专利名称：：癌细胞内核酸酶激活剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及癌细胞内核酸酶激活剂。这里的“癌细胞内核酸酶激活剂”是指能够使癌细胞内的核酸酶活化，诱导癌细胞程序死亡，从而杀灭癌细胞的药物。此外，“I”表示肌苷酸、“C”表示胞苷酸、“A”表示腺苷酸、“U”表示尿苷酸。错配聚(I)·聚(C)和错配聚(A)·聚(U)是本领域技术人员所周知的，表示在构成双链的核酸碱基中包含部分非互补碱基的聚(I)·聚(C)和聚(A)·聚(U)。
背景技术：
：聚(I)·聚(C)是聚肌苷酸和聚胞苷酸构成的多核糖核苷酸共聚物的双链RNA，众所周知，它是一种具有强力干扰素诱导活性和免疫强化作用的药物。由于该聚(I)·聚(C)具有免疫强化作用，所以，通过免疫反应可间接地抑制癌细胞的增殖，目前正对其作为癌症治疗剂的可能性进行研究。但是，还未开发出能够利用聚(I)·聚(C)的免疫反应的间接作用有效抑制癌细胞增殖的聚(I)·聚(C)癌症治疗剂，也未开发出以干扰素诱导活性和免疫强化作用为基础的其他适应症的聚(I)·聚(C)治疗剂。由聚腺苷酸和聚尿苷酸构成的多核糖核苷酸共聚物聚(A)·聚(U)、错配聚(I)·聚(C)和错配聚(A)·聚(U)具有与聚(I)·聚(C)同样的作用，虽然程度有所不同。另一方面，作为将药物移入细胞内的有效载体包括一般被称为阳离子脂质体的Lipofectin(注册商标)，以及具有以下结构式[1]的以2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰-1，3-O-二油酰甘油等甘油衍生物及磷脂为必需构成组分的载体(例如，PCTWO91/17424、PCTWO94/19314)。上述阳离子脂质体是由双分子脂质膜构成的在水溶液中带正电荷的小胞体。由于该阳离子脂质体在水溶液中带正电荷，聚(I)·聚(C)等双链RNA在水溶液中带负电荷，所以，阳离子脂质体和聚(I)·聚(C)等能够容易地形成复合体。但是，还完全不知道聚(I)·聚(C)等双链RNA本身，以及它们和阳离子脂质体的复合体是否能够使癌细胞内的核酸酶活化，诱导癌细胞程序死亡，从而杀灭癌细胞。发明的揭示本发明的目的是提供对治疗癌症有用的药物。本发明进一步提供了含有聚(I)·聚(C)等双链RNA的新颖的药物。本发明者们进行认真研究后发现，癌细胞内核酸酶激活剂对癌症的治疗有用，从而完成了本发明。因此，本发明涉及癌细胞内核酸酶激活剂。是否为癌细胞内核酸酶激活剂，通过后述的试验例2等的观察DNA和RNA片段化的实验等能够容易地确定。例如，可列举本发明的含有可有效地将药物移入细胞内的载体和聚(I)·聚(C)或错配聚(I)·聚(C)或聚(A)·聚(U)或错配聚(A)·聚(U)(以下将这些双链RNA总称为“聚(I)·聚(C)等”)的复合体的癌细胞内核酸酶激活剂，以及含有阳离子脂质体和聚(I)·聚(C)等的复合体的癌细胞内核酸酶激活剂。本发明的较好的例子是含有以2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰-1，3-O-二油酰甘油(以下称为“本甘油衍生物”)和磷脂为必需构成组分的载体(以下称为“本载体”)和聚(I)·聚(C)等的复合体(以下称为“本复合体”)的癌细胞内核酸酶激活剂(以下称为“本激活剂”)。以下，对作为本发明的具体例子的本激活剂进行详细说明。本载体一般是阳离子脂质体的一种，但如果具备将药物移入细胞内的功能，也并不一定要具有阳离子脂质体这样的形态。对本发明的聚(I)·聚(C)等的链长无特别限定，例如，为聚(I)·聚(C)时，较好的为50～2,000bp(bp碱基对)，更好为100～500bp，最好为200～400bp。如果不足50bp，则可能会产生有效性的问题，如果超过2,000bp，则可能会产生安全性的问题。本发明中的在100～500bp范围内的聚(I)·聚(C)的有效性和安全性均良好。聚(I)·聚(C)等一般具有各种链长构成的一定分布，所以，上述聚(I)·聚(C)的链长表示平均分布链长。本发明的磷脂只要是医药上允许的磷脂即可，对其无特别限定，具体例子包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、鞘磷脂和卵磷脂等。此外，还包括加氢的磷脂。较好的磷脂包括蛋黄磷脂酰胆碱、蛋黄卵磷脂、大豆磷脂、蛋黄磷脂(eggyolkphosphatide)。也可使用2种以上磷脂。此外，磷脂酰胆碱或卵磷脂与一般用于阳离子脂质体的磷脂酰乙醇胺相比，不会降低活性，且可有效地使毒性下降。本复合体中的本载体和聚(I)·聚(C)等的构成比例随磷脂种类、聚(I)·聚(C)等的种类、癌症种类等不同而有所不同，对应于10重量份本载体，聚(I)·聚(C)等为0.05～10重量份，较好为0.1～4重量份，更好为0.5～2重量份。本载体中的本甘油衍生物和磷脂的构成比例随聚(I)·聚(C)等的种类、用量及磷脂种类等的不同而有所不同，对应于1重量份的本甘油衍生物，磷脂为0.1～10重量份，较好为0.5～5重量份，更好为1～2重量份。本激活剂的形态包括例如本复合体在水溶液中分散而形成的溶液剂(注射剂、点滴剂等)及其冷冻干燥制剂。为溶液剂时，本复合体的浓度范围为0.001～25％(w/v)，较好为0.01～5％(w/v)，更好为0.1～1％(w/v)。本激活剂中还可含有任何适量的医药上允许的添加剂，例如，乳化助剂、稳定剂、等渗剂、pH调整剂。具体包括碳原子数为6～22的脂肪酸(例如，辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸)，医药上允许的盐(例如，钠盐、钾盐、钙盐)，白蛋白和葡聚糖等乳化助剂，胆固醇和磷脂酸等稳定剂，氯化钠、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖等等渗剂，盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、氢氧化钠、氢氧化钾、三乙醇胺等pH调整剂等。利用例如与脂质体的常规制法相同的方法可制得本激活剂。例如，首先在规定量的本甘油衍生物和磷脂中加入规定量的水(注射用水、注射用蒸馏水和生理盐水等)，搅拌混合后，用适当的分散机，例如，均质混合机、匀化器、超声波分散器、超声波匀化器、高压乳化分散机、Microfluidizer(商品名)、Nanomizer(商品名)、Ultimizer(商品名)、Manton-Gaulin型高压匀化器对上述混合物进行分散处理。然后，在其中加入规定量的聚(I)·聚(C)等，再次用适当的分散机进行分散处理就可制得作为注射剂的本激活剂。在分散前或分散后也可通过适当的工艺添加其他任何添加剂。也可在开始的时候就在本甘油衍生物、磷脂和聚(I)·聚(C)等这三者的混合物中加水，同时进行分散处理，这样也能够制得本激活剂。此外，经过粗分散也可制备。接着，对经过上述分散处理而获得的本激活剂进行冷冻干燥处理，制得本激活剂的冷冻干燥制剂。冷冻干燥处理可按照常规方法进行。例如，对经过上述分散处理而获得的本激活剂进行灭菌后，以规定量将其分注入管形瓶中，在约-40～-20℃的温度下进行约2小时的预备冷冻后，在约0～10℃的减压条件下进行一次干燥，然后，在约15～25℃的减压条件下进行二次冷冻干燥。接着，一般用氮气置换管形瓶内的空气，密封后就制得了冷冻干燥制剂。一般，在本激活剂的冷冻干燥制剂中添加任何适当的溶液(再溶解液)就可再次溶解而使用。这种再溶解液包括注射用水、生理盐水和其他常用输液。再溶解液的液量根据用途等有所不同，但对其无特别限定，一般为冷冻干燥前的液量的0.5～2倍，或在500mL以下。本激活剂可使癌细胞内的核酸酶活化，诱导癌细胞程序死亡，从而杀灭癌细胞，由于其毒性较低，所以，可用于包括人在内的哺乳动物的癌症的治疗，例如，可治疗肝癌。特别是含有本载体和聚(I)·聚(C)的复合体的本激活剂的有效性极高，但毒性极小，所以效果更佳。将本激活剂用于癌症的治疗时，可通过静脉内、癌症的局部病灶、经粘膜等给药，用于肝癌的治疗时，可通过静脉内、肝动脉内和门静脉内给药。本激活剂用于癌症治疗时的用量根据聚(I)·聚(C)等和磷脂的种类、癌症种类、癌症的病情发展情况、年龄、种族差异、给药方式、给药方法等有所不同，聚(I)·聚(C)等的给药量一般是1次50μg～50mg/人，较好为100μg～2mg/人。聚(I)·聚(C)的给药量一般也是1次50μg～50mg/人，较好为100μg～2mg/人。本激活剂可每天、隔天、每周、隔周等1天1～3次每次注射1针，也可滴注等。实施发明的最佳状态以下，揭示实施例和试验例对本发明进行更为详细的说明。各实施例和各试验例中，本激活剂的浓度都用本激活剂中的聚(I)·聚(C)的浓度表示。实施例1在2g本甘油衍生物和2g精制蛋黄卵磷脂中加入溶于100mL注射用水的麦芽糖40g，搅拌混合后，用匀化器进行5分钟的分散处理，获得本载体的粗分散液。再使用实验用小型乳化分散机对上述粗分散液进行1小时的分散处理，用注射用水定容为250mL后，回收本载体分散液。搅拌的同时在250mL本载体分散液中加入含有500mg聚(I)·聚(C)[平均链长约为200bp]的水溶液150mL，再次用实验用小型乳化分散机进行1小时的分散处理，获得本激活剂。最后，将本激活剂分别注入1mL的管形瓶中，按照常规方法制成冷冻干燥制剂。实施例2在50g本甘油衍生物和30g蛋黄磷脂中加入溶于10L注射用水的蔗糖4kg，用Manton-Gaulin型高压匀化器进行10分钟分散处理后，用注射用水定容为25L，回收本载体分散液。于搅拌的同时在20L本载体分散液中加入含有10g聚(I)·聚(C)[平均链长约为200bp]的水溶液12L，用盐酸将pH调整为5.5后，再次用Manton-Gaulin型高压匀化器进行30分钟的分散处理，获得本激活剂。然后，将本激活分别注入20mL的管形瓶中，按照常规方法制成冷冻干燥制剂。该冷冻干燥制剂可溶于市售的5％葡萄糖输液(500mL)。实施例3在2g本甘油衍生物和2g大豆卵磷脂中加入溶于100mL注射用水的葡萄糖20g，搅拌混合，用匀化器进行5分钟分散处理后，获得本载体的粗分散液。用实验用小型高压乳化分散机对上述粗分散液进行1小时的分散处理后，用注射用水定容为250mL，回收本载体分散液。搅拌的同时在250mL本载体分散液中加入含有50mg聚(I)·聚(C)[平均链长约为200bp]的水溶液150mL，再次用实验用小型高压乳化分散机进行1小时的分散处理，获得本激活剂。实施例4在1.2g本甘油衍生物和2.0g精制蛋黄卵磷脂中加入溶于100mL注射用水的麦芽糖40g，搅拌混合后，用实验用小型乳化分散机进行30分钟的分散处理，用注射用水定容为250mL后，回收本载体分散液。于搅拌的同时在250mL本载体分散液中加入含有200mg聚(I)·聚(C)[平均链长约为200bp]的水溶液150mL，再次用实验用小型乳化分散机进行2小时的分散处理，获得本激活剂。实施例5在1.2g本甘油衍生物和2.0g精制蛋黄卵磷脂中加入溶于100mL注射用水的麦芽糖40g，搅拌混合后，用实验用小型乳化分散机进行30分钟的分散处理，用注射用水定容为250mL后，回收本载体分散液。于搅拌的同时在250mL本载体分散液中加入含有100mg平均链长为360个碱基的聚(I)和100mg平均链长为318个碱基的聚(C)的水溶液150mL，再次用实验用小型乳化分散机进行2小时的分散处理，获得本激活剂。实施例6在2g本甘油衍生物和2g精制蛋黄卵磷脂中加入溶于100mL注射用水的麦芽糖40g，搅拌混合后，用匀化器进行5分钟的分散处理，获得本载体的粗分散液。然后，用实验用小型乳化分散机对粗分散液进行1小时分散处理，用注射用水定容为250mL后，回收本载体分散液。于搅拌的同时在250mL本载体分散液中加入含有250mg平均链长为1419个碱基的聚(I)和250mg平均链长为1491个碱基的聚(C)的水溶液150mL，再次用实验用小型乳化分散机进行1小时的分散处理，获得本激活剂。最后，将本激活剂分别注入1mL的管形瓶中，按照常规方法制成冷冻干燥制剂。实施例7在1.2g本甘油衍生物和2.0g精制蛋黄卵磷脂中加入溶于100mL注射用水的麦芽糖40g，搅拌混合后，用实验用小型乳化分散机进行30分钟的分散处理，用注射用水定容为250mL后，回收本载体分散液。于搅拌的同时在250mL本载体分散液中加入含有100mg平均链长为84个碱基的聚(I)和100mg平均链长为76个碱基的聚(C)的水溶液150mL，再次用实验用小型乳化分散机进行2小时的分散处理，获得本激活剂。实施例8与实施例4同样，制得含有平均链长约为350bp的聚(I)·聚(C)的本激活剂。实施例9与实施例4同样，制得含有平均链长约为1450bp的聚(I)·聚(C)的本激活剂。实施例10与实施例4同样，制得含有平均链长约为80bp的聚(I)·聚(C)的本激活剂。试验例1对各种细胞株的增殖的抑制效果(体外)按照104细胞/孔的密度将细胞移入96孔板的孔中，第2天在其中加入实施例4的本激活剂或阿霉素继续培养。3天后用MTT法测定存活细胞数，其结果如表1和表2所示。表1</tables>根据下式求得％抑制率(1-药物处理细胞的O.D.值/生理盐水处理细胞的O.D.值)×100％表2根据下式求得％抑制率(1-药物处理细胞的O.D.值/生理盐水处理细胞的O.D.值)×100％从表1和表2可看出，以0.01～500ng/ml的浓度就可对多数来自上皮和成纤维细胞的癌细胞株产生很强的增殖抑制作用。即使与因核酸合成抑制作用而显现抗癌效果的阿霉素相比也毫不逊色。对任何脏器的癌细胞都有效，未发现脏器特异性。另一方面，本激活剂的浓度即使为1000ng/ml也未对作为非癌细胞的4个来自肝脏的细胞株和7个成纤维细胞株产生增殖抑制作用。此外，体外癌细胞增殖抑制效果在单独添加聚(I)·聚(C)和单独存在本载体时完全未显现，而且，聚(I)·聚(C)单独被移入细胞内的现象是无法想象的。试验例2编程性细胞死亡现象的观察(1)DNA及RNA的片段化1)DNA的片段化分别向A431细胞和KM12-HX细胞添加聚(I)·聚(C)浓度为1μg/ml的实施例4的本激活剂，在5小时后回收A431细胞，7.5小时后回收KM12-HX细胞。用5mMTris-HCl(pH8.0)·10mMEDTA·0.5％(v/v)TritonX-100溶解细胞后，以13000×g进行20分钟离心分离，分离出片段化的DNA(上清液)和染色质部分(沉淀)。在上清液中加入100μg/ml的核糖核酸酶A，于37℃使其作用1小时后，使200μg/ml蛋白酶K和1％(w/v)SDS(十二烷基硫酸钠)在50℃反应1.5小时。然后，用苯酚/氯仿提取成为片段的DNA，并用1.8％琼脂糖凝胶进行电泳。其结果是，在所有细胞中都可观察到DNA的片段化。此外，对A431细胞在不同时间的变化进行研究。将A431细胞以2.8×105细胞/孔的密度移入6孔板的孔穴中，第2天在其中加入2μCi[3H]胸腺嘧啶核苷，对细胞的DNA进行标记。然后，添加实施例4的本激活剂(1μg/ml)，在不同的时间收集细胞。将细胞溶于5mMTris-HCl(pH8.0)·10mMEDTA·0.5％(v/v)TritonX-100后，以13000×g进行20分钟离心分离，分离出片段化的DNA(上清液)和染色质部分(沉淀)。由上清液和沉淀的放射性活度可算出片段化的DNA占全部DNA的比例。其结果如图1所示。添加后3小时全部DNA中有约30％片段化，5小时时有55％以上片段化，这种分解是因本激活剂进入细胞而很快导致的。2)RNA的片段化分别向A431细胞、MDA-MB-468细胞、KB细胞、HeLaS3细胞和MCF-7细胞添加聚(I)·聚(C)浓度为1μg/ml的实施例4的本激活剂，在4小时后回收细胞。从各细胞中分离出核糖体部分，用AGPC(酸-胍-苯酚-氯仿)法提取总RNA。利用甲醛变性凝胶(1.8％琼脂糖凝胶)进行RNA的电泳后，用溴化乙锭染色。其结果是，所有细胞中都可观察到28S和18S核糖体RNA的片段化。(2)核酸酶抑制剂的影响以104细胞/孔的密度将HeLaS3细胞移入96孔板的孔穴中，第2天同时在其中添加核酸酶抑制剂ATA(金精三羧酸)10μM和实施例4的本激活剂。继续培养3天后，用MTT法测定存活细胞数。其结果如图2所示。从图2可明显看出，添加ATA后细胞内的核酸酶作用被抑制，本激活剂的癌细胞增殖抑制作用未显现。而且添加ATA8小时后，将其从培养基中除去，然后再添加本激活剂，本激活剂的作用也未显现，这就说明ATA的作用并不是抑制本激活剂进入细胞内，而是起到了核酸酶抑制剂的作用。(3)从以上实验的结果可看出，本激活剂可使细胞内的核酸酶活化，这样就可造成癌细胞的编程性细胞死亡。试验例3对小鼠转移性肝癌模型的作用(体内)在每只裸鼠Balb/c.nu/nu(5周龄、雄性)的脾脏中注射106个KM12-HX细胞(人的大肠癌细胞，移植入裸鼠的脾脏后，能高效地转移至肝脏，导致肝脏癌变的细胞株)，10分钟后摘除脾脏。3天后开始几乎等间隔地每周2次静脉注射实施例4的本激活剂，共5周。末次给药的2天后摘出肝脏，测定形成于肝脏的癌结节数和面积。其结果如表3所示。表3表中的值表示每一只小鼠的癌结节数和面积(平均值±标准误)。()内的值表示％抑制率。*p＜0.01有显著性差异(Dunnett检验)30μg/kg给药群、100μg/kg给药群与对照群(10％麦芽糖)相比，分别显现出72％和91％的肝癌细胞的增殖抑制效果。此外，以100μg/kg的剂量每周给药1次也显现出77％的肝癌细胞增殖抑制效果。制作各肝脏组织标本，对其进行病理学分析后发现，形成于对照群肝脏的癌症是上皮性低分化型腺癌。肿瘤血管的发育程度一般，未发现免疫细胞浸润。此外，癌组织的各处都局部出现了钙化。本激活剂给药群未发现明显的癌细胞，只发现药物治愈癌症后残存的钙化现象。本激活剂以10μg/kg～100μg/kg的剂量每周2次连续静脉滴注就可对肝癌模型动物起到明显的治疗效果。试验例4毒性试验(1)大鼠单次给药后出现的肝毒性现象(急性毒性试验)对8只6周龄的SD雄性大鼠单次静脉注射实施例4的本激活剂，20小时后测定血清氨基酰基转移酶活性。其结果是，注射量不足5mg/kg时未出现死亡，为5mg/kg时可发现血清氨基酰基转移酶略有上升，为1mg/kg时未发现血清氨基酰基转移酶上升。(2)大鼠的2周亚急性毒性试验对6只SD雄性大鼠(6周龄)连续14天静脉注射实施例4的本激活剂，注射量在1mg/kg以下时未发现中毒现象。(3)抗原性试验用雄性豚鼠(Hartley，5周龄)进行实施例4的本激活剂的抗原性试验，用量为50μg/豚鼠时未显现抗原性。(4)简化的致突变性试验对实施例4的本激活剂进行简化回复突变试验和简化的染色体异常试验，用量为10μg/ml时，未显现致突变性。对附图的简单说明图1表示DNA片段化的比例。纵轴表示DNA片段化的比例(％)，横轴表示时间(小时)。图2表示添加ATA出现的核酸酶抑制剂的影响。纵轴表示抑制率(％)，横轴表示实施例4的本激活剂的浓度(ng/ml)。-O-表示未添加ATA的结果，-●-表示添加了ATA的结果。权利要求1.癌细胞内核酸酶激活剂，所述激活剂含有使药物移入细胞内的有效载体和聚(I)·聚(C)或错配聚(I)·聚(C)或聚(A)·聚(U)或错配聚(A)·聚(U)的复合体。2.如权利要求1所述的癌细胞内核酸酶激活剂，其中，使药物移入细胞内的有效载体为阳离子脂质体。3.癌细胞内核酸酶激活剂，所述激活剂含有以2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰-1，3-O-二油酰甘油和磷脂为必需构成组分的载体和聚(I)·聚(C)或错配聚(I)·聚(C)的复合体。4.如权利要求3所述的癌细胞内核酸酶激活剂，其中，磷脂为卵磷脂。5.如权利要求3或4所述的癌细胞内核酸酶激活剂，其中，聚(I)·聚(C)的平均链长在100～500bp的范围内。6.癌细胞内核酸酶激活剂。7.如权利要求3～5的任一项所述的癌细胞内核酸酶激活剂，其中，癌是肝癌。8.癌治疗剂，其特征在于，含有权利要求1～7的任一项所述的癌细胞内核酸酶激活剂。全文摘要本发明的目的是提供可有效治疗癌症的药物。本发明进一步提供了含有聚(Ⅰ)·聚(C)等双链RNA的新颖的药物。本发明的癌细胞内核酸酶激活剂含有以2－0－(2－二乙基氨基乙基)氨基甲酰－1,3－0－二油酰甘油和磷脂为必需构成组分的载体和聚(Ⅰ)·聚(C)或错配聚(Ⅰ)·聚(C)的复合体。文档编号A61K31/70GK1275913SQ9881016公开日2000年12月6日申请日期1998年10月15日优先权日1997年10月16日发明者平林加寿子,关纯造申请人:日本新药株式会社