-PACAP0质粒构建图和酶 切分析图分别见图2及图3。实施例3高效表达重组石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽的成熟肽的毕赤酵母 菌重组株pPICZ α A-PACAP-X-33的构建和鉴定Sacl线性化酶切质粒pPICZ α A-PACAP，浓缩，电击转化毕赤酵母X_33，在YPD平板 中(含lOOug/ml的zeocin抗性)，PCR检测目的基因是否插入，检测到插入片段后，在不同 的zeocin抗生素上进行高拷贝筛选(图4)。实施例4利用毕赤酵母菌重组株pPICZ α A_PACAP_X_33生产重组石斑鱼垂体腺苷 酸环化酶激活多肽的成熟肽
挑取毕赤酵母菌重组株pPICZ α A-PACAP-X-33单菌落接种在含有100ug/ml zeocin的BMGY液体培养基中，30°C，250rpm培养过夜至OD 600为2 6，收集菌体，去上清， 将菌体重悬于BMMY液体培养基中，24小时后添加甲醇，使其终浓度为0. 5%，于30°C诱导培 养36小时后收集上清。合成的重组石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽的成熟肽在毕赤酵 母工程菌pPICZO A-PACAP-X-33中已获得高效表达。取少量细胞加2X电泳上样缓冲液，煮沸5分钟后跑SDS-PAGE凝胶电泳。结果见 图5，显示经诱导的pPICZ α A-PACAP-X-33在约7kd的位置上出现一条新的蛋白带且与预期 表达融合蛋白大小相符合，阴性对照PPICZ α Α-Χ-33不出现此带，证明重组石斑鱼垂体腺 苷酸环化酶激活多肽的成熟肽已在pPICZ α A-PACAP-X-33中诱导表达。将重组石斑鱼pPICZ α A-PACAP-X-33采用免疫印迹(Western blot)方法进行免 疫活性鉴定。一抗为N0VAGEN公司提供的小鼠His标签单克隆抗体，二抗为博士德生物有 限公司提供的辣根过氧化物酶标羊抗小鼠IgG。结果显示小鼠His标签单克隆抗体能识别 我们用毕赤酵母表达的融合PACAP蛋白，而且可以看到不管是SDS-PAGE胶还是Western blot有些克隆的表达蛋白的过程中有不同程度的磷酸化或糖基化，因而蛋白不是单一的一 条带，证明得到的蛋白是重组斜带石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽(图6)。实施例5石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽的成熟肽对石斑鱼苗鱼苗的体重、摄 食量的影响以及相关调控基因表达量变化实验包括(1)饵料的制作基础饵料由中山大学水生经济动物研究所提供，重组 蛋白在纯化后稀释成不同浓度后用喷壶均勻喷洒在基础饵料上面，室温自然风干后冷冻保 存。制成的三种饵料中重组PACAP的浓度分别约为0. 5ug/g、lug/g和2ug/g。对照组不喷 洒任何试剂，直接投喂饲料。(2)实验鱼的分组和驯养实验鱼按每组16 17尾分组，每个浓度梯度分三个平行 组每天于8:30和16:00用基础饵料投喂两次，喂饱为止.驯养时间为疒10天，直到稳定摄 食为止。(3)投喂实验事先测好所要投喂的石斑鱼的体重体长，用不同的饲料分别对实 验鱼进行投喂，投喂时间和方法和驯养时一致，投喂时间为期两个月。每天检测摄食量，水温。每一周测量实验鱼的体重这些表观特征。数据统计分析见表1。(4)实验测量与取样最后一次投喂的次日早上8 00取样，然后测量体长，体重，然 后用湿润的毛巾将鱼包住，迅速切开鱼的颅骨和腹腔取出垂体、下丘脑、全脑、垂体、胃、肠、 肝脏和肌肉装入DEPC水处理的离心管中，液氮速冻。所有样品液氮速冻保存带回实验室， 存放于-80°C低温冰箱备用。分子试验所用各种试剂、消耗品和容器均用DEPC水处理，解剖 器具和玻璃器皿经180°C烘烤5小时，以灭活RNA酶。记录每个实验组饲料的投喂量。(5)将取到的样品提RNA(invitrogen)，进行cDNA反转录(Τ0Υ0Β0的试剂盒)，对 要检测的目的基因进行定量PCR检测(Τ0Υ0Β0的试剂盒)。实验结果如图疒9。表1饵料对石斑鱼的体重及存活率的影响
对照组0.5ug/glug/g2ug/g 石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因及其成熟肽的表达系统、生产方法与应用 SEQUENCE LISTING<110>中山大学<120>石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因及其成熟肽的表达系统、生产方法 与应用<130><160>6<170>PatentIn version 3. 2<210>1<211>114<212>DNA<213>人工序列<400>1cactctgacg gtatcttcac cgactcttac tctcgctacc gtaagcaaat ggctgtccaa 60aagtacctgg ctgctgtcct gggtcgtcgg taccgtcaac gtgtccgtaa caag114<210>2<211>114<212>DNA<213>人工序列<220> <221>CDS<222>(1). . (114)<400>2cac tct gac ggt ate ttc acc gac tct tac tct cgc tac cgt aag caa48His Ser Asp Gly lie Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln151015atg get gtc caa aag tac ctg get get gtc ctg ggt cgt egg tac cgt96Met Ala Val Gln Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Arg Arg Tyr Arg202530caa cgtgtccgt a a c aag 114Gln Arg Val Arg Asn Lys35<210>3<211>38<212>PRT<213>人工序列<400>3His Ser Asp Gly lie Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln151015Met Ala Val Gln Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Arg Arg Tyr Arg202530Gln Arg Val Arg Asn Lys35<210>4<211>75<212>DNA<213>人工序列<400>4cgggaattcc actctgacgg tatcttcacc gactcttact ctcgctaccg taagcaaatg 60gc t g t c c a a aagtac 75
<210>5<211>74石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因及其成熟肽的表达系统、生产方法与应用<212>DNA<213>人工序列<400>5gacgcggccg ccttgttacg gacacgttga cggtaccgac gacccaggac agcagccagg 60t a c t t t t g g acagc 74<210>6<211>114<212>DNA<213>人工序列<400>6cattcagatg ggatcttcac cgacagctac agtcgctata gaaagcagat ggccgtgcag 60
aaatacctgg cagcggttct gggaagaagg tacagacaga gagttaggaa caaa 11权利要求
一种酵母表达的重组石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因，其特征在于如SEQ ID NO1所示，该基因序列是通过上游引物SEQ ID NO4和下游引物SEQ ID NO5经PCR扩增得到的。
2.一种表达载体，其特征在于该表达载体含有权利要求1所述的酵母表达的重组石斑 鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于所述酵母表达的重组石斑鱼垂体腺苷 酸环化酶激活多肽基因位于载体的ECORI和NOTI之间。
4.根据权利要求2或3所述的表达载体，其特征在于该表达载体为毕赤酵母表达载体 pPICZα A-PACAP0
5.一种重组工程菌株，其特征在于该菌株是将权利要求2所述的表达载体转入毕赤酵 母中，形成重组毕赤酵母工程菌株。
6.根据权利要求5所述的重组工程菌株，其特征在于该菌株是将权利要求3所 述的表达载体pPICZa A-PACAP转入毕赤酵母Χ-33中，形成的重组毕赤酵母菌株 pPICZa A-PACAP-X-33。
7.利用权利要求5所述的重组毕赤酵母菌株生产石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽 的成熟肽的方法，其特征在于包括如下步骤(1)菌种的培养发酵将菌种接种在含有zeocin的BMGY液体培养基中培养；(2)菌种的诱导表达将菌液沉淀去上清，收集的菌体重悬于BMGY液体培养基中培养， 加入甲醇进行诱导后收集上清，得到表达产物；(3)将表达产物进行分离纯化，得到重组石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽的成熟肽。
8.根据权利要求7所述的利用重组毕赤酵母菌株生产石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活 多肽的成熟肽的方法，其特征在于包括如下步骤(1)菌种的培养发酵将菌种接种在含有zeocin的BMGY液体培养基中，30°C培养过夜；(2)菌种的诱导表达将菌液沉淀去上清，收集的菌体重悬于BMGY液体培养基中，30°C 培养，每隔24小时加入0. 5%的甲醇进行诱导，36小时后收集上清，得到表达产物；(3)将表达产物进行分离纯化，得到重组石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽的成熟肽。
9.权利要求1所述的石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽的成熟肽在制备石斑鱼类使 用的生长与繁殖调控制剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种酵母表达的重组石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因，其序列如SEQ ID NO1所示，该基因序列是通过引物SEQ ID NO4和SEQID NO5经PCR扩增得到的。本发明还构建了含有该酵母表达的重组石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因的表达载体和重组毕赤酵母表达菌株。本发明还公开了利用重组毕赤酵母表达菌株生产斜带石斑鱼垂体腺苷酸环化酶激活多肽的成熟肽序列的方法及其应用。利用本发明可以获得来源稳定、成本便宜的石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽重组蛋白，并进一步制备适合海水鱼类使用的鱼苗苗种促生长剂或添加剂。
文档编号A23K1/165GK101845440SQ20091019346
公开日2010年9月29日 申请日期2009年10月30日 优先权日2009年10月30日
发明者李文笙, 林浩然, 欧阳静 申请人:中山大学