专利名称：：一种基于位点特异性重组的多片段dna串联重组拼装方法
技术领域：
：本发明属于生物工程与合成生物学
技术领域：
，具体为一种基于φBTl整合酶及其突变识别位点的多片段DNA串联重组拼装方法。
背景技术：
：“合成生物学(SyntheticBiology)”一词的提出由来已久，最早见于1911年第33卷《科学》杂志论文，在1911年7月8日《柳叶刀》的一篇书评中也出现了该词[1，2]。经过一个世纪生命科学的飞速发展，自2000后，“合成生物学”一词又重新见诸各学术杂志和报刊，并随着J.CraigVenter研究所于2008年和2010年分别全合成了生殖道支原体(Mycoplasmagenitalium)[3]和蕈状支原体(Mycoplasmamycoides)基因组[3]，并成功实现了在异源去核支原体细胞中的激活[3，4]，“合成生物学”逐渐进入公共视野，并引发了有关生命起源以及伦理的种种激烈争论。通过ISI-WebofScience检索，仅自2005以来[5]，已有七十六篇以合成生物学为主要论述对象的综述文章刊登。基因组学和系统生物学相关理论技术的突破与创新，极大地促进了传统基因工程在规模和层次的升级，由此催生了合成生物学的快速发展。合成生物学的核心理念是人工设计与合成。通过已有的生物学信息，结合计算机程序模拟与预测，设计出期望的生物原件调控网络，并最终在生物学水平上完成所希望的目标。从简单的DNA序列化学合成出发(chemicalsynthesis)，到完整基因的合成(partstogenes)，到相互关联基因的组合与拼装(genestopattiways)，再到完整基因组的合成(pathwaystogenomes)并使其发挥生物学功能W]，整个过程都渗透着设计的理念。就像电子工程师设计完成一个复杂电路一样，合成生物学家也期望将不同的生物元件进行组合与拼装，重建或者实现新的生物学功能。合成生物学的理念和技术方法将在廉价生物医药、清洁能源与化工、环境治理与保护、生物材料设计以及生物反恐等领域发挥重要的作用。合成生物学的发展依赖于基础理论研究作为强大的后盾支撑，了解各生物元件的基本功能及其相互之间的作用是前提；另外，技术手段的创新也必不可少，比如如何将复杂系统高效率的组装到一起，并且能够方便对沉默的元件进行替换和组合？RobertaKwok在Nature的专栏文章中指出了当前合成生物学发展在基础理论层面的五大障碍[7](1)很多生物元件功能未知(Manyofthepartsareundefined)；(2)已知部件组合之后的结果难料(Thecircuitryisunpredictable)；(3)生物网络的复杂性某种程度上是合成生命难以承受之重(Thecomplexityisunwieldy)；(4)很多部件相互不兼容(Manypartsareincompatible)；(5)变异可能使一切努力付诸东流(Variabilitycrashesthesystem)。所有这些限制因素都需要大量的工作来排除种种失败的可能性，除去不必要的“垃圾”元件；筛选出可真正发挥作用的模块或者网络。这就需要非常高效的筛选方法来满足在生物学层面上的大量尝试，以及发展非常高效的基因拼接与替换等技术。传统的DNA重组技术主要依赖于PCR扩增、限制性酶切和DNA连接，这也是目前基因工程操作的主要手段。随后也有一些不依赖连接反应的克隆(LigationIndependentCloning,LIC)方法发展出来[8，9]；LIC主要依赖于PCR的退火和延伸，有的则需要在PCR末端加入接头，并设计相应的配接载体，对使用的DNA聚合酶也有一定的要求。In-Fusion(Clontech)技术和(Gateway(LifeTechnologies)技术则分别基于短序列的同源重组[10]和噬菌体λ的位点特异性重组[11]。以上这些方法都比较适合于单个DNA片段的克隆，为满足合成生物学对多模块同时组装的需要，则需要发展多片段克隆技术。目前已有一些方法适合同一反应中进行多片段的克隆，比如多重(Gateway系统(MultipleGatewaySystem)[12],PairwiseSelectionAssembly(PSA)[13]，多重In-Fusion技术[14]以及JCVI发展的恒温组装方法(‘Gibson，isothermalassemblymethod)[3]等。这些方法目前都可以用于多个DNA片段的组装，然而都各有优缺点。为了更加便捷高效地在“基因到通路”以及“通路到基因组”水平上完成多模块组装，相应的技术方法和策略仍然亟待发展W]。我们建立了基于链霉菌噬菌ψBTl的体外位点特异性重组系统[15]；并且鉴定了16对“不兼容(non-compatible)”重组位点对[16]，φBTl重组系统非常高效且精确，在不兼容位点对之间没有重组的发生[16]。考虑该系统的多项优势和特点，本发明利用该系统发展了一种体外多片段串联重组拼装的方法(Site-SpecificRecombinationbasedTandemAssemblymethod,SSRTA)。具体选用抗肿瘤抗生素埃博霉素(印othilones)之生物合成基因簇作为对象。1993年，默克公司(MerckSharpandDohme,MSD)开始一项从67000个合成化合物和70000个天然产物中筛选具有类似紫杉醇(Taxol)活性(通过稳定微管蛋白来抑制细胞分裂)之抗癌药物的计划[3]，由此发现了印othiloneA&B的抗肿瘤活性，并于1995年发表了这一激动人心的结果[17]。埃博霉素生物合成基因簇由6个ORF构成，包含10个模块(module)，其中8个为聚酮合酶(polyketidesynthase,PKS)模块，1个为非核糖体多Ι^ΒΙ(non-ribosomalpeptidesynthetase,NRPS)iS^W1^^icllife(loadingmodule)。抗生素生物合成基因簇的模块化特点，为其进行组合生物合成以及作为发展多片段重组技术的模型，提供了天然的优势。本发明即利用埃博霉素生物合成基因簇作为对象，发展基于t|>BTl重组系统的多片段串联重组拼装方法。
发明内容本发明的目的在于提出一种简单，高效，快速的体外多片段DNA串联重组拼装(SSRTA)方法。本发明提出的SSRTA方法，是一种基于大型丝氨酸重组酶φBTl整合酶的多片段DNA串联重组拼装方法。本发明通过严格突变筛选和验证，提供十六对突变的整合酶识别序列，突变的底物对参与反应效率与野生型相当，且在同一体系中表现为不兼容，即可同时使用。在此基础上，以当前最具潜力的抗肿瘤药物埃博霉素生物合成基因簇的拼装为例，构建一整套相关载体，包括一个可实现大肠杆菌-天蓝色链霉菌穿梭的骨架载体，以及七个含有突变底物对用于DNA元件构建和筛选的TA克隆载体，并提供多个(本发明中分别示例了五个和七个)DNA片段体外串联重组反应的具体方法。本发明首先提供一个重组克隆骨架质粒，该重组克隆骨架质粒基于突变整合位点序列构建，其序列如SEQNo.59所示，记为pZLElO。本发明还提供所述重组克隆骨架质粒的相应元件，该相应元件包括WiA和ai坊μ位点、大肠杆菌复制起始区域、ori-P15A)、噬菌体φC31的整合酶基因和aii/M立点、十一烷基灵菌红素(Red)生物合成基因簇中的启动子Z^eoP、核糖体结合位点序列(RBS)、抗性基因、转录终止子以及接合转移起始位点。本发明还提供基于突变整合位点序列所构建的重组克隆入门质粒，该质粒的序列为SEQNo.3、SEQNo.6、SEQNo.9、SEQNo.12、SEQNo.15、SEQNo.18或SEQNo.20所示，依次记为pTA0006、pTA0613、pTA1307、pTA0712、pTA1203、pTA0315和pTA1303。本发明还提供所述质粒的相应元件，该相应元件包括质粒复制起始位点、抗药性基因以及位点特异性重组识别位点，依次为ai私attP6、attB6MattP13、attB13和ai炉7、attBr禾口attP12.attB12禾口attP”attB3禾口attP15、URattB13禾口attP30本发明还提供所述质粒的构建方法，具体步骤如下以引物PTl、包含attB0,SEQNo.1)和PTF(包含aiiA，SEQNo.2)扩增阿泊拉霉素(Aparamycin)抗性基因Caac，将获得的PCR片段通过TA克隆插入到pMD19_T(Takara)载体中，即得到pTA0006(SEQNo.3)。通过相同的方法，获得其他“入门载体”以引物ΡΤΒ6^iSattB6,SEQNo.4)和PTP13(包含aii/^，SEQNo.5)获得ρΤΑΟΘΙ3(SEQNo.6)；以引物PTB13(W^attB13,SEQNo.7)和PTP7(M^attP7,SEQNo.8)获得PTAl3O7(SEQNo.9)；以引物PTB7(包含attB7,SEQNo.10)和PTP12(包含aii/、，SEQNo.11)获得pTA0712(SEQNo.12)；以引物PTB12(M^attB12,SEQNo.13)和PTP3(M^attP3,SEQNo.14)获得pTA1203(SEQNo.15)；以引物PTB3(包含SEQNo.16)和PTP15(包含aii/^，SEQNo.17)获得pTA0315(SEQNo.18)；以引物PTB13、包含attB13,SEQNo.19)禾口PTP3(M含attP3,SEQNo.14)获得pTA1303(SEQNo.20)。本发明还提供将目的片段克隆到入门载体的方法，具体步骤为用限制性内切酶Xcml消化入门载体，以TA克隆的方式插入目的片段。本发明提出的体外多片段DNA串联重组拼装(SSRTA)方法。是基于前述质粒的，具体步骤如下将各亚克隆线性化，小于10kb的线性片段以琼脂糖凝胶分离后以试剂盒回收；大于101Λ的线性片段先以酚氯仿抽提后，再由乙醇沉淀回收。将线性片段和ΨBTl整合酶于30°C温育过夜(至少8小时)，缓冲体系为10mMTris-HCl,100mMKCl,50mMNaCl,2mMEDTA和1mMDTT，串联重组产物先以蛋白酶K灭活，再以酚氯仿抽提后乙醇沉淀回收，然后以脉冲场凝胶电泳分析。本发明还提供一种基于突变整合位点对，在PCR引物5’端添加突变的整合位点，然后以PCR产物直接进行体外多片段串联重组的方法，该方法涉及的反应缓冲体系如前所述。本发明提供的SSRTA方法简单、快速并且高效，可用于多个DNA片段的快速串联重组拼装，并通过转化大肠杆菌，实现串联产物的扩增。当前合成生物学飞速发展，迫切需要高效快捷的多片段DNA拼装方法；本发明提供的SSRTA方法的改造和延伸，能够高效快速的重构生物途径与网络；对该方法的进一步改造和优化，将使其在合成生物学中发挥重要的作用下面对本
发明内容进一步具体描述本发明以通过两步串联重组拼装，分别实现五个和七个DNA片段的重组，获得完整的埃博霉素生物合成基因簇为例。1、“入门载体”的设计和构建。本发明将该新发展的方法称为体外多片段串联重组拼装(Site-SpecificRecombinationbasedTandemAssemblymethod,SSRTA)；本方法的核心为+BTl整合酶催化的高效体外位点特异性重组系统和16对不兼容(non-compatible)的底物位点。因为不同的位点对之间不能发生重组，所以可以在同一体系中使用不同的位点对，即可实现多个DNA片段的精确串联组装。如图1所示，不同颜色标记的底物之间不能发生重组，重组只在特定的(相同颜色)一对底物间进行，这种底物对底物严格控制的特性赋予了该系统高度的精确性。抗生素生物合成基因簇中I型聚酮合酶(typeIPKS)以模块形式存在，每一模块含独特的、非重复使用的功能域[18]。这一特点为组成生物合成提供了可能。埃博霉素含有噻唑环配基为侧链的16元大环内酯类抗生素，其生物合成基因簇由6个ORF构成，包含10个模块(module)，其中8个为聚酮合酶(polyketidesynthase,PKS)模块，1个为非核糖(non-ribosomalpeptidesynthetase,NRPS)1^^!(loadingmodule)。另外还含有一个P450环氧化酶(印oxidase)基因(印0幻，负责12位和13位C的环氧化，形成三元杂环[3]；本发明中未克隆环氧化酶基因。为从六个独立克隆出发，通过一步串联重组获得完整的埃博霉素生物合成基因簇，需要使用7对不兼容重组位点对。本发明选用了以下七对位点，编号为0、3、6、7、12、13和15，各编号对应的重组位点序列请见相应文献[16]。利用这七对位点，成功构建了七个“入门载体”，即pTA0006、pTA0613、pTA1307、pTA0712、pTA1203、pTA0315和pTA1303(见具体实施方式)。对每个载体而言，重组位点中间为Apramycin抗性基因腿(3)IV，紧挨着重组位点内侧为一对识别位点；以酶切载体后，即可通过TAcloning把目的片段插入到载体而获得“入门克隆”(如图2A)。除用于分步骤克隆埃博霉素生物合成基因的载体外，本发明还构建了可用于大肠杆菌中复制和链霉菌中进行表达的多功能骨架载体(如图2B)。该载体的WiA和Wii^位点用于把完整的基因簇装配进来；然后在大肠杆菌复制扩增ipri-pl5A)并进行验证；再通过噬菌体C31的integrase和aii/M立点整合进入链霉菌基因组；最后通过i^一烷基灵菌红素(Red)生物合成基因簇中的启动子/^eoP起始转录。核糖体结合位点序列(RBS)为PtipA启动子中的相应序列。2、“入门克隆”的构建。以纤维堆囊菌腫cellulosumstrainSo0157_2[19]基因组DNA为模板，本发明通过高保真PCR扩增和分步酶切连接，获得了包含有埃博霉素生物合成相关全部基因的九个“入门克隆”(克隆详细步骤请见具体实施方式)，对每个克隆进行测序验证，并与其他两组不同菌株来源的埃博霉素生物合成基因簇序列进行比较分析i^SormgiumcellulosumstrainSMP44[20]和strainSoce90[21])。需要说明的是，多片段串联重组拼装也可以直接使用PCR产物进行，只需要在PCR引物的5’端加入相应的重组位点。然而考虑到埃博霉素生物合成基因簇的高GC%含量(69.5%)和测序验证的方便，我们采用了先行将PCR产物克隆进“入门载体”来获得“入门克隆”的方式，代替直接使用PCR产物作为串联底物。九个“入门克隆”依次为权利要求1.一个重组克隆骨架质粒，其特征在于为基于突变整合位点序列构建，其序列为SEQNo.59所示，记为pZLElO。2.如权利要求1所述重组克隆骨架质粒的构建方法，其特征在于具体步骤为将PCR片段插入到PMD-19Tvector中得到过渡质粒，用损al和勒“/II酶切，得到一个1962_bp的DNA片段；再用船日1和^711酶切质粒T-Bxbattl-Bxbatt2，得到一个4441-bp的DNA片段；将该两片段连接得到PZLE12；以损al酶切pZLE12得到大小为3713_bp的片段；以MeI和Xbal酶切pSET152得到大小为3402_bp的片段；两片段连接后即得到质粒pZLElO；其中，所述PCR片段为1956-bp,序列为SEQNo.57和SEQNo.58。3.如权利要求1所述重组克隆骨架质粒的相应元件，其特征在于包括attP0和attB15位点、大肠杆菌复制起始区域ijjri-P15A)、噬菌体φθ31的整合酶基因和aii/M立点、十一烷基灵菌红素(Red)生物合成基因簇中的启动子/^eoP、核糖体结合位点序列(RBQ、抗性基因、转录终止子以及接合转移起始位点。4.基于突变整合位点序列所构建的重组克隆入门质粒，其特征在于其序列为SEQNo.3、SEQNo.6、SEQNo.9、SEQNo.12、SEQNo.15、SEQNo.18或SEQNo.20所示，依次记为pTA0006、pTA0613、pTA1307、pTA0712、pTA1203、pTA0315和pTA1303。5.如权利要求3所述质粒的相应元件，其特征在于包括质粒复制起始位点、抗药性基因以及位点特异性重组识别位点，依次为attB0和attP6、BttB6和attP13、BttB13和attP7、attB7禾口attP12.attB12禾口attP”attB3禾口attP15、URattB13禾口attP306.如权利要求3所述质粒的构建方法，其特征在于具体步骤如下以引物PTl和PTF扩增阿泊拉霉素抗性基因咖(3)IV,将获得的PCR片段通过TA克隆插入到PMD19-T载体中，即得到PTA0006，序列为SEQNo.3；其中，引物PTl包含ai购，序列为SEQNo.1，引物PTF包含attP6,序列为SEQNo.2；通过相同的方法，获得其他“入门载体”以引物PTB6和PTP13获得pTA0613，序列为SEQNo.6；其中，引物PTB6包含ai风，序列为SEQNo.4，引物PTP13包含attP13,序列为SEQNo.5；以引物PTB13和PTP7获得PTA1307，序列为SEQNo.9；其中，引物PTB13^attB13,序列为SEQNo.7)，引物PTP7包含aii/^序列为SEQNo.8；以引物PTB7和PTP12获得PTA0712，序列为SEQNo.12；其中，引物PTB7包含ai叫，序列为SEQNo.10，引物PTP12包含aii/^，序列为SEQNo.11；以引物PTB12和PTP3获得pTA1203，序列为SEQNo.15；其中，引物PTB12^attB12,序列为SEQNo.13，引物PTP3包含attP3,序列为SEQNo.14；以引物PTB3和PTP15获得pTA0315，序列为SEQNo.18；其中，引物PTB3包含attB3,序列为SEQNo.16，引物PTP15^attP15,序列为SEQNo.17；以引物PTB13和PTP3获得pTA1303，序列为SEQNo.20；其中，引物PTB13^attB13,序列为SEQNo.19，引物PTP3包含attP3,序列为SEQNo.14。7.一种将目的片段克隆到入门载体的方法，其特征在于具体步骤为用限制性内切酶Xcml消化入门载体，以TA克隆的方式插入目的片段。8.—种体外多DNA片段一步串联重组拼装的方法，其特征在于基于如权利要求1所述三重组克隆骨架质粒和权利要求3所述的入门质粒，具体步骤如下将各亚克隆线性化，小于10kb的线性片段以琼脂糖凝胶分离后以试剂盒回收；大于101Λ的线性片段先以酚氯仿抽提后再乙醇沉淀回收；将线性片段和(||BT1整合酶于30°C温育过夜，缓冲体系为10mMTris-HCl,100mMKCl,50mMNaCl,2mMEDTA禾Π1mMDTT，串联重组产物先以蛋白酶K灭活，再以酚氯仿抽提后乙醇沉淀回收，然后以脉冲场凝胶电泳分析。全文摘要本发明属于生物工程与合成生物学
技术领域：
，具体为一种基于BT1整合酶及其突变识别位点的多片段DNA串联重组拼装方法。本发明通过突变筛选和验证，提供十六对突变的整合酶识别序列，在此基础上，构建一整套相关载体，包括一个可实现大肠杆菌-天蓝色链霉菌穿梭的骨架载体，以及七个含有突变底物对用于DNA元件构建和筛选的TA克隆载体，并提供多个DNA片段体外串联重组反应的具体方法。本发明方法简单、快速并且高效，可用于多个DNA片段的快速串联重组拼装，通过转化大肠杆菌，实现串联产物的扩增。本方法可广泛用于合成生物学中标准模块和元件的组合与拼装。文档编号C12N15/10GK102286512SQ201110181328公开日2011年12月21日申请日期2011年6月30日优先权日2011年6月30日发明者丁晓明,张霖,赵国屏申请人:复旦大学