一种特异性重组腺病毒及制备与应用的制作方法

专利名称：一种特异性重组腺病毒及制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用现代生物技术进行重组病毒的制备，由此得到的重组病毒， 以及这种重组病毒的应用。更确切讲，本发明涉及一种具有膀胱癌特异性的重组腺病毒。
背景技术：
世界范围内，膀胱癌的发病率居恶性肿瘤第九位，在男性排名第六位，女性排在第 十位之后。在美国，膀胱癌发病率居男性恶性肿瘤第四位，位列前列腺癌、肺癌和结肠癌之 后，在女性恶性肿瘤居第九位。2002年世界膀胱癌年龄标准化发病率男性为10. 1/10万， 女性为2. 5/10万，年龄标准化死亡率男性为4/10万，女性为1. 1/10万。美国男性膀胱癌 发病率为24. 1/10万，女性为6. 4/10万。在我国，男性膀胱癌发病率位居全身肿瘤的第八 位，女性排在第十二位以后。2002年我国膀胱癌年龄标准化发病率男性为3. 8/10万，女性 为1.4/10万。近年来，我国部分城市肿瘤发病率报告显示膀胱癌发病率有增高趋势，男性 发病率为女性的3 4倍。而对分级相同的膀胱癌，女性的预后比男性差。膀胱癌可发生于任何年龄，甚至于儿童，但主要为中年以后，其发病率随年龄增长 而增加。由于膀胱癌多发难治，且术后复发率高，严重威胁着人类的健康和生命，消耗宝贵 的医疗资源。目前膀胱癌的治疗以手术切除为主，并辅以放疗和化疗，治疗效果并不理想， 而且可严重损伤正常细胞。鉴于这些现状，急切需要研究开发更为有效和安全的治疗方法。 随着对恶性肿瘤发生、发展分子机制研究的不断深入，恶性肿瘤的基因治疗已成为当前临 床肿瘤研究的新热点。由于膀胱与外界直接相通这一解剖上的优势，可通过经尿道向膀胱 内灌注载体，实现对膀胱肿瘤的基因治疗，因此膀胱肿瘤的基因治疗具有很好的研究发展 前景。膀胱癌的基因治疗可通过多种途径实现，如免疫调节机制、细胞毒性机制、用基因 替代等方法恢复和增强抑癌基因功能、阻断癌基因机制、基因抑制策略、改善肿瘤放疗疗效 的机制及其他机制。尽管有如此多的途径为膀胱肿瘤的基因治疗提供了很大的发展空间， 但如何使目的基因能够高效、特异的转入靶细胞仍是诸多基因治疗尚未突破的瓶颈。只有 提高基因转导的靶向性，才能实现治疗的针对性和安全性。进一步研究对恶性肿瘤基因治 疗的突破则有赖于对导入人体的外源性基因的调控，需进一步精确控制外源性基因进入人 体后的具体整合位点，避免基因的乱整合。近年的研究结果表明，腺病毒是理想的基因治疗 载体，通过选择复制性溶瘤腺病毒载体治疗肿瘤是极其有前途的策略。腺病毒(adenovirus，Ad)是一种无外壳的双链DNA病毒，基因组长约36kb，一般 以病毒DNA开始复制为分界线，按转录时间的先后，将腺病毒基因大致区分为早期(El 4) 和晚期转录单位(Li 5)。各种腺病毒基因又可进一步分为更小的转录单位，如El区可以 进一步分为ElA和E1B，每个转录单位都至少有一个独特的启动子。腺病毒基因组进入细 胞核后，细胞转录因子首先与ElA区上游的增强子结合，表达ElA蛋白，该蛋白的作用是调 节细胞代谢，使病毒DNA更易于在细胞中复制。ElA蛋白还可激活其他早期基因(E1B、E2A、 E2B、E3和E4)的启动子。对ElA的深入研究还发现，ElA是一种抑癌基因。腺病毒复制首先需要早期基因ElA的表达，ElA的表达是腺病毒复制的前提，所以可以通过控制ElA的表 达控制腺病毒的复制。腺病毒由于宿主范围广，对人致病性低，在增殖和非增殖细胞中感染 和表达基因，能有效进行增殖，滴度高，与人类基因同源，不整合到染色体中，无插入致突变 性，能在悬浮培养液中扩增，能同时表达多个基因等诸多优点，近年来受到广泛关注，被认 为是很有潜力的基因治疗载体。腺病毒具有嗜上皮细胞的特性，而人类膀胱癌以移行上皮 细胞癌多见，这就更增加了膀胱癌溶瘤腺病毒基因治疗的可行性。野生型腺病毒的复制呈溶细胞特点，细胞裂解释放的病毒颗粒又可以再度感染其 他细胞而引起广泛的细胞死亡。所以，如何驾驭和利用腺病毒的溶细胞作用来杀伤肿瘤细 胞成了人们努力的方向。

发明内容
本发明旨在提供一种新型的、高特异性的、安全的并能在膀胱癌细胞中高效复制 的重组溶瘤腺病毒。通过增强复制型腺病毒在膀胱癌细胞中复制的特异性，减少对正常细 胞的毒性作用，从而增强膀胱癌基因治疗的靶向性和安全性。本发明的特异性重组腺病毒的制备方法是将前列腺干细胞抗原增强子PSCAE和 人尿路特异性蛋白UPII启动子插入到雄激素受体AR与腺病毒基因ElA的融合基因上游， 构成具有膀胱癌特异性的重组腺病毒。本发明的制备方法中，是分别用具有膀胱癌特异性的启动子和增强子取代控制该 重组病毒复制所必需的早期基因ElA表达的启动子和增强子，并且引入了一种雄激素受体 基因使其同ElA基因融合表达，处于上游同一个膀胱特异性启动子的控制之下。本发明的特异性重组腺病毒的制备方法中，将起始穿梭载体P-ShUttle CMV内 在的BamHI位点切除，再在该切除位点处重新引入含有Age I，Nhe I，BamHI和No11位点 的多克隆位点，将EIA与AR用BamHI和EcoRV双酶切，保留酶切后得到的EIA-AR融合 片段，将膀胱组织特异性UPII启动子插入到穿梭载体质粒的NheI和BamHI位点，将前 列腺干细胞抗原增强子PSCAE插入到穿梭载体相应的AgeI和NheI位点，构建得到质粒 Rp-PSCAE-UPII-EIA ；将5，末端磷酸化后的AR编码序列与Rp_PSCAE_UPII-EIA质粒载 体连接，得到载体 Rp-E-UPII-ElA-AR ；再将 Rp-PSCAE-UPIl-ElA-AR 与 pAdEasy 质粒在大 肠杆菌中进行同源重组，重组产物在人胚肾293细胞中进行包装得到特异性重组腺病毒 Ad-PSCAE-UPII-EIA-AR。由以上方法制备的特异性重组腺病毒，已于2010年1月15日在中国典型培 养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC-V201001。具体保藏信息如下(保藏人兰 州大学第二医院；培养物名称重组人溶瘤腺病毒Ad-PSCAE-UPII-ElA-AR;保藏编号 CCTCC-V201001 ；保藏时间2010-01-I5)本发明所述的特异性重组腺病毒可在制备治疗膀胱肿瘤药物中应用。本发明中的重组质粒载体Rp-PSCAE-UPll-ElA-AR可用于构建特异性重组腺病 毒，其制备方法如前述。前列腺干细胞抗原增强子(prostate stem cell antigen enhancer，PSCAE，大小 327bp)不仅在前列腺细胞有表达，在膀胱肿瘤中也高表达。同时它含有两个雄激素结合位 点一 雄激素反应元件(ARE)，是具有雄激素依赖性的顺式作用元件。这一增强子不但具有组织特异性，而且可以通过雄激素结合位点对其实现调控。也就是说，如果构建的溶瘤病毒处 于雄激素和雄激素受体的细胞环境，PSCAE的增强活性就高，如果处于低雄激素环境，其活 性就低。本发明所构建的腺病毒可以通过调控雄激素水平调控病毒复制能力，为控制病毒 特异性表达增加了手段。用PSCAE作为增强子，增强UP II启动子的效应，结合了 UP II的 膀胱特异性及PSCA的膀胱癌特异性，进一步扩大特异性靶向效应。基于上述研究基础和分 析，本发明用膀胱组织特异性UPII启动子控制Ad5(5型腺病毒)ElA基因的表达，并在启动 子上游插入前列腺干细胞抗原增强子PSCAE用于增强启动子功能，构建成选择性复制腺病 毒Rp-PSCAE-UPII-ElA。研究发现，以这种腺病毒攻击肿瘤细胞能够最终导致肿瘤细胞的裂 解。本发明采用PSCAE作为增强子来增强UP II启动子的效应，这一策略结合了 UP II的 膀胱特异性及PSCAE的膀胱癌特异性，从而进一步扩大了特异性靶向效应。
雄激素受体(Androgen rec印tor，AR)是一种配体依赖性的反式转录调节蛋白，属 于核受体超家族成员，主要存在于靶细胞的核内。未与配体结合的AR与热休克蛋白(HSP) 结合，而AR与配体结合后，则发生构象变化，与HSP解离，使AR与DNA亲和力增高(受体的 活化)，活化的AR以二聚体形式与靶细胞核中特定的DNA序列一雄激素反应元件(ARE)结 合，并与其它转录因子相互作用，从而调节靶基因的表达，产生生物效应。研究表明，雄激素 受体阳性细胞中AR的表达可抑制溶瘤病毒早期基因ElA的表达，从而抑制腺病毒的复制， 但将AR和ElA基因融合表达于同一启动子下游不但不存在抑制，反而会促进腺病毒的复 制。膀胱癌AR表达阳性，所以本发明期望分别克隆出雄激素受体基因(AR)、5型腺病毒ElA 基因、前列腺干细胞抗原增强子(PSCAE)和具有膀胱特异性的人尿路特异性蛋白II(UPII) 启动子，将它们有序定向连接到腺病毒穿梭载体，前列腺干细胞抗原在膀胱癌细胞中有表 达但在正常膀胱上皮无表达，UPII启动子具有膀胱特异性，通过PSCAE和UPII启动子共同 控制ElA和AR基因在膀胱肿瘤细胞中特异性表达来控制腺病毒在膀胱癌细胞中复制，从而 构建高表达的膀胱特异性溶瘤腺病毒。本发明所构建的膀胱癌细胞特异性重组腺病毒，其特征是这种重组腺病毒仅能在 膀胱癌细胞内大量复制，引起膀胱癌细胞的溶解破坏，而对正常组织或细胞副作用较小甚 至无副作用。其携带有两个外源顺式作用元件，其中一个为UPII启动子，用其取代腺病毒 早期基因ElA的调控序列，使ElA基因仅在膀胱癌细胞中表达。由于UPII启动子启动活性 相对较低，因此，本发明在UPII启动子上游区域插入另一个顺式作用元件PSCAE用于增强 启动子功能，从而进一步增加了腺病毒的膀胱癌细胞特异性。在此基础上同时引入雄激素 受体(AR)，使其处于上游的膀胱特异性启动子UPII的控制之下，并用膀胱癌特异性增强子 PSCAE增强其在膀胱癌细胞中的表达，从而构建高表达的膀胱癌特异性重组溶瘤腺病毒，其 原理参见附图1所示。本发明与现有的相关研究相比，具有以下优点1.本发明所构建的重组腺病毒，携带有膀胱癌细胞特异性的启动子和增强子，同 时将腺病毒复制所必需的ElA基因和AR融合表达于这一启动子之下，对膀胱癌细胞具有双 重特异性，使其能在膀胱癌细胞内大量复制，从而裂解膀胱癌细胞，具有很高的膀胱癌溶瘤 特异性。2.本发明所构建的重组腺病毒，由于其膀胱癌细胞的高度特异性，仅能在膀胱癌 细胞中大量复制，而在正常组织和细胞中几乎不复制，比较以往的各种基因治疗方法有很大的安全性。3.本发明在腺病毒复制所必需的早期基因ElA调控序列引入一个特异性启动子 UPII，指导ElA基因的表达，并且插入一个特异性增强子PSCAE，使ElA基因在膀胱癌细胞中 高效表达。4.本发明将AR和ElA基因融合表达于同一启动子下游会促进腺病毒的复制，而膀 胱癌AR表达阳性，这又进一步增加了腺病毒治疗膀胱癌的靶向特异性和治疗的有效性。5. ElA蛋白的特异性表达还能够提高肿瘤细胞对化疗药物及射线的敏感性，成为 协同治疗的一部分。


图1 :PSCAE和雄激素受体促进ElA表达示意图。本图说明了在PSCA增强子和UPII 启动子的作用下通过雄激素受体AR的引入来促进ElA在膀胱肿瘤组织表达的原理。图2 :Rp-PSCAE-UPII-ElA-AR质粒图。本发明所构建的膀胱癌特异性溶瘤腺病毒 是在Rp-E-UPII-ElA的基础上引入AR与ElA融合表达，进一步增强溶膀胱癌细胞特异性和 有效性。图 3 :Rp-PSCAE-UPII-ElA-AR 酶切电泳图。该图证实了 Rp-E-UPII-ElA-AR 载体 构建正确。图中标识含义如下。E =PSCAE ；L :lkb plus maker。EI =EcoRI ；Hc =HincII ； Hd :HindIII。EcoRI 14876bp ；HincII 11895bp,2334bp,647bp ；HindIII 8150bp,4271bp, 1379bp,1076bp。图4:RP_UP II-Luc和RP-PSCAE-UP II-LUC与内参照质粒共转染细胞后的萤光素 酶活性检测结果。其中人类肝细胞癌株HepG2 ；人类胃癌株BGC823 ；人类前列腺癌株 PC3 ；人类膀胱移行细胞癌株T24，BIU87，5637。该图结果显示，在膀胱癌细胞中萤光素酶 活性远远高于非膀胱癌细胞，并且在膀胱癌细胞中转染Rp-PSCAE-UPII-Luc的细胞较转染 Rp-UPII-Luc的细胞中荧光素酶活性高，从而说明了 PSCAE和UPII启动子具有膀胱特异性 并且PSCAE在膀胱癌细胞中具有增强作用。图5:Ad-E_UP II_E1A_AR对T24细胞的溶瘤效应的显微照片，本图X400。该图 显示，转染重组溶瘤腺病毒Ad-PSCAE-UP II-ElA-AR 72小时后膀胱肿瘤T24细胞绝大部分 被裂解，从而说明了该重组病毒对膀胱肿瘤具有溶瘤作用。
具体实施例方式以下提供本发明的实施例。(一)基因克隆本发明构建的载体结构中涉及到以下几部分，包括前列腺干细胞抗原增强子 PSCAE、膀胱组织特异性UPII启动子、ElA基因、雄激素受体基因AR。上述各基因序列可通过查询GenBank相关核苷酸序列或从哺乳动物组织或细胞 中获取。例如，293细胞(人胚肾细胞系)是公认的腺病毒载体包装细胞，其本身含有ElA 基因序列，故可从293细胞基因组获得ElA基因序列；研究表明雄激素受体AR在某些膀胱 肿瘤细胞(如人膀胱癌细胞株5637、前列腺癌细胞株LNcap)表达阳性，故AR基因序列亦可 通过AR阳性的膀胱肿瘤细胞株获得。在本实施例中，PSCAE、UPII、E1A及AR序列均通过聚合酶链式反应即PCR技术获得。PCR引物的合成信息如下_上游序列(5，-3，)下游序列(5，-3，)_ PSCAE gctgaccggtagaggccagcagcacccctg cggtgctagcaactgcttccgtgtgtgg ctgacagUPII actttgagcctacccttcccagtgagccgagattgtgElA catgccacaggtcctcatatagcgagacatatctgccacggaggAR ttaaaccagttgccgtgagaaaggagttgcatggtgctgg_PSCAE合成以T24细胞(购于中科院上海细胞库)基因组为模板；UPII promoter 合成以含有UPII promoter片段的CPl 131质粒(由美国cell Genesys, Inc.的DC Yu惠 赠)为模板；ElA合成以宿主细胞293细胞(购于中科院上海细胞库)基因组DNA为模板； AR合成以5637细胞(购于中科院上海细胞库)基因组DNA为模板。PCR反应在50 μ 1体 系进行，采用TaKaRa公司PCRKit试剂盒进行反应。反应体系构成如下5μ 1 10 X Taq缓冲 液，1. 5mM MgCl2,0. 2mM dNTP, IOpmol 引物，1 单位 Taq DNA 多聚酶(Roche, Indianapolis, IN)，2ul DNA 模板。反应在 thermal eye Ier (GeneAmp 2400 PCR system, Pekin Elmer, USA) 进行。PCR反应条件如下
ElAPSCAEUPII Promoter AR
预变性95° 30sec95° 15rainc95° 15min95。30sec
30 循环变性 95° 5min95° 30sec95。60sec95° 5min
退火 55° 45sec67° 30sec60° 30sec53° 45sec
延伸 72。45sec72° 30sec72° 60sec72。45sec
再延伸72° 6min72° IOmin72° IOmin72° 6rain琼脂糖凝胶电泳(含溴化乙锭1 μ g/ml)检测分析PCR产物。配制1. 5%的琼脂糖 凝胶20ml。将4个样品(扩增的E1A、PSCAE, UPII和AR)及DNA marker加入加样孔(样 品5ul+l0ading bufferlul)。跑胶约30-40分钟后在荧光显微镜下观察分析，有预期条带 出现，条带范围分别为ElA 500-600bp，PSCAE 及 UPII 300-400bp, AR 800_900bp。其中 PSCAE和UPII的大小分别为324bp和2204bp。从而证实了所需基因片段的正确性。同时本发明构建过程中还使用了检测报告基因即荧光素酶(Iuciferase)基因 Luc。该基因是通过 BamHI 和 Not I 双酶切质粒 Pbk-CMV-Luc (由 Ronald Rodriguez, James Buchanan BradyUrological Institute,School of Medicine,Johns Hopkins University 提供)获得。此外Luc基因的序列亦可通过GenBank查询或商业途径获得。
( 二 )重组载体Rp-E-UPII-EIA-AR的构建及鉴定(1)大肠杆菌DH5ci感受态细胞的制备 该制备过程主要参照《分子克隆》第二版，具体操作步骤如下。a.取_70°C保存的E. coli DH5 α菌种，将其划线接种于LB琼脂平板上，在37°C温 箱中培养过夜；b.挑取湿润光滑且边缘整齐的大肠杆菌E. coli DH5a单个菌落接种至3mL LB液 体培养基中，在37°C、200rpm下震荡培养过夜；c.将活化的菌种按接种于50ml LB液体培养基中，37°C振荡培养2_4小时，使 细胞生长达到对数生长期；d.在无菌条件下将菌液转移至预冷的无菌聚丙烯管中，冰浴IOmin后4°C下 8000rpm离心lOmin，使菌体完全沉淀；e.弃尽上清，用IOmL预冷的0. lmol/LCaCl2重悬菌体沉淀，冰浴20min后，4°C、 6000rpm 离心 IOmin ；f.弃尽上清，用2mL预冷的0. lmol/LCaCl2重悬菌体沉淀，冰浴3h后，加入15% 甘油，分装后置于-70°C保存备用。(2)PCR扩增的AR融合基因编码序列的5’末端磷酸化，具体步骤如下a.在微量离心管中配制全量为50ul的反应液，体系如下表所示 b.在37°C条件下反应30分钟后，再于70°C加热lOmin，使酶失活；；c.加入50ul的ddH20，补充体积至IOOul ；d.加入 IOul (1/10 量)的 3M 醋酸钠(PH5. 2)；e.加入4ul的DNAmase溶液，均勻混合；f.加入250ul的_20°C预冷的无水乙醇，充分混勻；g.于4°C、12000rpm离心lOmin，回收沉淀，用70%冷无水乙醇清洗沉淀后，室温干 燥10分钟；h.将沉淀溶解于20ul的ddH20中。(3)质粒 Rp-PSCAE-UPII-ElA 的制备a.起始穿梭载体 P-Shuttle CMV 源于 AdEasy System (Strata gene，Inc)，切除该 穿梭载体内在的BamHI位点(2191bp处)；b.在步骤(a)中切除位点处重新引入含有AgeId 1806bp处)，NheKlbp处)， BamHI (219Ibp处)和NotI (3197bp处)位点的多克隆位点(MCS)；
c.将 ElA 与 AR 的 PCR 反应产物应用 BamHI (2191bp 处)和 EcoRV (3229bp 处)双 酶切，保留酶切后得到的ElA-AR融合片段；d.将通过聚合酶链反应(PCR)方法获得的UPII启动子插入步骤(b)中穿梭载体 质粒的Nhel和BamHl位点，将通过PCR方法获得的PSCAE插入到穿梭载体相应的AgeI和 NheI位点，构建得到质粒Rp-PSCAE-UPII-ElA。所有内切酶均购自TaKaRa公司。所得质粒 均行凝胶电泳鉴定其构建的正确性。(4) 5’末端磷酸化后的AR编码序列与Rp-PSCAE-UPII-ElA质粒载体的连接采用Takara公司的高效DNA连接酶将步骤(2)中经5，末端磷酸化后的AR编码 序列与步骤(3)所得Rp-PSCAE-UPII-ElA载体进行连接，连接反应的条件为16°C连接lh。 连接体系如下 通过上述步骤最终得到的重组载体即本发明所述的重组腺病毒载体 Rp-E-UPII-ElA-AR，其结构见附图2所示。本重组载体最大的特征及意义在于，由PSCA特 异性增强子和UPII特异性启动子控制ElA-AR融合基因，通过AR增强腺病毒ElA基因的复 制和表达，从而发挥并增强其对膀胱肿瘤的溶瘤作用。(5)连接产物的转化、筛选取步骤1制备的新鲜大肠杆菌感受态细胞DH5 α 200u,置于冰浴中，加入步骤(4) 的连接产物10ul，轻轻混勻后冰浴30min，立即转移到42°C水浴中热休克90s，再冰浴静置 2min,加入0. 5mL无抗生素的LB液体培养基，37 °C水浴15min后置37 °C摇床轻摇45min ； 随后取200ul转化菌体，均勻涂布于含有卡那霉素(lOOug/mL)的LB平板培养基上，在超净 工作台吹干约10min，37°C倒置培养12 16h。然后从LB抗性平板中挑取长出的单一菌落 5-10个，分别接种于含卡那霉素的LB液体培养基中(5mL/管)，37°C摇床培养过夜。(6)重组质粒的鉴定将步骤(5)获得的质粒菌液培养过夜，用碱裂解法试剂盒提取质粒。用多核酸内 切酶消化Rp-E-UPII-ElA-AR，并在1 %琼脂糖凝胶电泳，其预期的条带是EcoRI 14876bp ； HincII11895bp，2334bp，647bp ；HindIII 8150bp, 4271bp, 1379bp, 1076bp。结果证实了载体 Rp-E-UPII-ElA-AR的构建正确(附图3)，表明各关键元件均已经连入重组载体中。图中标 识含义如下。E =PSCAE ；L :lkb plus maker。EI =EcoRI ；Hc =HincII ；Hd =HindIII0(7)与此同时，构建实验所需的对照载体和特异性检测载体，即含有荧光素酶基因 (Luc)的载体Rp-PSCAE-UPII-Luc。具体步骤如下a.起始穿梭载体 P-Shuttle CMV 源于 AdEasy System (Strata gene，Inc)，切除该 穿梭载体内在的BamHI (Ibp处)位点；
b.在a中切除位点处重新引入含有Agel(10298bp处)，Nhel(10611bp#)， BamHI (lbp处)和NotI (1689bp处)位点的多克隆位点(MCS)；c.将UPII启动子插入质粒的NheI和BamHI位点，Luc插入BamHI和NotI位点， 构建得到Rp-UPII-Luc。d.将PSCAE插入到Rp-UPII-Luc的AgeI和NheI位点构建成载体 Rp-PSCAE-UPII-Luc。构建此载体的目的是用于作为对照载体并后续通过荧光素酶(Luc)活性来检测 病毒的特异性。用多核酸内切酶对质粒Rp-UPII-Luc和Rp-PSCAE-UPII-Luc进行消化，并在
琼脂糖凝胶电泳。限制性内切酶消化Rp-PSCAE-UPII-Luc的预期条带是EagI :7059bp， 5073bp ；HincII :9277bp,2334bp,521bp ；HindIII :7469bp,1686bp,1597bp,1379bp ； SacII :10478bp，1654bp ；XhoI :9396bp，2736bp。限制性酶切消化后电泳测定证实了载体 Rp-PSCAE-UPII-Luc 的构建正确。(三)同源重组及重组载体的再鉴定将Rp-E-UPlI-ElA-AR与pAdEasy质粒在大肠杆菌BJ5183菌株中进行同源重组。 具体步骤如下(1)将无DNA酶的微量离心管和电转杯预冷4°C，并将BJ5183电穿孔感受态细胞 从-80°C冰箱中取出，冰浴中融化；(2)轻轻的吸取40ul电穿孔感受态细胞加入预冷的微量离心管；(3)分别吸取1 μ 1 (0. 1 μ g)线性化的Rp-E-UPII-ElA-AR质粒，加入离心管，并在 冰浴中轻轻混勻后转入电穿孔杯；(4)在 20 Ω，2. 5kV，25 μ F 条件下电转；(5)电转后立即移入EP管中，加入Iml LB培养基并上下颠倒EP管使细胞完全悬 浮；(6) 37 °C, 225-250r/min 条件下振摇 Ih ；(7)5000r/min条件下，将电转原液离心Imin后，用100 μ 1 LB培养基重悬沉淀的 转化后细胞，并全涂Kana LB琼脂培养基；(8) 37 °C恒温箱过夜。过夜培养后，可见LB固体培养基上有大、中、小3种体积不等的菌落生长，其中小 菌落和中等菌落为可能同源重组成功的菌落。使用灭菌牙签，挑选数个中、小菌落，接种于 含5ml卡那霉素的LB培养基中，于37°C 225 250r/min振摇过夜扩增后提取质粒DNA。经 PCR鉴定阳性的菌落进一步提取质粒酶切鉴定。酶切后产物行0. 5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。 结果进一步证实载体的构建正确(附图2和附图3)。(四)重组溶瘤腺病毒Ad-PSCAE-UPII-ElA-AR的包装、纯化及滴度测定由于本发明所使用的腺病毒载体不能自行包装成为具有感染能力的病毒颗粒，因 此必须在包装细胞即人胚肾293细胞中进行包装，从而得到本发明所述的重组溶瘤腺病毒 Ad-PSCAE-UPII-EIA-AR。腺病毒包装的具体步骤如下 转染前24h将293细胞接种于6孔板，使每孔细胞数 达到(7 8) X 105。为了获得较高的病毒滴度，应使细胞的融合度< 60% 70%，并在培养 中避免细胞的局部过度融合。转染前20 30min吸出培养基，用PBS洗涤2次后，每60mm培养孔中加入含FBS的培养基4ml，置入37°C孵育箱孵育。转染用PacI酶切质粒使其线性 化。凝胶回收线性化质粒片断，置于-20°C冰箱保存。(1)在293细胞孵育完成前lOmin，取出线性化的质粒；(2)将线性化质粒DNA (约15ul)加入250ul无抗生素无血清的DMEM培养基 (Gibco，USA)中，轻轻混和，除菌过滤。IOul Lipofectamine 2000加入250ul无抗生素无 血清的DMEM培养基中，轻轻混和后等5分钟。30分钟内混合上述DNA和脂质体，DNA加入 脂质体中，混合后孵育20分钟。(3)6孔板中达到90% -95%汇合度的293细胞，用无抗生素无血清的DMEM培养基 换液，每孔加入600ul。
(4)将上述混合液室温静置IOmin ；(5)轻轻上下颠倒使DNA悬液充分悬浮后，逐滴加入6孔培养板中，边加入边轻轻 旋转培养板，以使DNA在细胞中均勻分布，将6孔培养板放入37°C孵育箱中孵育。(6)次日观察，并加入Iml含10% FBS的DMEM培养基。(7)至7天后收获病毒，蚀斑纯化后用HEK293细胞增殖，按照标准方法用CsCl梯 度离心纯化病毒，从而得到最终所需重组腺病毒Ad-PSCAE-UPII-ElA-AR。提取该病毒DNA 作为模板，PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳(方法同实施例1中所述)鉴定各主要片段均存 在，病毒结构正确。病毒DNA提取方法如下①取腺病毒样品45ul，加入 3ul DNAse (10mg/ml)，37°C 1 小时。②加入0. 5mol/L EDTA (PH 8. 0)22ul, 10% SDS 28ul，25mg/ml 蛋白酶 K 3ul，混勻 后56°C 1小时。③冷却至室温，加10mg/ml RNAse A lul，37°C 30min。④加入等体积酚-氯仿(1 1)缓慢抽提5min，12000rpm离心6min。⑤转移上清液，加入等体积氯仿-异戊醇(24 1)缓慢抽提5min，12(KK)rpm离心 6min。⑥转移上清液，加入1/10体积3m0l/LNaAC (PH 3. 0)和2倍体积冷无水乙 醇，-20°C沉淀 20min 后，12000rpm 离心 6min。⑦弃上清，用500ul 70%乙醇洗沉淀，12000rpm离心6min。⑧弃上清，置于37°C恒温箱中30min。⑨待腺病毒DNA干燥后，加入15_50ul ddH20溶解腺病毒DNA，短期内使用置于4°C 保存，长期不用置于_20°C保存。用260nm吸光度法检测腺病毒颗粒滴度，采用TCID50法对293细胞进行病毒感染 滴度的检测。TCID50滴度测定操作方法如下(1)细胞准备①收集一瓶293细胞，计数。②用DMEM 2%准备 20ml 105/ml 细胞。③用12道排枪在2块96孔板中每孔加入IOOul细胞悬液。(2)准备稀释病毒液①第1管中加入0.9ml DMEM 2%，其余加入1. 8ml。第1管中再加入0. Iml病毒保存液。②上下吸打5次，混勻。③换用新枪头。④从第1管中吸取0. 2ml加入第2管中。 ⑤反复稀释至最高稀释度。 ⑥用同一管病毒保存液进行第2轮稀释。⑦最后8个稀释液加入96孔板，每孔0. 1ml，每个稀释度10孔，2孔为阴性对照。 阴性对照孔中加入0. Iml DMEM 2%监测细胞存活情况。加样时从最高稀释度开始。⑧37 °C 培养 10 天。⑨10天后倒置显微镜下观察，计算每一排中出现CPE的孔数。只要有一小点或是 一些细胞出现CPE(细胞病理现象)即为阳性，如果无法确定，可与阴性对照比较。⑩计算每一排中出现阳性的孔数。如果阴性对照中无任何CPE且细胞生长良好， 最低稀释度100%阳性而最高稀释度100%阴性，则本测试即为有效。最终检测发现，本发明所得到的重组溶瘤腺病毒Ad-PSCAE-UPII-ElA-AR的滴度 为 3· 8X lOnVP/mlJCID^/VP = 1 %, OD260/OD280 = 1. 2。重组所得的 Ad-PSCAE-UPII-ElA-AR 病毒存储于兰州大学第二医院泌尿研究所-80°冰箱。该生物样品已交付中国典型培养物 保藏中心即武汉大学保藏中心进行保藏。。(五)重组溶瘤腺病毒的特异性检测复苏培养不同组织来源肿瘤性细胞系人类膀胱移行细胞癌(T24、BIU87、5637)， 人类肝细胞癌0fepG2)，人类胃癌(BGC823)，人类前列腺癌(PC3、LNCAP)和正常尿路上 皮细胞NHU。在24孔板中接种各细胞2X IO5/孔，通过脂质体转染的方法分别将质粒 RP-UPII-Luc和Rp-E-UPll-Luc共转染入以上细胞系以测定其组织特异性，所有细胞系均 转染报告质粒和内参质粒(pSV-β -半乳糖苷酶对照载体，含有SV40早期启动子和增强子 驱动细菌IacZ基因的转录)(Promega，USA)。具体步骤如下(1)转染前一天用胰蛋白酶消化呈单个细胞并重新计数，以每孔2X IO5个细胞 接种于24孔培养板，每孔加入0. 5ml含血清的生长培养液(不含抗生素)。细胞达到 90% -95%的融合时进行转染。(2)对于要转染的每孔细胞，用50ul的DMEM无血清培养基来稀释0. 8ug的DNA (构 建质粒和PCMV- β -gal以2 1混合)。(3)对于要转染的每孔细胞，用50ul的0PTI-DMEM低血清培养基来稀释2ul的 Lipofectamine 2000,并在室温下孵育5分钟。(4)将步骤⑵中稀释了的DNA和步骤(3)中稀释了的LF2000混合，在室温下孵 育20分钟促使DNA-LF2000混合物的形成。(5)直接往每孔中加入DNA-LF2000混合物IOOul，并轻轻前后晃动培养板使其混 勻。(6)在37°C的0)2孵箱中孵育细胞5小时后加入600ul不含或含有IOnM R1881或 IOnMFlutamide培养液继续培养24小时后可以检测转基因的表达。(7)24小时后弃去培养液，加入200ul细胞裂解液，充分裂解后将裂解产物分装为 A、B两份，每份IOOul。
(8)在IOOul萤光素酶检测液中加入90ul细胞裂解液，3分钟内通过液闪仪测定
萤光强度获得L值。(9)在IOOul半乳糖苷酶检测液中加入90ul细胞裂解液，37°C孵育3个小时后加 入IM的Na2CO3终止反应后，通过酶标仪在420nm波长测定吸光度获得G值。用荧光素酶检测试剂盒(Promega，USA)和Wallac 1450 Microbeta liquid scintillationcounter (ffallac, Gaithersburg, MD)测定发光得到荧光素酶活性(L 值)。 L/G比值获得所有细胞的转染效率亦即载体活性指标。每个细胞系和载体均重复3次。结 果发现在膀胱癌细胞中萤光素酶活性远远高于非膀胱癌细胞，并且在膀胱癌细胞中转染 Rp-PSCAE-UPII-Luc的细胞较转染Rp-UPII-Luc的细胞中荧光素酶活性高，参见附图4，说 明PSCA增强子和UPII启动子具有膀胱特异性并且PSCAE在膀胱癌细胞中具有增强作用， 从而证明本发明所构建得到的重组载体和腺病毒在PSCAE和UPII控制下具有膀胱肿瘤特 异性。(六)膀胱癌特异性腺病毒溶瘤效应实验以膀胱肿瘤细胞T24为例说明本发明重组病毒对膀胱癌特异性溶瘤作用。用 0.25%胰蛋白酶消化T24细胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液制成单细胞悬液，以 每孔IO3-IO4个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积100 μ 1。将培养板放入37°C，5% CO2 孵箱中培养2小时后取出。吸去培养上清，接种不同MOI的重组腺病毒稀释液100μ1 。将 培养板置CO2孵箱于37°C，5% CO2及饱和湿度条件下培养72小时后观察并拍照。研究结 果显示，接种Ad-E-UP II-ElA-AR后能够裂解膀胱肿瘤T24细胞，参见附图5。
权利要求
一种特异性重组腺病毒的制备方法，其特征是将前列腺干细胞抗原增强子PSCAE和人尿路特异性蛋白UPII启动子插入到雄激素受体AR与腺病毒基因E1A的融合基因上游，构成具有膀胱癌特异性的重组腺病毒。
2.权利要求1所述的一种特异性重组腺病毒的制备方法，其特征是分别用具有膀胱癌 特异性的启动子和增强子取代控制该重组病毒复制所必需的早期基因E1A表达的启动子 和增强子，并且引入了一种雄激素受体基因使其同E1A基因融合表达，处于上游同一个膀 胱特异性启动子的控制之下。
3.权利要求2所述的一种特异性重组腺病毒的制备方法，其特征是将起始穿梭载体 P-Shuttle CMV内在的BamHI位点切除，再在该切除位点处重新引入含有AgeI，NheI，BamHI 和No11位点的多克隆位点，将E1A与AR用BamHI和EcoRV双酶切，保留酶切后得到的 E1A-AR融合片段，将膀胱组织特异性UPII启动子插入到穿梭载体质粒的Nhel和BamHI位 点，将前列腺干细胞抗原增强子PSCAE插入到穿梭载体相应的Agel和Nhel位点，构建得到 质粒Rp-PSCAE-UPII-ElA ；将5，末端磷酸化后的AR编码序列与Rp-PSCAE-UPII_E1A质粒 载体的连接，得到载体Rp-E-UPII-ElA-AR ；再将Rp-PSCAE-UPll-ElA-AR与pAdEasy质粒在 大肠杆菌中进行同源重组，重组产物在人胚肾293细胞中进行包装得到特异性重组腺病毒 Ad-PSCAE-UPII-ElA-AR。
4.权利要求3所述的方法制备的特异性重组腺病毒，其特征是其保藏编号为 CCTCC-V201001。
5.权利要求1或2或3的方法制备的特异性重组腺病毒在制备治疗膀胱肿瘤药物中的应用。
6.权利要求4所述的特异性重组腺病毒在制备治疗膀胱肿瘤药物中的应用。
7.重组质粒载体Rp-PSCAE-UPl1-E1A-AR的制备方法，其特征是将起始穿梭载体 P-Shuttle CMV内在的BamHI位点切除，在该切除位点处重新引入含有Agel，Nhel, BamHI 和NotI位点的多克隆位点，再将E1A与AR用BamHI和EcoRV双酶切，保留酶切后得到的 E1A-AR融合片段，将膀胱组织特异性UPII启动子插入到穿梭载体质粒的Nhel和BamHI位 点，将前列腺干细胞抗原增强子PSCAE插入到穿梭载体相应的Agel和Nhel位点，构建得到 质粒Rp-PSCAE-UPII-ElA ；将5，末端磷酸化后的AR编码序列与Rp-PSCAE-UPII-ElA质粒 载体的连接，得到载体Rp-PSCAE-UPII-ElA-AR。
8.权利要求7所述的重组质粒载体Rp-PSCAE-UPl1-E1A-AR在构建特异性重组腺病毒 中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种具有膀胱癌特异性的重组腺病毒，其保藏编号为CCTCC-V201001。本发明的特异性重组腺病毒的制备方法是将前列腺干细胞抗原增强子PSCAE和人尿路特异性蛋白启动子UPII插入到雄激素受体AR与腺病毒基因E1A的融合基因上游，构成具有膀胱癌特异性的重组腺病毒。本发明的重组腺病毒可在膀胱癌细胞中高效表达。
文档编号C12N15/66GK101864400SQ20101017768
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月7日 优先权日2010年5月7日
发明者王志平 申请人:兰州大学