具有改良生长特性的植物及其制备方法

专利名称：具有改良生长特性的植物及其制备方法
技术领域：
本发明一般地涉及分子生物学领域，并涉及改良植物生长特性的方法。更具体地，本发明涉及通过增加植物中RNA结合蛋白或其同源物的活性来改良植物生长特性，尤其是产率的方法。本发明还涉及具有增加活性的RNA结合蛋白或其同源物的植物，这些植物相对于相应的野生型植物，具有改良的生长特性。本发明方法中有用的RNA结合蛋白或其同源物具有RNA结合活性，并包含2或3个RNA识别基序(RRM)，且包含与基序IPYEAAVVALPVVVKERLVRILRLGIATRYD具有至少75％序列同一性的基序和/或与基序IIRFDPFTGEPYKFDP具有至少50％序列同一性的基序。本发明方法中有用的RNA结合蛋白或其同源物也可以是具有下列特征的RBP1多肽或其同源物(a)RNA结合活性；(b)两个RRM结构域；(c)下列两个基序(i)KIFVGGL和(ii)RPRGFGF，基序中允许至多三个氨基酸取代和任意的保守改变；和(d)按照增加的偏好顺序与SEQ IDNO15代表的氨基酸具有至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％序列同一性。本发明也提供在本发明方法中有用的构建体。
背景技术：
世界人口的不断增长和用于农业的可耕种土地供给的减少，推动农业研究向着提高农业效率的方向发展。农作物和园艺改良的常规方法是利用选育技术来鉴定具有所希望特性的植物。然而，这种选育技术有几个缺点，即这些技术通常是劳动密集型的，并且产生通常含有异源遗传组分的植物，这些遗传组分并非总是产生从亲本植物传递的所希望的性状。分子生物学的进展已经允许人类改造动物和植物的种质(germplasm)。植物基因工程需要分离和操作遗传物质(通常以DNA或RNA的形式)及随后将此遗传物质引入植物。这种技术使能够递送具有多种改良的经济、农业或园艺性状的农作物或植物。具有特别经济利益的一个性状是产率。产率通常被定义为来自农作物的经济价值可测量产出。其可以根据数量和/或质量来定义。产率直接依赖于几种因素，例如器官的数量和大小，植物构造(例如分枝数)，种子产量及更多的因素。根的发育，营养吸收和胁迫耐受性也是决定产率的重要因素。可以通过优化上述因素之一来增加农作物的产率。
改良植物的多种生长特性的能力将在如增加农作物、植物育种、观赏植物的生产、树木栽培(aboriculture)、园艺学和林业等领域具有许多应用。改良的生长特性，如产率，也可以用于在生物反应器中使用的藻类生产(用于诸如药物、抗体、或疫苗物质的生物技术生产，或用于有机废物的生物转化)及其它这类领域。
现已发现，与相应野生型植物相比，增加植物中RNA结合蛋白或其同源物的活性使植物具有改良的生长特性，所述RNA结合蛋白或其同源物具有RNA结合活性并包含2或3个RNA识别基序(RRM)，且包含与基序IPYEAAVVALPVVVKERLVRILRLGIATRYD具有至少75％序列同一性的基序和/或与基序IIRFDPFTGEPYKFDP具有至少50％序列同一性的基序。现已发现，与相应野生型植物相比，增加植物中RBP1多肽或其同源物的活性使植物具有改良的生长特性。所述RBP1多肽或其同源物指具有下列特征的多肽(a)RNA结合活性；(b)两个RRM结构域；(c)下列两个基序(i)KIFVGGL和(ii)RPRGFGF，基序中允许至多三个氨基酸取代和任意的保守改变；和(d)按照增加的偏好顺序与SEQ ID NO15代表的氨基酸具有至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％序列同一性。
RNA结合蛋白在转录和转录后水平基因表达的调节中具有重要作用。调节的水平延伸至RNA分子的合成、加工和周转中的所有步骤，包括前mRNA剪接、多聚腺苷酸化作用、mRNA转运、翻译和稳定性/衰变。调节主要是直接地通过RNA结合蛋白完成，或间接地通过RNA结合蛋白调节其它调节因子的功能完成。RNA-蛋白质相互作用是细胞代谢、细胞分化和发育以及感染病原体复制的多方面的中心环节。RNA识别基序或RRM通常存在于多种RNA结合蛋白中并且涉及所有转录后加工，其中每个蛋白质的RRM数目从一到四个拷贝变化。RRM是含有几个高度保守残基的大约80个氨基酸的区域，其中的一些簇聚为两个短的亚基序，RNP-1(八聚体)和RNP-2(六聚体)(Birney等，Nucleic Acids Research，1993，Vol.21，No.25，5803-5816)。
拟南芥(Arabidopsis)基因组编码196个含有RRM的蛋白质，其实例为RBP1(Lorkovic等，Nucleic Acids Research，2002，Vol.30，No.3，623-635)。他们报道AtRBP1的RRM与后生动物Musashi蛋白质的RRM最相似。除了AtRBP1，Lorkovic等还描述了与AtRBP1和Musashi蛋白质具有相似性的三个蛋白质。来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的RBP1由Suzuki等(Plant Cell Physiol.41(3)282-288(2000))首次分离并发现在快速分裂的组织中表达。RBP1为一种RNA结合蛋白(如Suzuki等2000所示)，包含两个RRM。

发明内容
根据本发明的一个实施方案，提供了改良植物生长特性的方法，其包括增加植物中RNA结合蛋白或其同源物的活性，所述RNA结合蛋白或其同源物具有RNA结合活性和2或3个RNA识别基序(RRM)，且包含与基序IPYEAAVVALPVVVKERLVRILRLGIATRYD具有至少75％序列同一性的基序和/或与基序IIRFDPFTGEPYKFDP具有至少50％序列同一性的基序。
根据本发明的一个实施方案，提供了改良植物生长特性的方法，其包含增加植物中RBP1多肽或其同源物的活性，所述RBP1多肽或其同源物具有下列特征(a)RNA结合活性；(b)两个RRM结构域；(c)下列两个基序(i)KIFVGGL；和(ii)RPRGFGF，基序中允许至多三个氨基酸取代和任意保守的改变；和(d)按照增加的偏好顺序与SEQ ID NO15代表的氨基酸具有至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％序列同一性。
有利地，执行本发明的方法使植物具有多种改良的生长特性，尤其是增加的产率，特别是种子产率。
本文所定义术语“增加的产率”意指相对于相应的野生型植物，在以下任一或多个方面的增加(i)植物的一个或多个部分，特别是地上(可收获)部分增加的生物量(重量)、增加的根生物量或者任何其它可收获部分增加的生物量；(ii)增加的种子产率，包括种子生物量(种子重量)的增加，并且其可以是在每株植物种子重量或以单个种子为基础的增加；(iii)增加的(饱满)种子数量；(iv)增加的种子大小，其也可能影响种子的组成；(v)增加的种子体积，其也可能影响种子的组成；(vi)增加的收获指数，其表示为可收获部分(如种子)的产率与总生物量的比值；和(vii)增加的千粒重(TKW)，其是从饱满种子数的总重量推算的。增加的TKW可能源自增加的种子大小和/或种子重量。
以玉米为例，产率的增加可以表现为以下的一个或多个每公顷或每英亩植物数量的增加，每株植物穗数的增加，行数、行粒数、粒重量、千粒重、穗长度/直径的增加等等。以稻为例，产率的增加可以表现为以下的一个或多个每公顷或每英亩植物的数量，每株植物的圆锥花序数，每个圆锥花序的小穗数，每个圆锥花序的花数，种子饱满率的增加，千粒重的增加等等。产率的增加也可能产生改变的构造，或者可以作为改变的构造的结果发生。
根据优选的方面，执行本发明的方法产生具有增加产率的植物。因此，本发明提供了增加植物产率的方法，该方法包括增加植物中RNA结合蛋白或其同源物的活性，所述RNA结合蛋白或其同源物具有RNA结合活性和2或3个RNA识别基序(RRM)，并且包含与基序IPYEAAVVALPVVVKERLVRILRLGIATRYD具有至少75％序列同一性的基序和/或与基序IIRFDPFTGEPYKFDP具有至少50％序列同一性的基序。根据本发明的另一个优选的方面，提供了增加植物产率的方法，所述方法包括增加植物中RBP1多肽或其同源物的活性，所述RBP1多肽或其同源物具有下列特征(a)RNA结合活性；(b)两个RRM结构域；(c)下列两个基序(i)KIFVGGL和(ii)RPRGFGF，基序中允许至多三个氨基酸取代和任意的保守改变；和(d)按照增加的偏好顺序与SEQ ID NO15代表的氨基酸具有至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％序列同一性。
由于本发明的转基因植物具有增加的产率，相对于相应野生型植物在它们生命周期相应阶段的生长速率而言，这些植物可能呈现增加的生长速率(在至少它们部分的生命周期中)。增加的生长速率可能是对植物的一个或多个部分(包括种子)特异性的，或者可能基本上遍及整个植物。具有增加生长速率的植物甚至可能呈现早期开花。生长速率的增加可能出现在植物生命周期的一个或多个阶段，或者出现在基本上整个植物生命周期的过程中。在植物生命周期的早期阶段，生长速率的增长可能表现为增强的活力。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，使植物能够比其它可能的情况更晚播种和/或更快收获。如果生长速率充分增加，可能允许播种同种植物物种更多的种子(例如播种和收获稻类植物，随后在一个常规的生长期播种和收获更多的稻类植物)。同样的，如果生长速率充分地增加，可能允许播种不同植物物种更多的种子(例如播种和收获稻类植物，随后，如播种和任选的收获大豆、马铃薯或任何其它适合的植物)。在一些植物的情况下也可能从同一根茎收获额外的次数。改变植物的收获周期可能会导致每英亩年生物量产量的增加(由于(比方说在一年中)任何特定植物生长和收获次数的增加)。与野生型对应物相比，生长速率的增加还可能允许在更广阔的地域栽培转基因植物，因为种植农作物的地域限制通常由种植时(早季)或收获时(晚季)不利的环境条件所决定。如果缩短收获周期，可以避免这类不利条件。可以从生长实验绘图的生长曲线中的多个参数确定生长速率，这类参数可以是T-Mid(植物达到其最大大小的50％所需时间)和T-90(植物达到其最大大小90％所需时间)等等。
执行本发明的方法使植物具有增加的生长速率。因此，本发明提供了增加植物生长速率的方法，该方法包括增加植物中RNA结合蛋白或其同源物的活性，所述RNA结合蛋白或其同源物具有RNA结合活性和2或3个RNA识别基序(RRM)，且包含与基序IPYEAAVVALPVVVKERLVRILRLGIATRYD具有至少75％序列同一性的基序和/或与基序IIRFDPFTGEPYKFDP具有至少50％序列同一性的基序。还提供了另一增加植物生长速率的方法，所述方法包括增加植物中RBP1多肽或其同源物的活性，所述RBP1多肽或其同源物具有下列特征(a)RNA结合活性；(b)两个RRM结构域；(c)下列两个基序(i)KIFVGGL和(ii)RPRGFGF，基序中允许至多三个氨基酸取代和任意保守的改变；和(d)按照增加的偏好顺序与SEQ ID NO15代表的氨基酸具有至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％序列同一性。
在植物处于无胁迫条件下，或相对于对照植物暴露于多种轻度胁迫下，其发生产率和/或生长速率的增加。通常植物通过更加缓慢的生长来应答暴露于胁迫。在重度胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。另一方面，轻度胁迫在本文中定义为当植物暴露于此，不导致植物完全停止生长丧失重新开始生长能力的任何胁迫。由于耕作方法(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的发展，栽培的农作物植物常常不会遇到重度胁迫。因此，由轻度胁迫诱导的受损的生长成为农业中不期望的特征。轻度胁迫是植物可能接触的典型胁迫。这些胁迫可能是植物暴露于其的日常生物的和/或非生物的(环境的)胁迫。典型的非生物的或环境的胁迫包括由反常的热或冷/冰冻温度产生的温度胁迫、盐胁迫、水胁迫(干旱或过量的水)。非生物胁迫也可以由化学药品引起。生物的胁迫一般是由病原体如细菌、病毒、真菌和昆虫引起的那些胁迫。
可以在任何植物中有利地修饰上述生长特性。
本文所用术语“植物”涵盖整个植物、植物的祖先和后代以及植物的部分，包括种子、芽、茎、叶、根、花(包含块茎)以及组织和器官，其中上述的每种包含目的基因/核酸。术语“植物”还涵盖悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，其中上述的每种同样也包含目的基因/核酸。
特别地可用于本发明方法中的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族的全部植物，特别是单子叶和双子叶植物，包括选自如下物种的饲料或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木金合欢属物种(Acaciaspp.)、槭树属物种(Acer spp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、七叶树属物种(Aesculus spp.)、新西兰贝壳杉(Agathis australis)、Albiziaamara、Alsophila tricolor、须芒草属物种(Andropogon spp.)、落花生属物种(Arachis spp.)、槟榔(Areca catechu)、Asteliafragrans、Astragaluscicer、Baikiaea plurijuga、桦木属(Betula spp.)、芸苔属(Brassica spp.)、木榄(Bruguiera gymnorrhiza)、Burkea africana、紫铆(Butea frondosa)、Cadaba farinosa、朱缨花属物种(Calliandra spp.)、大叶茶(Camelliasinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、决明属物种(Cassia spp.)、距豌豆(Centroema pubescens)、木瓜属物种(Chaenomeles spp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、小果咖啡(Coffeaarabica)、Colophospermum mopane、变异小冠花(Coronillia varia)、Cotoneaster serotina、山楂属物种(Crataegus spp.)、香瓜属物种(Cucumisspp.)、柏木属物种(Cupressus spp.)、Cyathea dealbata、榅桲(Cydoniaoblonga)、日本柳杉(Cryptomeria japonica)、香茅属物种(Cymbopogonspp.)、Cynthea dealbata、榅桲(Cydonia oblonga)、Dalbergia monetaria、大叶骨碎补(Davallia divaricata)、山马蟥属物种(Desmodium spp.)、粗糙蚌贝蕨(Dicksonia squarosa)、Diheteropogon amplectens、Dioclea spp、镰扁豆属物种(Dolichos spp.)、Dorycnium rectum、Echinochloapyramidalis、Ehrartia spp.、穇子(Eleusine coracana)、画眉草属物种(Eragrestis spp.)、刺桐属物种(Erythrina spp.)、桉属物种(Eucalyptusspp.)、Euclea schimperi、Eulalia villosa、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、费约果(Feijoa sellowiana)、草莓属物种(Fragaria spp.)、千斤拔属物种(Flemingia spp)、Freycinetia banksii、Geranium thunbergii、银杏(Ginkgobiloba)、Glycine javanica、Gliricidia spp、陆地棉(Gossypium hirsutum)、银桦属物种(Grevillea spp.)、Guibourtia coleosperma、岩黄芪属物种(Hedysarum spp.)、牛鞭草(Hemarthia altissima)、扭黄茅(Heteropogoncontortus)、大麦(Hordeum vulgare)、Hyparrhenia rufa、小连翘(Hypericumerectum)、Hyperthelia dissoluta、白花庭蓝(Indigo incarnata)、鸢尾属物种(Iris spp.)、Leptarrhena pyrolifolia、胡枝子属物种(Lespediza spp.)、Lettuca spp.、Leucaena leucocephala、Loudetia simplex、罗顿豆(Lotonusbainesii)、百脉根属物种(Lotus spp.)、Macrotyloma axillare、苹果属物种(Malus spp.)、Manihot esculenta、紫苜蓿(Medicago sativa)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、粉芭蕉(Musa sapientum)、烟草属物种(Nicotianum spp.)、驴食豆属物种(Onobrychis spp.)、Ornithopus spp.、稻属物种(Oryza spp.)、Peltophorum africanum、狼尾草属物种(Pennisetumspp.)、Persea gratissima、碧冬茄属物种(Petunia spp.)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、槟榔竹(Phoenix canariensis)、Phormium cookianum、石楠属物种(Photinia spp.)、白云杉(Piceaglauca)、松属物种(Pinusspp.)、豌豆(Pisum sativum)、新西兰罗汉松(Podocarpus totara)、Pogonarthria fleckii、Pogonarthria squarrosa、杨属物种(Populus spp.)、牧豆树(Prosopis cineraria)、花旗松(Pseudotsuga menziesii)、Pterolobiumstellatum、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、Rhaphiolepsis umbellata、美味棒花棕(Rhopalostylis sapida)、Rhusnatalensis、欧洲醋栗(Ribes grossularia)、茶藨子属物种(Ribes spp.)、洋槐(Robinia pseudoacacia)、蔷薇属物种(Rosa spp.)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、柳属物种(Salix spp.)、Schyzachyrium sanguineum、金松(Sciadopitys verticillata)、北美红杉(Sequoia sempervirens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属物种(Spinacia spp.)、Sporobolus fimbriatus、Stiburus alopecuroides、Stylosanthos humilis、葫芦茶属物种(Tadehagi spp.)、落羽松(Taxodiumdistichum)、阿拉伯黄背草(Themeda triandra)、车轴草属物种(Trifoliumspp.)、小麦属物种(Triticum spp.)、异叶铁杉(Tsuga heterophylla)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、野豌豆属物种(Vicia spp.)、葡萄(Vitisvinifera)、锥穗沃森花(Watsonia pyramidata)、马蹄莲(Zantedeschiaaethiopica)、玉米(Zea mays)、苋属植物、洋蓟、芦笋、椰菜、孢子甘蓝、卷心菜、芸苔、胡萝卜、花椰菜、芹菜、羽衣绿甘蓝、亚麻、羽衣甘蓝、小扁豆、油料种子油菜、秋葵、洋葱、马铃薯、稻、大豆、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜、茶树和藻类等等。根据本发明优选的实施方案，所述植物为农作物植物，如大豆、向日葵、芸苔、苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、马铃薯或烟草。进一步优选的植物是单子叶植物，如甘蔗。更优选的植物是谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、高粱或燕麦。
可以通过提高植物中RNA结合蛋白的水平来增加RNA结合蛋白或其同源物的活性。备选地，当RNA结合蛋白水平没有增加，或者甚至当RNA结合蛋白水平降低的时候，也可以增加其活性。这种情况出现在多肽固有特性发生改变的时候，例如，通过制备比野生型多肽更具活性的突变体形式。同样地，可以通过提高植物中RBP1多肽蛋白质的水平来增加RBP1多肽或其同源物的活性。备选地，当RBP1水平没有改变，或者甚至当RBP1多肽水平降低的时候，也可以增加其活性。这种情况出现在多肽固有特性发生改变的时候，例如，通过制备比野生型更具活性的突变体。
本文定义的术语“RNA结合蛋白或其同源物”指具有RNA结合活性和2或3个RNA识别基序(RRM)的多肽，且包含与基序IPYEAAVVALPVVVKERLVRILRLGIATRYD具有至少75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的基序和/或与基序IIRFDPFTGEPYKFDP具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的基序。该术语也指这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列按照增加的偏好顺序与SEQ ID NO2代表的氨基酸序列具有至少13％、15％、17％、19％、21％、23％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性。
可以使用本领域众所周知的常规技术容易地鉴定在以上定义范围内的“RNA结合蛋白或其同源物”。例如，使用本领域众所周知的技术可以在体外或体内容易地确定RNA结合活性。体外测定的实例包括使用North-Western和/或South-Western分析的核酸结合测定(Suzuki等.PlantCell Physiol.41(3)282-288(2000))；使用UV交联的RNA结合测定；RNA结合蛋白的电泳迁移率变动分析(Smith，RNA-Protein Interactions-APractical Approach 1998，University of Cambridge)。体内测定的实例包括TRAP(翻译阻抑测定方法)(Paraskeva E、Atzberger A、Hentze MWAtranslational repression assay procedure(TRAP)for RNA-proteininteractions in vivo.PNAS 1998Feb 3；95(3)951-6.)。
可以通过序列比对容易地确定多肽与SEQ ID NO2代表的氨基酸是否具有至少13％的同一性。序列比对的方法是本领域众所周知的，这类方法包含GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP应用Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.48443-453，1970)来查找两个全序列的比对，使匹配数最大化和空位数最小化。BLAST算法计算序列同一性的百分比，并对两序列之间的相似性进行统计分析。执行BLAST分析的软件可从生物技术信息国家中心公开地获得。使用例如VNTIAlignX多重比对程序，通过查询序列(优选蛋白质序列)与已知RNA结合蛋白序列的比对(见例如


图1所示的比对)，可以容易地鉴别与SEQ ID NO2所代表的氨基酸序列具有至少13％同一性的RNA结合蛋白或其同源物，所述VNTI AlignX多重比对程序基于修改的clustal W算法(InforMax，Bethesda，MD，http://www.informaxinc.com)，带有空位开放罚分为10以及空位延伸为0.05的缺省设置。
本领域熟练的技术人员还可以容易地鉴定与基序IPYEAAVVALPVVVKERLVRILRLGIATRYD具有至少75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的基序和/或与基序IIRFDPFTGEPYKFDP具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％序列同一性的基序。这可以通过进行比对和搜索同源区域容易地实现。
以下表1显示在序列SEQ ID NO2中找到的基序I和II以及与同源RNA结合蛋白中相应基序的序列同一性百分数。在本发明的方法中有用的RNA结合蛋白可能含有基序I或II，或基序I和II。
表1在RNA结合蛋白和其同源物中找到的基序。

落入“RNA结合蛋白或其同源物”定义的多肽的实例包括以下序列SEQ ID NO2来自烟草；SEQ ID NO4为来自稻BAC克隆(NCBI登录号AL731884)的蛋白质预测；SEQ ID NO6为来自cDNA(NCBI登录号AK059444)的稻蛋白质预测(片段)；SEQ ID NO8为来自cDNA(NCBI登录号AY105295)的玉米蛋白质预测(片段)；而SEQ ID NO10为全长的稻序列(NCBI登录号BAC83046)。
如这里定义的术语“RBP1或其同源物”指具有以下特征的多肽(a)RNA结合活性；(b)两个RRM结构域；(c)下列两个基序(i)KIFVGGL和(ii)RPRGFGF，基序中允许至多三个氨基酸取代和任意保守的改变；和(d)按照增加的偏好顺序与SEQ ID NO15代表的氨基酸具有至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％序列同一性。保守取代表是本领域众所周知的(见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company并见下表4)。
可以使用本领域技术人员众所周知的常规技术容易地鉴定属于以上定义的“RBP1多肽或其同源物”。例如，可以如上所述容易地确定RNA结合活性。
此外，RRM结构域是本领域众所周知的并且由约80-90个氨基酸组成；他们具有包括以α/β夹层形式排列的四条链和两个螺旋的结构，有时在RNA结合中存在第三个螺旋。含有RRM结构域的蛋白质具有模式结构。可以使用SMART鉴定RRM结构域(a Simple Modular ArchitectureResearch ToolIdentification of signaling domains，Schultz等.PNAS，95，5857-5864(1998))(http://smart.embl-heidelberg.de/)。又见Letunic等，Recent improvements to the SMART domain-based sequence annotationresource(Nucleic Acids Res.30(1)，242-244)。
可以使用如上所述比对的方法通过序列比对容易地确定多肽是否与SEQ ID NO2代表的氨基酸具有至少20％同一性。
由于RBP1多肽包含高度保守的区域，本领域技术人员通过将任意查询序列的保守区与已知的RBP1序列的那些比对将能够容易地鉴定其它的RBP1序列。这些保守区的实例包括以下两个基序(i)KIFVGGL和(ii)RPRGFGF，基序中允许至多三个氨基酸取代和任意保守的改变。
属于“RBP1多肽或其同源物”定义的多肽的实例包括全部来自拟南芥的At1g58470(SEQ ID NO15)、At4g26650(SEQ ID NO17)、At5g55550(SEQ ID NO19)、At4g14300(SEQ ID NO21)、At3g07810(SEQ ID NO23)、At2g33410(SEQ ID NO25)和At5g47620(SEQ ID NO27)；来自稻的NP_921939.1(SEQ ID NO29)；相应于稻mRNA编码的RBP1多肽的AK067725(SEQ ID NO31)和AK070544(SEQ ID NO33)；来自小麦的CK210974(SEQ ID NO35)和来自甘蔗的CA124210(SEQ IDNO37)是来自EST(表达序列标签)的部分蛋白质预测。
尽管表现出相对低的序列同源性(大约低至25％)，RPB1蛋白质与所有具有2个RRM结构域的全长蛋白质在结构上是高度保守的。可以由此容易地找到其它植物物种中的rbp1基因(见以上来自稻、甘蔗和小麦的实例，其在这里被第一次鉴定为RBP1蛋白质)。下表2显示在图3的比对中显示的一些序列的同一性百分数。
表2RBP1蛋白质序列与SEQ ID NO2基于全面整体序列比对的同源性


应该理解的是，术语RBP1多肽或其同源物不限于由SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23、SEQ ID NO25或SEQ ID NO27、SEQ ID NO29、SEQ ID NO31、SEQID NO33、SEQ ID NO35和SEQ ID NO37代表的序列，而是符合以下标准的任何多肽，所述标准为(a)RNA结合活性；(b)两个RRM结构域；(c)下列两个基序(i)KIFVGGL和(ii)RPRGFGF，基序中允许至多三个氨基酸取代和任意保守的改变；和(d)按照增加的偏好顺序与SEQ IDNO15代表的氨基酸具有至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％序列同一性，所述多肽在执行本发明的方法中是有用的。
编码RNA结合蛋白或其同源物的核酸可以是任何天然的或合成的核酸。如以上本文定义的RNA结合蛋白或其同源物是由RNA结合蛋白编码核酸/基因编码。因此如这里定义的术语“RNA结合蛋白编码核酸/基因”是编码如以上本文定义的RNA结合蛋白或其同源物的任何核酸/基因。RNA结合蛋白编码核酸的实例包括由SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQID NO5、SEQ ID NO7和SEQ ID NO9中任一代表的那些。RNA结合蛋白编码核酸/基因及其功能变体可适用于实施本发明的方法。RNA结合蛋白编码核酸/基因的功能变体包括RNA结合蛋白编码核酸/基因的部分和/或能够与RNA结合蛋白编码核酸/基因杂交的核酸。就功能变体而言的术语“功能”指这样的变体(即部分或杂交序列)，其编码具有RNA结合活性的多肽并且优选地和另外地具有至少一个RRM，优选2个或3个RRM且更优选具有至少下列基序之一与基序IPYEAAVVALPVVVKERLVRILRLGIATRYD具有至少75％序列同一性的基序和/或与基序IIRFDPFTGEPYKFDP具有至少50％序列同一性的基序。术语“功能”也可以指如以上本文定义的编码RNA结合蛋白或其同源物的核酸，当其在植物中引入和表达时使植物具有改良的生长特性。
编码RBP1多肽或其同源物的核酸可以是任何天然或合成的核酸。如以上本文定义的RBP1多肽或其同源物是由rbp1核酸/基因编码。因此如这里定义的术语“rbp1核酸/基因”是编码如以上本文定义的RBP1多肽或其同源物的任何核酸/基因。rbp1核酸的实例包括由SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34和SEQ ID NO36中任一代表的那些。rbp1核酸/基因及其功能变体可适用于实施本发明的方法。rbp1核酸/基因的功能变体包含rbp1核酸/基因的部分和/或能够与rbp1核酸/基因杂交的核酸。就功能变体而言的术语“功能”指这样的变体(即部分或杂交序列)，其编码的多肽具有RNA结合活性并且具有至少一个RRM结构域，优选2个RRM结构域且更优选具有下列两个基序(i)KIFVGGL和(ii)RPRGFGF，基序中允许至多三个氨基酸取代和任意保守的改变。术语“功能”也可以指编码如以上本文定义的RBP1多肽或其同源物的核酸，当其在植物中引入和表达时使植物具有改良的生长特性。
如本文定义的术语部分指编码RNA结合蛋白的DNA片段，按照增加的偏好顺序核苷酸长度至少为180、300、500或700，并且该部分编码的多肽具有RNA结合活性和至少1个RRM，优选两个或三个RRM以及基序I或II中至少一个，优选两个兼而有之。例如，可以通过对RNA结合蛋白编码核酸进行一个或多个缺失制备部分。可以以分离的形式使用该部分或可以将其融合于其它编码(或非编码)序列以(例如)产生组合若干活性的蛋白质，其中之一是RNA结合活性。当融合于其它编码序列时，由翻译产生的多肽可以大于RNA结合蛋白部分预测的多肽。优选地，所述功能部分是由SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7和SEQ ID NO9中任一代表的核酸的部分。
就rbp1核酸而言的术语部分指包含至少80个核苷酸的DNA片段并且所述片段编码具有RNA结合活性的多肽，并具有至少一个RRM结构域，优选两个RRM结构域且进一步优选具有下列两个基序(i)KIFVGGL和(ii)RPRGFGF。例如，可以通过对rbp1核酸进行一个或多个缺失制备部分。可以以分离的形式使用该部分或可以将其融合于其它编码(或非编码)序列以(例如)产生组合多种活性的蛋白质，其中之一是RNA结合活性。当融合于其它编码序列时，由翻译产生的多肽可以大于预测的rbp1片段多肽。优选地，该功能部分是由SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ IDNO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34和SEQID NO36中任一代表的核酸的部分。
另一类型的RNA结合蛋白变体是在降低的严格条件下，优选在严格条件下能够与如本文之前所定义的RNA结合蛋白编码的核酸/基因杂交的核酸，该杂交序列编码具有RNA结合活性的多肽，且具有至少1个RRM，优选两个或三个RRM，以及基序I或II的至少一个，优选两个。按照增加的偏好顺序，该杂交序列的核苷酸长度至少为180、300、500或700。优选地，该杂交序列能够与由SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7和SEQ ID NO9中任一代表的核酸杂交。
同样地，另一类型的变体rbp1是在降低的严格条件下，优选在严格条件下能够与如本文之前所定义的rbp1核酸/基因杂交的核酸，该杂交序列编码具有RNA结合活性的多肽，且具有至少1个RRM，优选两个RRM，且进一步优选具有下列两个基序(i)KIFVGGL和(ii)RPRGFGF。该杂交序列优选长度为至少80核苷酸。优选地，该杂交序列能够与由SEQ IDNO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ IDNO32、SEQ ID NO34和SEQ ID NO36中任一代表的核酸杂交。
如这里定义的术语“杂交”指其中基本同源互补的核酸序列彼此退火的过程。杂交过程能够完全在溶液中发生，即互补的核酸都在溶液中。杂交过程也可以在这种情况下进行，即互补核酸之一固定于基质上，如磁珠、琼脂糖珠或任何其它树脂上。此外，杂交过程也可以如此进行，即其中互补核酸之一固定在固相支持物如硝酸纤维素或尼龙膜上，或者如用照相平板印刷固定在例如硅质玻璃支持物上(后者称之为核酸阵列或微阵列，或称之为核酸芯片)。为了使杂交发生，通常使核酸分子热变性或化学变性，以使双链解链成两条单链，和/或除去单链核酸中的发夹结构或其它二级结构。杂交的严格性受诸如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成等条件的影响。在降低的严格条件下，优选在严格条件下发生杂交。严格条件的实例在下表3中显示。严格条件是至少像如条件A-L一样严格；降低的严格条件是至少像如条件M-R一样严格。
表3严格条件的实例


“杂合体长度”是杂交核酸的预期长度。当已知序列的核酸杂交时，可以通过序列比对及鉴别本文所述的保守区域来确定杂合体长度。

在杂交和洗涤缓冲液中，可以用SSPE(1×SSPE为0.15M NaCl，10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA，pH7.4)代替SSC(1×SSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)；杂交完成后洗涤15分钟。杂交和洗涤可以另外地包含5×Denhardt′s试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性的片段化鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠和高达50％的甲酰胺。*Tb-Tr对于预期长度小于50个碱基对的杂合体，杂交温度应该比杂合体的解链温度Tm低5-10℃；根据下述方程式确定Tm。对于杂合体长度小于18碱基对，Tm(℃)＝2×(A+T碱基数)+4×(G+C碱基数)。对于杂合体长度在18至49碱基对之间，Tm(℃)＝81.5+16.6×log10[Na+]+0.41×(％G+C)-(600/N)，其中N为杂合体中的碱基数，[Na+]为杂交缓冲液中钠离子浓度(1×SSC的[Na+]＝0.165M)。±本发明涵盖以肽核酸(PNA)或修饰的核酸取代任一或多个DNA或RNA杂交配偶体。
RNA结合蛋白编码核酸或其变体可以源自任何天然或人工来源。可以从微生物来源如细菌、酵母或真菌，或从植物、藻类或动物(包括人)来源分离核酸/基因或其变体。可以通过精细的人工操作从其在组合物和/或基因组环境中的天然形式修饰此核酸。此核酸优选植物来源，或来自相同植物物种(例如来自将向其中引入的植物物种)或来自不同的植物物种。所述核酸可以从双子叶物种，优选从烟草(Nicotianae)科，更优选从烟草分离。更优选地，从烟草分离的RNA结合蛋白编码核酸是由SEQ ID NO1代表的，且RNA结合蛋白氨基酸序列是如SEQ ID NO2代表的。
Rbp1核酸或其变体可以源自任何天然或人工来源。可以从微生物来源如细菌、酵母或真菌，或从植物、藻类或动物(包括人)来源分离核酸/基因或其变体。可以通过精细的人工操作从其在组合物和/或基因组环境中的天然形式修饰此核酸。此核酸优选植物来源，或来自相同植物物种(例如来自将向其中引入的植物物种)或来自不同的植物物种。所述核酸可以从双子叶物种，优选从十字花(Brassicaceae)科，更优选从拟南芥分离。更优选地，从拟南芥分离的rbp1是由SEQ ID NO14代表的，而RBP1氨基酸序列是如SEQ ID NO15代表的。
可以通过引入遗传修饰(优选在RNA结合蛋白编码基因座)增加RNA结合蛋白或其同源物的活性。同样地，可以通过引入遗传修饰(优选在rbp1基因座)增加RBP1多肽或其同源物的活性。这里定义的基因座意指基因组区，其包含目的基因和编码区上游或下游10KB。
例如，可以通过下列任何一种(或多种)方法引入遗传修饰TDNA激活、TILLING、定点诱变、同源重组或通过在植物中引入和表达编码RNA结合蛋白或其同源物的核酸或通过在植物中引入和表达编码RBP1多肽或其同源物的核酸。引入遗传修饰之后，继之以选择RNA结合蛋白增加的活性或选择RBP1多肽增加的活性，所述活性的增加使植物具有改良的生长特性。
T-DNA激活标记(Hayashi等Science(1992)1350-1353)涉及T-DNA的插入，此T-DNA通常含有启动子(也可以是翻译增强子或内含子)，其在目的基因的基因组区或基因编码区上游或下游10KB，并且在构型上使启动子能够指导靶基因的表达。通常天然启动子对靶基因表达的调控被破坏，基因由新引入的启动子控制。启动子一般包含于T-DNA中。例如，通过农杆菌(Agrobacterium)感染将此T-DNA随机插入植物基因组并导致在插入T-DNA附近的基因过表达。得到的转基因植物由于引入的启动子附近基因过表达而表现出显性表型。引入的启动子可以是任意能够在所希望的生物体内(在此种情况是植物)指导基因表达的启动子。例如，组成型的、组织偏好的、细胞类型偏好的和诱导型的启动子都适用于T-DNA激活。
也可以通过TILLING(靶向诱导的基因组局部突变)技术将遗传修饰引入RNA结合蛋白编码基因座。这是一种诱变技术，用于产生和/或鉴定、及最后分离诱变的能呈现RNA结合蛋白活性的RNA结合蛋白编码核酸(或rbp1编码核酸)的变体。TILLING还允许选择携带此种突变变体的植物。这些突变体甚至可能比其天然形式基因呈现更高的RNA结合蛋白活性。TILLING将高密度诱变和高通量筛选方法结合在一起。TILLING一般遵循的步骤为(a)EMS诱变(Redei和Koncz，1992；Feldmann等，1994；Lightner和Caspar，1998)；(b)DNA制备和个体合并；(c)目的区域的PCR扩增；(d)变性和退火以形成异源双链；(e)DHPLC，其中库中存在的异源双链会在色谱图上检测到额外的峰；(f)突变个体的鉴定；和(g)突变PCR产物的测序。TILLING的方法是本领域内众所周知的(McCallum NatBiotechnol.2000 Apr；18(4)455-7，由Stemple综述，2004(TILLING-ahigh-throughput harvest for functional genomics.Nat Rev Genet.2004Feb；5(2)145-50.))。
定点诱变可用于产生RNA结合蛋白编码核酸或其部分的变体，所述变体保留活性，即RNA结合活性。可以通过若干方法来完成定点诱变，最常见的是基于PCR的方法(current protocols in molecular biology.Wiley编辑http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html)。定点诱变可用于产生RNA结合蛋白编码核酸或其部分的变体，所述变体保留活性，即RNA结合活性。同样地，定点诱变可用于产生RBP1编码核酸或其部分的变体，所述变体保留活性，即RNA结合活性。定点诱变也可用于产生RBP1编码核酸或其部分的变体，所述变体保留活性，即RNA结合活性。
TDNA激活、TILLING和定点诱变是能够产生新的等位基因和RNA结合蛋白变体(该变体保留RNA结合蛋白功能)或能够产生新的等位基因和rbp1变体(该变体保留RBP1功能)的技术的实例，因此其在本发明的方法中是有用的。
同源重组允许向基因组中的指定选择位置引入所选的核酸。同源重组是生物科学中常规使用的标准技术，其用于低等有机体如酵母或藓类(如physcomitrella)。在植物中执行同源重组的方法已经不仅在模式植物中被描述(Offringa等，Extrachromosomal homologous recombination and genetargeting in plant cells after Agrobacterium-mediated transformation.1990 EMBO J.1990 Oct；9(10)3077-84)，而且也在农作物植物，如稻中得到描述(Terada R，Urawa H，Inagaki Y，Tsugane K，Iida S.Efficient genetargeting by homologous recombination in rice.Nat Biotechnol.2002.lida和TeradaA tale of two integrations，transgene and T-DNAgene targetingby homologous recombination in rice.Curr Opin Biotechnol.2004 Apr；15(2)132-8)。所靶向的核酸(其可能是上文中定义的RNA结合蛋白编码核酸或其变体或其可能是上文中定义的rbp1核酸或其变体)不需靶向RNA结合蛋白基因座或靶向rbp1基因座，但是可以被引入例如高表达的区域。所靶向的核酸可以是改良的等位基因，其用于替换内源基因或额外引入到内源基因中。
根据本发明的优选实施方案，通过在植物中引入和表达编码RNA结合多肽或其同源物的核酸可以改良植物的生长特性，所述多肽或其同源物具有RNA结合活性和2或3个RNA识别基序(RRM)，并且其包含与基序IPYEAAVVALPVVVKERLVRILRLGIATRYD具有至少75％序列同一性的基序和/或与基序IIRFDPFTGEPYKFDP具有至少50％序列同一性的基序。
引入遗传修饰(在此情况中其不需在RNA结合蛋白基因座中)的优选方法是在植物中引入和表达如上文定义的编码RNA结合蛋白或其同源物的核酸。
根据本发明另一优选实施方案，可以通过在植物中引入和表达编码RBP1多肽或其同源物的核酸改良植物生长特性。
引入遗传修饰(在此情况中其不需在rbp1基因座中)的一个优选方法是在植物中引入和表达如上文定义的编码RBP1多肽或其同源物的核酸。如上提到的RBP1多肽或其同源物具有(a)RNA结合活性；(b)两个RRM结构域；(c)下列两个基序(i)KIFVGGL和(ii)RPRGFGF，基序中允许至多三个氨基酸取代和任意的保守改变；和(d)按照增加的偏好顺序与SEQID NO15代表的氨基酸具有至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％序列同一性。
蛋白质的“同源物”涵盖肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，其相对于所讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸的取代、缺失和/或插入，并且具有与其衍生自的未修饰蛋白质相似的生物学活性和功能活性。为了产生这样的同源物，蛋白质的氨基酸可以由具有相似性质(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或打破α螺旋结构或β片层结构的倾向)的其它氨基酸替换。保守取代表是本领域内众所周知的(例如见Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company)。下表给出保守氨基酸取代的实例。
表4保守氨基酸取代的实例

术语“同源物”也涵盖两种具体形式的同源物，其包括直系同源序列和旁系同源序列，其涵盖用于描述基因祖先关系的进化概念。术语“旁系同源”涉及在物种基因组内部的基因复制产生的旁系基因。术语“直系同源”涉及由于物种形成产生的不同有机体中的同源基因。
例如可以通过执行所谓的交互(reciprocal)blast搜索容易地找到例如在单子叶植物物种中的直系同源物。这可以通过使用所研究序列(例如SEQID NO1或2或者SEQ ID NO14或15)针对任何序列数据库(诸如可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov找到的公共可获得的NCBI数据库)通过一次blast而实现。例如，如果寻找稻中的直系同源物，对研究序列的blast应该在可从NCBI获得的针对稻(Oryza sativa)Nipponbare的28,469个全长cDNA克隆中进行。当从核苷酸开始时可使用具有标准缺省值的BLASTn或tBLASTX，或当从蛋白质开始时可使用具有标准缺省值的BLASTP或TBLASTN。Blast结果可以过滤。接着使用过滤的结果或者未过滤的结果中的全长序列针对所研究序列源自的生物体的序列进行反向blast(二次blast)。然后比较第一次和第二次blast的结果。当所述二次blast结果给出与RNA结合蛋白编码核酸或RNA结合蛋白多肽具有最高相似性时，即为找到直系同源物，例如，如果生物体之一是烟草，那么找到旁系同源物。对于RBP1，当所述二次blast结果给出与rbp1核酸或RBP1多肽具有最高相似性时，即为找到直系同源物，例如，如果生物体之一是拟南芥，那么找到旁系同源物。大家族的情况下可以使用Clustal W，继之以邻近连接树来帮助聚类可视化。
同源物可能是蛋白质的“取代变体”的形式，即在氨基酸序列中至少有一个残基被除去，并且在这一位置插入不同的残基。氨基酸取代通常是单个残基的取代，但是由多肽的功能性限制因素决定也可能是成簇取代；插入通常在约1到10个氨基酸残基数量级。优选地，氨基酸取代包含保守的氨基酸取代。
同源物也可以是蛋白质的“插入变体”的形式，即在蛋白质的预定位置引入一个或多个氨基酸残基。插入可以包含氨基端和/或羧基端的融合，以及单个或多个氨基酸的序列内部插入。一般数量级在约1到10个残基的氨基酸序列内部的插入将小于氨基或羧基端的融合。氨基或羧基端融合蛋白质或肽的实例包含在酵母双杂交系统中应用的转录激活因子的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白质、(组氨酸)6-标签、谷胱甘肽S-转移酶标签、蛋白质A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、FLAG表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白质C表位和VSV表位。
蛋白质“缺失变体”形式的同源物特征在于从蛋白质中除去一个或多个氨基酸。
可使用本领域内众所周知的肽合成技术，如固相肽合成法等，或通过重组DNA操作容易地制备蛋白质的氨基酸变体。用于产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的DNA序列操作方法是本领域内众所周知的。例如，在DNA预定位置产生取代突变的技术是本领域内技术人员众所周知的，包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB，Cleveland，OH)、QuickChange定点诱变(Stratagene，San Diego，CA)、PCR介导的定点诱变或其它定点诱变方法。
RNA结合蛋白或其同源物可以是衍生物或RBP1多肽或其同源物可以是衍生物。“衍生物”包含肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，与蛋白质天然产生形式的(例如SEQ ID NO2所代表的或在RBP1情况下SEQ ID NO15所代表的)氨基酸序列相比，其可以包括天然的和非天然产生的氨基酸残基的取代、缺失或添加。蛋白质的“衍生物”涵盖肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，与多肽天然产生形式的氨基酸序列相比，其可以包含天然发生改变的、糖基化的、酰基化的或非天然产生的氨基酸残基。衍生物还可以包含相对于其源自的氨基酸序列的一个或多个非氨基酸取代(例如共价或非共价地结合于氨基酸序列的报告分子或其它配体，如与之结合的有利于检测的报告分子)，以及相对于天然产生蛋白质的氨基酸序列而言非天然产生的氨基酸残基。
RNA结合蛋白或其同源物可以由RNA结合蛋白核酸/基因的选择性剪接变体编码。RBP1多肽或其同源物可以由rbp1核酸/基因的选择性剪接变体编码。本文所用术语“选择性剪接变体”涵盖其中选择的内含子和/或外显子已被切除、取代或添加的核酸序列的变体。这样的变体保留了蛋白质的生物活性，这可以通过有选择地保留蛋白质的功能性片段实现。这样的剪接变体可以是天然的或人工的。产生这种剪接变体的方法是本领域众所周知的。优选的剪接变体是SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ IDNO5、SEQ ID NO7和SEQ ID NO9代表的核酸的剪接变体。更优选的剪接变体编码的多肽保留了RNA结合活性并且具有至少一个RRM，优选2个或3个RRM和基序I或II中的至少一个，优选两者兼具。优选的RBP1的剪接变体是由SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23、SEQ ID NO25或SEQ ID NO27、SEQID NO29、SEQ ID NO31、SEQ ID NO33、SEQ ID NO35和SEQ IDNO37代表的核酸的剪接变体。更多优选的剪接变体编码的多肽保留了RNA结合活性并且具有一个优选两个RRM结构域以及进一步优选以下两个基序(i)KIFVGGL和(ii)RPRGFGF，基序中允许至多三个氨基酸取代和任意的保守的改变。
同源物还可以由编码RNA结合蛋白或其同源物的核酸的等位基因变体编码，优选SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7和SEQ ID NO9中任一代表的核酸的等位基因变体。进一步优选由等位基因变体编码的多肽具有RNA结合活性并且具有至少一个RRM，优选2个或3个RRM以及基序I或II真的至少一个，优选两者兼具。同源物还可以由编码RBP1多肽或其同源物的核酸的等位基因变体编码，优选由SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQID NO23、SEQ ID NO25或SEQ ID NO27、SEQ ID NO29、SEQ IDNO31、SEQ ID NO33、SEQ ID NO35和SEQ ID NO37代表的核酸的等位基因变体。进一步优选由等位基因变体编码的多肽具有RNA结合活性和一个优选2个RRM结构域和以下两个基序(i)KIFVGGL和(ii)RPRGFGF，基序中允许至多三个氨基酸取代和任意的保守的改变。等位基因变体天然存在，并且这些天然等位基因的用途包含于本发明的方法中。等位基因变体包含单核苷酸多态性(SNP)，以及小型插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。SNP和INDEL在大多数生物体天然存在的多态性品系中形成最大的一组序列变体。
根据本发明的优选方面，RNA结合蛋白编码核酸或其变体的表达有所提高或增加。根据本发明的优选方面，rbp1核酸或其变体的表达有所提高或增加。获得提高或增加的基因或基因产物表达的方法在本领域内有充分的记录，其包括，例如由适当的启动子驱动的过表达、转录增强子或翻译增强子的使用。可以将用作启动子或增强子元件的分离的核酸引入非异源形式多核苷酸的适当位置(一般是上游)，从而上调RNA结合蛋白编码核酸或其变体的表达。例如，可以通过突变、缺失和/或取代，体内地改变内源启动子(见Kmiec，美国专利号5,565,350；Zarling等，PCT/US93/03868)，或者将分离的启动子在本发明基因的适当方向和距离引入植物细胞中，从而控制基因的表达。
如果希望多肽表达，通常要在多肽编码区域的3’-末端包括多腺苷酸化区域。多腺苷酸化区域可以源自天然基因、多种其它植物基因或T-DNA。例如，加入的3’末端序列可以源自胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因、或备选地来自另外的植物基因、或次优选地来自任何其它真核基因。
也可以在部分编码序列的5’非翻译区或编码序列中加入内含子序列，来增加在胞质中累积的成熟信使的数量。已显示，在植物和动物表达构建体的转录单位中包含的可剪接的内含子均可以同时在mRNA和蛋白质水平增加基因表达高达1000倍，Buchman和Berg，Mol.Cell biol.84395-4405(1988)；Callis等，Genes Dev.11183-1200(1987)。通常当这种内含子被放置在转录单位的5’末端附近时，其提高基因表达的作用达到最大。玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6，Bronze-1内含子的使用是本领域公知的。通常见The Maize Handbook，第116章，Freeling和Walbot编辑，Springer，N.Y.(1994)。
本发明还提供遗传构建体和载体，以促进用于本发明方法中的核酸序列的引入和/或表达。
因此，提供的基因构建体包含(i)RNA结合蛋白编码核酸或其变体；(ii)一个或多个能驱动(i)的核酸序列表达的控制序列；和任选的(iii)转录终止序列。
还提供的基因构建体包含(i)rbp1核酸或其变体；(ii)一个或多个能驱动(i)的核酸序列表达的控制序列；和任选的(iii)转录终止序列。
可以使用本领域技术人员众所周知的重组DNA技术构建用于本发明方法中的构建体。可以将基因构建体插入(可商购的)载体中，所述载体适于转化进入植物并适于在转化的细胞中表达目的基因。
使用包含目的序列(即RNA结合蛋白编码核酸或其变体或rbp1核酸或其变体)的载体转化植物。将目的序列有效连接于一个或多个控制序列(至少连接于启动子)。术语“调控元件”、“控制序列”和“启动子”在本文中都可交换的使用，并在上下文中泛指能够影响其连接序列表达的调控核酸序列。上述术语涵盖源自典型真核生物基因组基因(包括具有或没有CCAAT盒序列的TATA盒，其对于精确的转录起始是必需的)的转录调控序列，以及另外的调控元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)，其通过应答发育刺激和/或外部刺激或以组织特异的方式改变基因表达。该术语还包括了经典原核生物基因的转录调控序列，在此情况下其可以包括-35盒序列和/或-10盒转录调控序列。术语“调控元件”也涵盖合成的融合分子或衍生物，其赋予、激活或提高细胞、组织或器官中核酸分子的表达。本文所用的术语“有效连接”指在启动子序列和目的基因之间的功能性连接，从而使启动子序列能起始目的基因的转录。
有利地，可以使用任意类型的启动子驱动核酸序列的表达。启动子可以是诱导型启动子，即应答发育、化学、环境或物理的刺激，具有诱导的或增加的转录起始。诱导型启动子的实例是胁迫诱导型启动子，即当植物暴露于多种胁迫条件下时激活的启动子。另外或备选的，所述启动子可以是组织偏好的启动子，即能够在某些组织，如在叶、根、种子等组织中优先地起始转录的启动子。
优选的，RNA结合蛋白编码核酸或其变体有效的连接于种子偏好的启动子。种子偏好的启动子是偏好，但无需专一地在种子组织中驱动表达的启动子。优选的种子组织为胚乳。优选的启动子为谷醇溶蛋白(prolamin)启动子，例如来自稻的谷醇溶蛋白启动子(SEQ ID NO11)。应该明确的是本发明的应用并不限于SEQ ID NO1代表的RNA结合蛋白编码核酸，也不限于由谷醇溶蛋白启动子驱动时RNA结合蛋白编码核酸的表达。
优选地，rbp1核酸或其变体有效的连接于能够在芽中偏好地表达核酸的启动子。优选地，能够在芽中偏好地表达核酸的启动子具有与β扩展蛋白启动子相似的表达谱，例如在图5所示。最优选地，能够在芽中偏好地表达核酸的启动子来自稻的β扩展蛋白启动子(SEQ ID NO38)。应该明确的是本发明的应用不限于SEQ ID NO14代表的rbp1核酸，也不限于由β扩展蛋白启动子驱动时rbp1核酸的表达。
任选的，还可以在引入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。术语“终止子”涵盖控制序列，该DNA序列位于转录单位末端，传递信号引发原始转录物的3’加工和多腺苷酸化以及转录的终止。另外的调控元件可以包括转录和翻译的增强子。本领域的那些技术人员将知道适合用于进行本发明的终止子和增强子序列。
本发明的遗传构建体还包括在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制序列的起点。一个实例是当需要将遗传构建体作为附加型遗传元件(如质粒或黏粒分子)在细菌细胞中维持时。优选的复制起点包括(但不限于)f1-ori和colE1。
遗传构建体可以任选地包含可选择的标记基因。如本文所用，术语“可选择的标记基因”包括赋予细胞表型的任意基因，该基因在细胞中的表达有利于鉴定和/或选择使用本发明的核酸构建体转染或转化的细胞。适当的标记可以选自带有抗生素或除草剂抗性的标记，其引入新的代谢特性或允许可视的选择。可选择的标记基因的实例包括赋予抗生素抗性的基因(例如磷酸化新霉素和卡那霉素的npt II，或磷酸化潮霉素的hpt)，赋予除草剂抗性的基因(例如bar提供对Basta的抗性；aroA或gox提供对草甘膦的抗性)，或提供代谢特性的基因(如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA)。可视的标记致使形成颜色(例如β-葡糖醛酸糖苷酶，GUS)、发光(例如萤光素酶)或荧光(绿色荧光蛋白GFP及其衍生物)。
本发明还涵盖可由本发明方法获得的植物。本发明因此提供可由本发明方法获得的植物，该植物中引入了RNA结合蛋白编码核酸或其变体或rbp1核酸或其变体。
本发明还提供用于产生具有改良生长特性的转基因植物的方法，其包括在植物中引入和表达RNA结合蛋白编码核酸或其变体。
更具体地，本发明提供用于产生具有改良生长特性的转基因植物的方法，该方法包括
(i)向植物或植物细胞中引入RNA结合蛋白编码核酸或其变体；和(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
本发明还提供用于产生具有改良生长特性的转基因植物的方法，其包含在植物中引入和表达rbp1核酸或其变体。
更具体地，本发明提供用于产生具有改良生长特性的转基因植物的方法，该方法包括(iii)向植物或植物细胞中引入rbp1核酸或其变体；和(iv)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
可以将核酸直接引入植物细胞或植物本身(包含引入组织、器官或植物的任何其它部分)。根据本发明的优选特征，优选通过转化将核酸引入植物。
这里所指术语“转化”涵盖将外源多核苷酸转移进宿主细胞，而不考虑转移所用的方法。可以使用本发明的遗传构建体转化由器官发生或者胚胎发生的能够继之进行克隆增殖的植物组织并从其再生整个植物。具体组织选择将由可提供的和最适于的转化具体物种的克隆增殖系统决定而改变。示例性的靶组织包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、雌配子、愈伤组织、存在的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)，和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。可以将多核苷酸瞬时或稳定地引入宿主细胞，并且可以，例如作为质粒保持非整合的状态。备选地，其可以整合进入宿主基因组。得到的转化植物细胞可以接着用于以本领域技术人员公知的方式再生转化的植物。
植物物种的转化目前是一种相当常规的技术。有利地，可以使用几种转化方法中的任一将目的基因引入适当的祖先细胞。转化方法包括用脂质体、电穿孔、增强游离DNA摄取的化学品、直接向植物注射DNA、粒子枪轰击、用病毒或花粉转化和显微投影(microprojection)。方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens，F.A.等，1882，Nature 296，72-74；Negrutiu I.等，June 1987，Plant Mol.Biol.8，363-373)、原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等，1985 Bio/Technol 3，1099-1102)、植物材料的显微注射(Crossway A.等，1986，Mol.Gen Genet 202，179-185)、DNA或RNA包被的粒子轰击(Klein T.M.等，1987，Nature 327，70)、(非整合的)病毒感染等等。优选使用任何熟知的稻转化方法经由农杆菌属介导的转化产生表达RNA结合蛋白的转基因稻，所述稻转化方法例如在任何以下文献中描述的方法公开的欧洲专利申请EP 1198985 A1，Aldemita和Hodges(Planta，199，612-617，1996)；Chan等(Plant Mol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等(Plant J.6(2)271-282，1994)，其公开内容如同其陈述的全部内容那样被引入作为参考。至于玉米转化，优选的方法如在Ishida等(Nat.Biotechnol.1996，14(6)745-50)或Frame等(Plant Physiol.2002，129(1)13-22)所述，其公开内容如同其陈述的全部内容那样被引入作为参考。
通常在转化以后，选出存在一个或多个标记的植物细胞或细胞组，所述标记由与目的基因共转移的植物可表达基因编码，继之将转化的材料再生成整个植物。
DNA转移和再生之后，可评估假定的转化植物，例如用Southern分析目的基因的存在、拷贝数和/或基因组组成。备选的或额外的，可用Northern和/或Western分析监测新引入DNA的表达水平，这两种技术都是本领域内普通技术人员众所周知的。
产生的转化植物可以通过多种方式繁殖，如用克隆繁殖或经典的育种技术。例如，第一代(或T1)转化的植物可自交得到纯合的第二代(或T2)转化体，进一步通过经典育种技术繁殖T2植物。
产生的转化生物体可以有多种形式。例如，它们可以是转化细胞和未转化细胞的嵌合体；克隆的转化体(例如经过转化含有表达盒的所有细胞)；转化和未转化组织的嫁接体(例如在植物中，嫁接到未转化接穗上的转化的根茎)。
本发明显然扩展至由本文所述方法产生的任何植物细胞或植物，以及所有植物的部分和其无性繁殖体。本发明还涵盖由任意上述方法产生的原代转化或转染的细胞、组织、器官或整个植物的后代，所述后代的唯一要求是与本发明方法产生的亲本呈现同样的基因型和/或表型特性。本发明也包括含有分离的RNA结合蛋白核酸或其变体的宿主细胞。本发明优选的宿主细胞是植物细胞。本发明也扩展至植物可收获的部分，例如，但不限于种子、叶、果实、花、茎培养物、根茎、块茎和球茎。
本发明还涵盖RNA结合蛋白核酸或其变体的用途和RNA结合蛋白或其同源物的用途。
一种这样的用途涉及改良植物的生长特性，特别是提高产率，尤其是种子产率。种子产率可以包括如下的一个或多个增加的(饱满)种子数、增加的种子重量、增加的收获指数等等。
可以在育种程序中使用RNA结合蛋白编码核酸或其变体，或者RNA结合蛋白或其同源物，其中鉴定可以遗传地连接于RNA结合蛋白编码基因或其变体的DNA标记。可以使用RNA结合蛋白编码核酸或其变体，或者RNA结合蛋白或其同源物界定分子标记。接着可以将此DNA或蛋白质标记用于育种程序中，以选择具有改变的生长特性的植物。例如，RNA结合蛋白编码基因或其变体可以是由SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQID NO5、SEQ ID NO7和SEQ ID NO9中的任意一个代表的核酸。
RNA结合蛋白编码基因/核酸的等位基因变体也可以用于标记辅助的育种程序。这样的育种程序有时需要使用，例如EMS诱变，通过植物的诱变处理引入等位基因变体；备选的，此程序可以以收集无意产生的所谓“天然”起源的等位基因变体开始。然后通过例如PCR鉴定等位基因变体。随后是选择步骤用以选择所述序列的较好等位基因变体，所述等位基因变体在植物中产生改良的生长特性。一般通过监测含有所研究序列的不同等位基因变体植物的生长行为来进行选择，例如SEQ ID NO1、SEQ IDNO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7和SEQ ID NO9中任一的不同等位基因变体。可以在温室或田地中监测生长行为。更多任选的步骤包括，将经鉴定含有较好等位基因变体的植物与另一植物杂交。例如，可使用这种方法产生目的表型特征的组合。
RNA结合蛋白编码核酸或其变体还可以作为探针，用于对其为基因一部分的基因进行遗传和物理的作图，以及作为所相连的那些基因的连锁性状标记。这些信息可以在植物育种中使用，以得到具有所希望表型的品系。RNA结合蛋白编码核酸或其变体的这类应用仅需要至少15个核苷酸长的一段核酸序列。RNA结合蛋白编码核酸或其变体也可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。可用RNA结合蛋白编码核酸或其变体探测限制酶切消化的植物基因组DNA的Southern印迹(Maniatis)。随后使用计算机程序如MapMaker(Lander等，1987)对产生的带型进行遗传分析，以构建遗传图谱。此外，可以使用核酸在含有一组个体的限制性内切酶处理的基因组DNA中探测Southern印迹，所述一组个体为代表明确的遗传杂交的亲本和子代的一组个体。DNA多态性的分离被记录并用于计算在先前用此群体获得的遗传图谱中RNA结合蛋白编码核酸或其变体的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32314-331)。
在遗传作图中使用的植物基因衍生探针的产生和用途描述于Bematzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 437-41中。很多出版物中描述过用上述方法或其变通形式对特定cDNA克隆进行遗传作图。例如，可以使用F2杂交群体、回交群体、随机交配群体、近亲同基因系和其它组个体作图。这些方法是本领域技术人员众所周知的。
核酸探针也可以用于物理作图(即在物理图谱上安置序列；见Hoheisel等，在Non-mammalian Genomic AnalysisA Practical Guide，Academicpress 1996，第319-346页，及其中引用的参考文献)。
在另一个实施方案中，核酸探针可用于直接荧光原位杂交(FISH)作图(Trask(1991)Trends Genet.7149-154)。尽管目前FISH作图的方法倾向使用大的克隆(几个到几百个KB；见Laan等(1995)Genome Res.513-20)，但是灵敏性的提高允许在FISH作图中应用较短的探针。
可以使用所述核酸进行用于遗传和物理作图的多种基于核酸扩增的方法。实例包括等位基因特异性扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med1195-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等(1993)Genomics16325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等(1988)Science2411077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.183671)、放射杂交作图(Walter等(1997)Nat.Genet.722-28)和Happy作图(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.176795-6807)。为实施这些方法，使用核酸序列设计和产生用于扩增反应或引物延伸反应的引物对。这类引物的设计是本领域内技术人员众所周知的。使用基于PCR的遗传作图的方法，可能需要鉴定跨越相应于当前核酸序列区域作图的亲本之间DNA序列的差异。然而，这对作图方法通常不是必要的。
还发现RNA结合蛋白编码核酸或其变体，或者RNA结合蛋白或其同源物作为生长调节物的用途。由于这些分子已显示在改良植物生长特性中有用，它们也是有用的生长调节物，如除草剂或生长刺激物。因此，本发明提供用作生长调节物的组合物，其包含RNA结合蛋白编码核酸/基因或其变体或者RNA结合蛋白或其同源物、以及适当的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明还涵盖rbp1核酸或其变体的用途和RBP1多肽或其同源物的用途。
一种这样的用途涉及改良植物的生长特性，特别是提高产率，尤其是种子产率。种子产率可以包括如下的一个或多个增加的(饱满)种子数、增加的种子重量、增加的收获指数等等。
可以在育种程序中使用rbp1核酸或其变体，或者RBP1多肽或其同源物，其中鉴定可以遗传地连接于rbp1基因或其变体的DNA标记。可以使用rbp1核酸或其变体，或者RBP1或其同源物限定分子标记。接着可以将此DNA或蛋白质标记用于育种程序中，以选择具有改变的生长特性的植物。例如，rbp1基因或其变体可以是由SEQ ID NO14、SEQ IDNO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ IDNO34和SEQ ID NO36中任一代表的核酸。
rbp1的等位基因变体也可以用于标记辅助的育种程序。这样的育种程序有时需要使用，例如EMS诱变，通过植物的诱变处理引入等位基因变体；备选的，此程序可以以收集无意产生的所谓“天然”起源的等位基因变体开始。然后通过例如PCR鉴定等位基因变体。随后是选择步骤用以选择所述序列的较好等位基因变体，所述等位基因变体在植物中产生改良的生长特性。一般通过监测含有所研究序列的不同等位基因变体植物的生长行为来进行选择，例如SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ IDNO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34和SEQ ID NO36中的任一的不同等位基因变体。可以在温室或田地中监测生长行为。更多任选的步骤包含，将经鉴定含有较好等位基因变体的植物与另一植物杂交。例如，可使用这种方法产生目的表型特征的组合。
rbp1核酸或其变体还可以作为探针，用于对其为基因一部分的基因进行遗传和物理的作图，以及作为所相连的那些基因的连锁性状标记。这些信息可以在植物育种中使用，以得到具有所希望表型的品系。rbp1核酸或其变体的这类应用仅需要至少15个核苷酸长的一段核酸序列。rbp1核酸或其变体也可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。可用rbp1核酸或其变体探测限制酶切消化的植物基因组DNA的Southern印迹(Maniatis)。随后使用计算机程序如MapMaker(Lander等，1987)对产生的带型进行遗传分析，以构建遗传图谱。此外，可以使用核酸在含有一组个体的限制性内切酶处理的基因组DNA中探测Southern印迹，所述一组个体为代表明确的遗传杂交的亲本和子代的一组个体。记录DNA多态性的分离并用于计算在先前用此群体获得的遗传图谱中rbp1核酸或其变体的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32314-331)。
在遗传作图中使用的植物基因衍生探针的产生和用途描述于Bematzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 437-41中。很多出版物中描述过用上述方法或其变通形式对特定cDNA克隆进行遗传作图。例如，可以使用F2杂交群体、回交群体、随机交配群体、近亲同基因系和其它个体组作图。这类方法是本领域技术人员众所周知的。
核酸探针也可以用于物理作图(即在物理图谱上安置序列；见Hoheisel等，在Non-mammalian Genomic AnalysisA Practical Guide，Academicpress 1996，第319-346页，及其中引用的参考文献)。
在另一个实施方案中，核酸探针可用于直接的荧光原位杂交(FISH)作图(Trask(1991)Trends Genet.7149-154)。尽管目前FISH作图的方法倾向使用大的克隆(几个到几百个KB；见Laan等(1995)Genome Res.513-20)，但是灵敏性的提高允许在FISH作图中应用较短的探针。
用于遗传和物理作图的多种基于核酸扩增的方法可以使用所述核酸进行。实例包括等位基因特异性扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med1195-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等(1993)Genomics16325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等(1988)Science2411077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.183671)、放射杂交作图(Walter等(1997)Nat.Genet.722-28)和Happy作图(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.176795-6807)。为实施这些方法，使用核酸序列设计和产生用于扩增反应或引物延伸反应的引物对。这类引物的设计是本领域内技术人员众所周知的。使用基于PCR的遗传作图的方法，可能需要鉴定跨越相应于当前核酸序列区域作图的亲本之间DNA序列的差异。然而，这对作图方法通常不是必要的。
还发现rbp1核酸或其变体，或者RBP1多肽或其同源物作为生长调节物的用途。由于这些分子已显示在改良植物生长特性中有用，它们也是有用的生长调节物，如除草剂或生长刺激物。因此，本发明提供用作生长调节物的组合物，其包含rbp1或其变体或者RBP1多肽或其同源物、以及适当的载体、稀释剂或赋形剂。
根据本发明的方法得到如前所述具有改良生长特性的植物。这些有利的生长特性还可以组合其它经济上有利的性状，如进一步提高产量的性状、对多种胁迫的耐受性、改变各种构造特征和/或生化和/或生理学特征的性状。
附图描述。
现将参考下列附图描述本发明，其中
图1显示植物RNA结合蛋白的CLUSTAL多重比对。基序I和II被加框(BAC83046缺少M2)，且RRM结构域加下划线。
图2显示双元载体，其用于在稻中表达谷醇溶蛋白启动子控制下的烟草RNA结合蛋白。
图3显示植物RBP1多肽的多重比对。显示了基因库蛋白质或其编码核酸。At指拟南芥，Os指稻。
图4显示双元载体，其用于在稻中表达β扩展蛋白启动子(内参PRO0061)控制下的拟南芥RBP1(内参CDS0078)。
图5显示由β扩展蛋白启动子驱动的GUS表达照片。“C植物”照片是当稻植物长至约5cm大小时的GUS染色照片。“B植物”照片是当稻植物长至约10cm大小时的GUS染色照片。也可使用具有相似表达谱的启动子用于本发明的方法。
图6详述了实施根据本发明的方法中有用序列的实例。自SEQ ID NO14开始，给出的At号指MIP登录号(http://mips.gsf.de/)；其它标识符指基因库登录号。大写字母代表编码序列，小写字母指非翻译区(包括5’前导序列、3’非翻译区和内含子)。基因的染色体位置以重叠群号和重叠群中ORF的坐标表示。
实施例现将参考下列实施例描述本发明，所述实施例仅意在说明。
DNA操作除非另外说明，重组DNA技术根据描述于(Sambrook等(2001)分子克隆实验室手册，第三版，冷泉港实验室出版，CSH，纽约)或者描述于Ausubel等(1994)，Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols的第一卷和第二卷)的标准方法执行。植物分子操作的标准材料和方法由R.D.D.Croy描述于Plant Molecular Biology Labfase(1993)，由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell ScientificPublications(UK)出版。
实施例1基因克隆-烟草RNA结合蛋白编码基因编码RNA结合蛋白的基因最初作为表达序列标签从烟草BY2细胞中鉴定并且在CDNA-AFLP实验中作为部分序列分离，所述CDNA-AFLP实验使用从同步化的烟草BY2细胞培养物(Nicotiana tabacum L.cv.BrightYellow-2)制备的cDNA执行。基于此CDNA-AFLP实验，鉴定细胞周期调节的BY2标签并选择用于进一步的克隆。使用表达的序列标签筛选烟草cDNA文库和分离全序列cDNA。
BY2细胞的同步化如下通过使用蚜栖菌素将细胞阻滞在早S期同步化烟草BY2(Nicotiana tabacum L.cv.Bright Yellow-2)培养细胞悬浮液。如所述维持烟草Bright Yellow-2的培养细胞悬浮液(Nagata等Int.Rev.Cytol.132，1-30，1992)。将7天龄的静置培养物使用新鲜培养基10倍稀释用于同步化，所述新鲜培养基添加了蚜栖菌素(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO；5mg/l)，一种DNA聚合酶α抑制药物。24小时之后，用新鲜培养基洗涤细胞数次使细胞解除阻滞并重新进入细胞周期进程。
RNA提取和cDNA合成使用LiCl沉淀制备总RNA(Sambrook等，2001)并且使用Oligotex柱(Qiagen，Hilden，Germany)根据生产商说明从500μg的总RNA中提取poly(A+)RNA。使用生物素化的oligo-dT25引物(Genset，Paris，France)和Superscript II(Life Technologies，Gaithersburg，MD)通过反转录从1μg的poly(A+)RNA开始合成第一链cDNA。使用大肠杆菌(Escherichia coli)连接酶(Life Technologies)、DNA聚合酶I(USB，Cleveland，OH)和RNA酶H(USB)通过链替换进行第二链的合成。
cDNA-AFLP分析500ng的双链cDNA如所述进行AFLP分析(Vos等，Nucleic Acids Res.23(21)4407-4414，1995；Bachem等，Plant J.9(5)745-53，1996)并有修改。使用的限制酶是BstYI和MseI(Biolabs)并且在两个分别的步骤中进行消化。在使用所述酶之一进行第一次限制性消化之后，3’端片段通过其生物素化的尾被收集在Dyna珠子(Dynal，Oslo，Norway)上，而其它片段被洗去。使用第二个酶消化之后，收集释放的限制片段并将其在后续AFLP步骤中用作模板。没有选择性核苷酸的MseI引物与在3’最末端含有T或C的BstYI引物组合用于预扩增。PCR条件如所述(Vos等，1995)。将获得的扩增混合物稀释600倍，取5μl用于使用P33-标记的BstYI引物和Amplitaq-Gold多聚酶(Roche Diagnostics，Brussels，Belgium)的选择性扩增。在5％聚丙稀酰胺凝胶中使用Sequigel的系统(Biorad)分离扩增产物。干燥的凝胶在Kodak Biomax胶片上暴光并在phosphoImager(Amersham Pharmacia Biotech，Little Chalfont，UK)进行扫描。
AFLP片段的表征将对应于差异表达转录物(其中含有相应于SEQ ID NO 1的转录物)的条带从凝胶中分离，并在与选择性扩增相同的条件下将洗脱的DNA用于重新扩增。通过对使用选择性BstYI引物重新扩增的聚合酶链式反应产物直接测序或在pGEM-T easy(Promega，Madison，WI)中克隆片段之后直接测序，或通过测序个体克隆获得序列信息。通过BLAST序列比对(Altschul等，Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402 1997)比较获得的序列与可公开获得的数据库中存在的核苷酸和蛋白质序列。在可行时，使用较长的EST或分离的cDNA序列替代标签序列以增加找到显著同源性的几率。接着按照以下步骤从商业烟草cDNA文库扩增相应于SEQ ID NO 1的物理cDNA克隆。
基因克隆使用poly(A+)从活跃分裂的未同步化的BY2烟草细胞中分离平均插入物为1400bp的cDNA文库。将这些文库插入物克隆在含有attB gateway盒的载体pCMVSPORT6.0(Life Technologies)中。从此文库中选择46000个克隆列于384孔微量滴定板中，并接着一式两份地点在尼龙滤器上。通过使用几百种放射性标记的标签库作为探针(其中含有相应于SEQ ID NO1的BY2标签)筛选排列的克隆。分离阳性克隆(其中含有与相应于SEQ IDNO 1的BY2标签反应的克隆)，对其测序并与标签序列进行比对。如果使用标签杂交失败，通过如下的PCR扩增选择相应于标签的全长cDNA。使用primer3程序(http://www-genome.wi.mit.edu/genome_software/other/primer3.html)设计标签特异性引物并与通用载体引物组合用于扩增部分的cDNA插入物。在PCR扩增中使用来自50000、100000、150000和300000个cDNA克隆的DNA库作为模板。从琼脂糖凝胶分离扩增产物，对其克隆、测序并与标签比对。
接着，将来自pCMVsport6.0文库载体的相应于SEQ ID NO 1的全长cDNA经由LR Gateway反应克隆在合适的植物表达载体中。
LR gateway反应将CDS0701克隆在植物表达载体中接着将pCMV Sport 6.0p2461用于与适于稻转化的Gateway指定载体的LR反应。这一载体在T-DNA边界之内含有作为功能元件的植物选择标记和Gateway盒，所述Gateway盒用于与已经克隆于供体载体的目的序列进行LR体内重组。这一Gateway盒的上游为稻谷醇溶蛋白启动子，其用于基因的种子特异性表达。
重组步骤之后，将产生的表达载体(见图2)转化进入农杆菌菌株LBA4404并接着转化进入稻植物。
实施例2稻转化将日本栽培稻Nipponbare(NB)的成熟干种子脱壳。通过在70％乙醇中孵育一分钟，接着在0.2％HgCl2中30分钟，继之用蒸馏水洗6次，每次15分钟进行消毒。接着将无菌的种子在含有2，4-D(愈伤组织诱导培养基)的培养基上萌发。在黑暗中孵育四周之后，切下胚胎发生的盾片衍生的愈伤组织并在相同的培养基中增殖。两周之后，通过在相同培养基中继代培养另外2周增殖或者说繁殖愈伤组织。在共培养之前3天，在新鲜培养基上传代培养胚胎发生愈伤组织片段(为了促进细胞分裂活性)。将含有双元T-DNA载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培养。农杆菌接种于含有合适的抗生素的AB培养基中并在28℃培养3天。接着收集细菌并悬浮在液体共培养培养基中至约1的光密度(OD600)。接着将悬浮液转移至培养皿并将愈伤组织浸于悬浮液15分钟。随后将愈伤组织在滤纸上沾干并转移至固体共培养基并在黑暗中于25℃孵育3天。在合适浓度的选择物质的存在下，共培养的愈伤组织在含有2，4-D的培养基中于28℃黑暗生长四周。在此期间，发育出快速生长的抗性愈伤组织岛(resistant callus islands)。将该物质转移至再生培养基之后在光照下孵育，显示出胚胎发生潜力并在接下来的四至五周发育出芽。将芽从愈伤组织切下并在含有生长素的培养基孵育2到3周，将其从该培养基转移至土壤。变硬的芽在高湿度和短白昼条件下在温室中生长。接着在移植三至五个月之后收获种子。该方法以超过50的比率提供单个基因座的转化体(Aldemita和Hodges，Planta，199612-617，1996；Chan等，Plant Mol.Biol.22(3)491-506，1993，Hiei等，PlantJ.，6(2)271-282，1994)。
实施例3评估和结果大约产生了15到20个独立的T0稻转化株。原代转化株由组织培养室转移到温室生长并收获T1种子。5个事件得以保留，其中T1后代发生转基因存在/缺乏的3∶1分离。通过监测可视标记的表达，在每一事件中选出大约10个含有转基因(杂合子和纯合子)的T1幼苗，和相同数目的大约10个缺少转基因(无效合子)的T1幼苗。4个T1事件在T2代按照与T1代相同的评估方法被进一步评估，但是所述被进一步评估的每个事件具有更多的个体。
统计分析F-检验使用双因子ANOVA(变异分析)作为植物表型特性整体评估的统计模型。在由本发明基因转化的所有事件的所有植物中，对所有测量参数进行F检验。进行F检验来检查所有转化事件中基因的有效性，并验证对基因的整体效应，亦称为整体基因效应。将真实的整体基因效应显著性的阈值设定为F检验的5％概率水平。显著性F检验值指基因效应，其意味着不仅是基因的存在或位置引起表型的差异。
3.1种子相关参数的测量成熟的原代圆锥花序被收获、包装、标记条形码，然后在37℃烘箱中干燥三天。然后敲打圆锥花序并对所有种子收集和计数。用吹风装置将饱满的壳与空壳分离。丢弃空壳，并再次计数剩余的部分。饱满的壳在分析天平上称重。在分离步骤之后剩余的饱满壳数确定为饱满种子数。通过称量从植物收获的全部饱满的壳测量总的种子产率。本发明中的收获指数定义为总种子产率与地上面积(mm2)的比值乘以因子106。
以下的结果表显示对T1和T2评估的F检验的p值。还显示转基因与相应无效合子之间百分数的差异。例如，对于T1代中的总种子重量，4个品系中的3个为总种子重量阳性(即与相应无效合子植物的种子重量相比，显示为总种子重量增加(大于32％))。这样的4个品系中的2个品系显示总种子重量显著增加，F检验中的p值为0.061。
表5T1代的结果

表6T2代的结果


实施例4AtRBP1的基因克隆使用拟南芥幼苗cDNA文库(Invitrogen，Paisley，UK)作为模板通过PCR扩增拟南芥AtRBP1(CDS0078)。从幼苗提取的RNA反转录之后，将cDNA克隆入pCMV Sport 6.0。文库的平均插入物大小为1.5kb，且原始克隆数为1.59×107cfu。原始滴度被确定为9.6×105cfu/ml，在第一次扩增之后为6×1011cfu/ml。质粒提取之后，将200ng模板用于50μl PCR混合物中。包含用于Gateway重组的AttB位点的引物prm00405(正义5’ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcacaatggattatgatcggtacaagttat 3’)和prm00406(反向互补5’ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttaaaagagtccaaagaatttcact 3’)被用于PCR扩增。在标准条件下使用Hifi Taq DNA聚合酶执行PCR。1209bp的PCR片段被扩增并也使用标准方法纯化。接着进行Gateway操作的第一步，BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒体内重组产生根据Gateway术语的“进入克隆”p0073。质粒pDONR201作为Gateway技术的部分购自Invitrogen。
实施例5AtRBP1载体构建接着将进入克隆p0073用于与p03069(用于稻转化的指定载体)的LR反应中。这一载体在T-DNA边界之内作为功能元件含有植物选择标记；可视标记表达盒和Gateway盒，所述Gateway盒用于与已经克隆于“进入克隆”的目的序列进行LR体内重组。在芽中表达的β扩展蛋白启动子位于这一Gateway盒的上游。
LR重组步骤之后，将产生的表达载体(图2)转化进入农杆菌菌株LBA4404并接着转化进入稻植物。使转化的稻植物生长并接着检查在实施例6中所述的参数。
实施例6AtRBP1的评估和结果大约产生了15到20个独立的T0稻转化株。原代转化株由组织培养室转移到温室生长并收获T1种子。5个事件得以保留，其中T1后代发生转基因存在/缺乏的3∶1分离。通过监测可视标记的表达，在每一事件中选出大约10个含有转基因(杂合子和纯合子)的T1幼苗，和相同数目的大约10个缺少转基因(无效合子)的T1幼苗。4个T1事件在T2代按照与T1代相同的评估方法被进一步评估，但是所述被进一步评估的每个事件具有更多的个体。在第一轮为中性的一个品系不再继续。在T2评估中，比较含有转基因的15个T2幼苗与相同数目的缺少转基因的植物(无效合子)。
统计分析F-检验使用双因子ANOVA(变异分析)作为植物表型特性整体评估的统计模型。在由本发明基因转化的所有事件的所有植物中，对所有测量参数进行F检验。进行F检验来检查所有转化事件中基因的有效性，并验证基因的整体效果，亦称为整体基因效应。将真实的整体基因效应显著性的阈值设定为F检验的5％概率水平。显著性F检验值指基因效应，其意味着不仅是基因的存在或位置引起表型的差异。
6.1种子相关参数的测量成熟的原代圆锥花序被收获、包装、标记条形码，然后在37℃烘箱中干燥三天。然后敲打圆锥花序并对所有种子收集和计数。用吹风装置将饱满的壳与空壳分离。丢弃空壳，并再次计数剩余的部分。饱满的壳在分析天平上称重。这一操作产生以下描述的种子相关参数组。
以下结果表显示来自对T1评估、T2评估的F检验的p值以及来自对T1和T2评估的F检验的组合p值。组合分析可以认为是对同一事件进行两个实验。这可以用于检测两个实验效果的一致性并增加结论的可信度。使用的方法为混合模式方法，其考虑多水平的数据结构(即实验-事件-分离子)。通过比较卡方分布的概率检测获得P值。每个表还给出每代转基因以及相应的无效合子之间的％差异。
6.1.1地上面积通过计算排除背景后地上植物部分的像素总数确定植物地上面积。该值是在同一时间点从不同角度获得图片的平均值，并通过校准将其转换为用平方毫米表示的物理表面值。实验显示这种方法测量的地上部分植物面积与植物地上部分的生物量有关。T1和T2评估的结果显示于下表7中。如下表所示，来自对T2评估的F检验的p值(p值为0.0011)和组合的数据(具有p值为0.0287)是显著性的，其说明在植物中存在的构建体对转基因植物的地上面积具有显著阳性影响。
表7地上面积

6.1.2每株植物总种子产量通过称重从植物收获的全部饱满的壳测量总种子产量。如下表8所示，来自对T1和T2组合评估的F检验的p值是显著性的(p值为0.0287)，其说明在植物中构建体的存在对转基因植物的总种子重量具有显著性影响。
表8


6.1.3种子总数如下表9所示，来自对T1和T2组合(以及T2单独)评估的F检验的p值是显著性的(p值为0.0006)，其说明在植物中构建体的存在对转基因植物的种子总数具有显著性影响。
表9

实施例7由β扩展蛋白启动子驱动的GUS表达使用“BP重组反应”将β扩展蛋白启动子克隆于GatewayTM系统的pDONR201进入质粒(Life Technologies)。通过测序确定克隆的插入物的同一性和碱基对组成，并另外地经由限制性消化检测产生的质粒。
为了将启动子克隆在报告基因之前，接着将每一进入克隆与指定载体用于“LR重组反应”(GatewayTM)。设计将这一指定载体有效连接于大肠杆菌β葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因，所述连接经由在GUS基因之前的Gateway重组盒的取代进行。接着使用标准转化技术将产生的报告载体(包含有效连接于GUS的启动子)转化进入农杆菌菌株LBA4044并继之转化进入稻植物。
从转化的细胞产生转基因稻植物。植物生长在正常条件下进行。
使用90％冰冷丙酮覆盖待测试的植物或植物部分，在4℃孵育30分钟。使用Tris缓冲液[15.76g Trizma HCl(Sigma T3253)+2.922g NaCl于1升双蒸水中，使用NaOH调节至pH7.0]洗3次，每次5分钟之后，将该材料用Tris/铁氰酸盐/X-Gluc溶液[9.8ml Tris缓冲液+0.2ml铁氰酸盐母液(0.33g铁氰酸钾(Sigma P3667)于10ml Tris缓冲液中)+0.2ml X-Gluc母液(26.1mg X-Gluc(Europa Bioproducts ML 113A)于500μl DMSO中)]覆盖。真空过滤15至30分钟。在37℃孵育植物或植物部分长达16小时直至蓝色显影可见。用Tris缓冲液洗涤样品3次5分钟。以50％、70％和90％的乙醇系列提取叶绿素(各30分钟)。
序列表<110>克罗普迪塞恩股份有限公司<120>具有改良生长特性的植物及其制备方法<130>CD-120-PCT<150>EP 04103926.4<151>2004-08-16<150>US 60/602,680<151>2004-08-19<160>40<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>2098<212>DNA<213>烟草(Nicotiana tabacum)<400>1ccacgcgtcc gcttagggtt ccaaattgct ctaaattccc gcggattgag agttcattgg 60agacttccat tgttcccagc ggctaagatg agccggttga ttgagcatca cctagcaaat 120aataaacagg acatgaaagg gacagaggtt tttgttggtg gtttggcccg tactactact 180gaaagcaaaa ttcatgaggt attttcttca tgtggtgaga ttgtggaaat acggttgata 240aaagaccaga caggcgttcc taaggggttt tgctttgtac gatttgcaac aaaatatgct 300gctgacaaag ctctgaagga aaaatctgga tatgtgctgg atgggaagaa actcggggtt 360cgcccctcag ttgagcagga cactttattt cttggaaatc ttaacaaagg ttggggtgcg 420gaggaatttg agagtattgt gcgccaggtt tttccagatg ttgtatctgt tgatcttgca 480cttcttggag atgtccaacc tggtcagaag caacggaatc ggggttttgc tttcgtgaaa 540ttcccatctc atgctgctgc ggctcgtgct tttcgggtag gctcccaatc tgattttctc 600attgatggca agttacatcc atctgtacag tgggctgagg aacctgatcc caatgaactt 660gctcagatca aagcagcctt cgttagaaat gtacctcctg gtgctgatga agattacttg 720aagaagctct ttcagccctt tggcaatgta gagaggatag ctctatccag gaaaggtagc 780tccaccattg gattcgttta cttcgataag cgatctgatc ttgacaatgc tattatggcg 840ttgaatgaga aaactgtaca agggccaatg ggaggtccct catgcaagct tcaggtcgaa 900gttgctaggc caatggacaa gaacaggaaa cgaggtcgtg aggatccaaa catgtccagt 960accattgaga gtcattccaa gcttttgaag gatgatccag atgttgagat gattagggct1020cctaaatcaa ctgctcaact ggagatggat tattcggatc cttatgaagc tgctgtagtt1080gcattacctg tggttgtcaa ggagcgttta gttcggatct tgcggcttgg tattgctact1140agatatgata tagatgttga aagtttaacc agtcttaaga tattgcccca gtcagctgcc1200atatctattc ttgaccagtt catgttgtct ggagctgata tgcagaacaa gggaggatat1260ctagcttcat taatttctaa gcaggttgaa aaactgggac cgaaacaatt cgatagtagg1320tcaaggatag aagatgttgg cttgagggtg ccagaaccag acaggttctc tacaagagtt1380cgtttgccag atctagattc atatgcctca cgagtaccct tgcccatgcc taggactgat1440gtttacacat ctcactattc agcgtattta gatccccatc tgtctggtcg gatgacagca1500aagaggatgg aggaagcaag ttcccatttg caggcgactt cacttctgtc tagtcgggtg1560gcaacgagga tggaggaggc aggttccact ttgcagtcgc tcctatctgg tggggtgacg1620
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<221>misc_feature<222>(446)..(446)<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸<400>6Gly Ser Arg Thr Asp Phe Met Leu Gly Asp Ile Leu His Pro Ala Ile1 5 10 15Asn Trp Ala Asp Lys Glu Ser His Leu Asp Pro Asp Glu Met Ala Lys20 25 30Met Lys Ser Ala Phe Ile Gly Asn Leu Pro Glu Asp Val Asn Glu Glu35 40 45Tyr Leu Arg Lys Leu Phe Gly Gln Phe Gly Glu Val Val Arg Val Ala50 55 60Ile Ser Arg Lys Gly Gln Cys Pro Val Ala Phe Val His Phe Ala Lys65 70 75 80Arg Ser Glu Leu Glu Asn Ala Ile Glu Glu Met Asp Gly Lys Thr Val85 90 95Arg Gly Pro Gly Arg Gly Pro Ser Phe Lys Ile Gln Val Ser Val Ala100 105 110Arg Pro Thr Ala Asp Asn Asp Lys Lys Arg Ser Arg Glu Glu Val Arg115 120 125Thr Arg Arg Ser Asn Ala Ser Gly Asp Arg Arg Asp Tyr Ser His Gly130 135 140Arg Tyr Gly His Asp Ser Leu Asp Arg Gln Val Lys Ala Pro Arg Leu145 150 155 160Ser Asn Tyr Val Ala Asp Ala Ala Asp Pro Tyr Glu Ser Ala Val Asn165 170 175
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<210>7<211>1599<212>DNA<213>稻<400>7atcgatcaca ggctgcagca cgcgtacttc gtattggttc cagaacagat tttctgcttg 60gtggattgca tccttcaata aattgggctg agaaggagtc tcatgtagat gaggacgaaa120tggccaaggt taagacagct ttcgttggaa atttaccagc aaatgttaca gaggagtatt180taagaaagct ttttgaacat tgtggagagg tagtacgggt tgcagtctca aggaaaggac240aatatccagt tggatttgtc cactttgcca gtcgtacaga gctcgacaat gcaataaaag300aaatggatgg tgaaacagtg agaggacctg accgaggggc aactttcagg atccaggtct360cagttgctcg gcctgtggta gagaacgata aaaagagaat tcgtgaagaa gtgaaaacta420gaagatcaaa cgtatcaaca gacaagccgg accattctta tggaagacgt ggacatgatt480catatgatcg tcaagcaaaa gctccaaggc tatataatga ggtgtctgat acggacccct540atgaagcagc tgttgtttca ctaccttcag ccgtcaagga actcctactt cgtattctac600gtcttagaat tggcactcga tatgatatag acattcattg cataaggagt cttaatgaac660ttcctgaaaa ggctgcagtt gctgtcctta atcagttttt gatatcaggt gcagataaac720acaataaagg agactatttc gcttcattaa ttgctaagta ccaggctgag acatttagct780cagcactaag attgcagggt tctacttatt tgccaagaaa tcctggaata cagaacaaga840gattcccaca tcaagattac gagtacacag catccgggag tagtagatac agttccttag900gtgattatcc ttcctcatct tatgtggatg atcccgcatc atctcagtca aggaatagaa960ggtatgatga atacagacct gatcttgtaa gatatccaga ttcaagatca cggcaagagg 1020aaatagtccg cattgaaaga tatccagaac caagatttgc acatgaacca agacaggata 1080ctggaaggca tctcgatcta gggtacgtac aagaacggaa ttcgaatatt gagagatcag 1140ctcaagtagc tttttcatct agggaaggag gatacttatc tgcttcaagg tacaacacaa 1200acatagtccc agaattcagc tccaggtcat ctgctgaata ctctactgct cgccaacaag 1260taaggtttga tccattcaca ggggaaccat acaagtttga tccctacacc ggtgaaccca 1320tcaggccaga atcgaaccca cgtcgctcag gaagcttata ctgactttga ttgattgaag 1380caacagtttg gatatggtag attagattta catccctgaa ccaaaaggac catatactgc 1440tcttgcatgt tgtaaaccta gtgtatttga tgtgcctcag cattgtaatg ttagaaatcc 1500attttcatcc atgtcactgg aaaactatgg ttgaaacaac agtaataagt tctatcattt 1560atgatggcat ctgatgatat gaattaggga aaactaagc 1599<210>8<211>414<212>PRT<213>稻<400>8Met Ala Lys Val Lys Thr Ala Phe Val Gly Asn Leu Pro Ala Asn Val1 5 10 15Thr Glu Glu Tyr Leu Arg Lys Leu Phe Glu His Cys Gly Glu Val Val20 25 30Arg Val Ala Val Ser Arg Lys Gly Gln Tyr Pro Val Gly Phe Val His35 40 45
Phe Ala Ser Arg Thr Glu Leu Asp Asn Ala Ile Lys Glu Met Asp Gly50 55 60Glu Thr Val Arg Gly Pro Asp Arg Gly Ala Thr Phe Arg Ile Gln Val65 70 75 80Ser Val Ala Arg Pro Val Val Glu Asn Asp Lys Lys Arg Ile Arg Glu85 90 95Glu Val Lys Thr Arg Arg Ser Asn Val Ser Thr Asp Lys Pro Asp His100 105 110Ser Tyr Gly Arg Arg Gly His Asp Ser Tyr Asp Arg Gln Ala Lys Ala115 120 125Pro Arg Leu Tyr Asn Glu Val Ser Asp Thr Asp Pro Tyr Glu Ala Ala130 135 140Val Val Ser Leu Pro Ser Ala Val Lys Glu Leu Leu Leu Arg Ile Leu145 150 155 160Arg Leu Arg Ile Gly Thr Arg Tyr Asp Ile Asp Ile His Cys Ile Arg165 170 175Ser Leu Asn Glu Leu Pro Glu Lys Ala Ala Val Ala Val Leu Asn Gln180 185 190Phe Leu Ile Ser Gly Ala Asp Lys His Asn Lys Gly Asp Tyr Phe Ala195 200 205Ser Leu Ile Ala Lys Tyr Gln Ala Glu Thr Phe Ser Ser Ala Leu Arg210 215 220Leu Gln Gly Ser Thr Tyr Leu Pro Arg Asn Pro Gly Ile Gln Asn Lys225 230 235 240Arg Phe Pro His Gln Asp Tyr Glu Tyr Thr Ala Ser Gly Ser Ser Arg245 250 255Tyr Ser Ser Leu Gly Asp Tyr Pro Ser Ser Ser Tyr Val Asp Asp Pro260 265 270Ala Ser Ser Gln Ser Arg Asn Arg Arg Tyr Asp Glu Tyr Arg Pro Asp275 280 285Leu Val Arg Tyr Pro Asp Ser Arg Ser Arg Gln Glu Glu Ile Val Arg290 295 300Ile Glu Arg Tyr Pro Glu Pro Arg Phe Ala His Glu Pro Arg Gln Asp305 310 315 320
Thr Gly Arg His Leu Asp Leu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Asn Ser Asn325 330 335Ile Glu Arg Ser Ala Gln Val Ala Phe Ser Ser Arg Glu Gly Gly Tyr340 345 350Leu Ser Ala Ser Arg Tyr Asn Thr Asn Ile Val Pro Glu Phe Ser Ser355 360 365Arg Ser Ser Ala Glu Tyr Ser Thr Ala Arg Gln Gln Val Arg Phe Asp370 375 380Pro Phe Thr Gly Glu Pro Tyr Lys Phe Asp Pro Tyr Thr Gly Glu Pro385 390 395 400Ile Arg Pro Glu Ser Asn Pro Arg Arg Ser Gly Ser Leu Tyr405 410<210>9<211>1842<212>DNA<213>稻<400>9atggaaccga cgcgccgttg cgtccccggc catctcgcca ccgccgccgc cgccgccgcc 60gcctcgccgt tctccccgcc gccgtcgctg ccgctgccgt ccgcgctcat gccccccaag120aagcgccgcc tcttcacgcc cgcccctcgc cacgccgcca ccccgccacc accaccacct180ccccccaccc ccgccgtcga gcccacccta ccaatccccc ccgcctcgac accgccgacg240ccgcctcagc cctccgcctc cacggagccc tcgacggcgc cgcctcccgc tgtcgacgac300gcggcggcga ggtcgtcgtc gtcgtcgtcg ccggcgtcgg cggcggcggc gcggaaggtt360cggaaagtgg ttaagaaggt catcgtcaag aaggtcgtcc ccaagggcac gttcgccgct420cggaaggccg cggcggcggc ggttgctgct gctgcggcgg tctccggagc agcagcatca480tcggaggcag ggggagaagc cccaaccgac gagccagcaa gtgatcagga cggcggagtt540gggaatgagc aaaaattgga tgaatccaaa cctgccacgg attgcaatgc cgttgcggtg600gtggaagaat cggtgtgtaa ggaggaggag gaggtggcct tagtggtggg taagggagtg660gaggaggagg aggcggggat gtcggagcgg cggaagagga tgaccatgga ggtgtttgtt720ggtgggcttc accgggacgc caaggaggat gatgtgaggg cggtgttcgc caaggccggg780gaaatcaccg aggtccggat gataatgaat cctcttgcag ggaagaacaa ggggtactgc840ttcgtgcgct accgccacgc cgcgcaggcg aagaaggcca tcgcggaatt cggcaatgtg900aagatttgtg ggaagctctg tcgagctgca gttccagttg ggaatgacag aatttttctt960ggaaacatca acaagaaatg gaaaaaagaa gatgtcatca agcagctaaa gaaaattgga 1020attgagaaca ttgattctgt aacacttaag tctgattcaa ataatccagt ctgtaatcgt 1080ggttttgcat ttcttgaact ggaaactagt agagatgcac ggatggcata caaaaagctt 1140tcacagaaaa atgcttttgg caaaggcctg aatataagag ttgcatgggc tgaaccattg 1200aatgatccag atgagaaaga tatgcaggtt aaatcgattt ttgtggatgg gataccaacg 1260tcctgggatc atgctcagct aaaagaaatc ttcaagaaac atgggaagat tgaaagtgtg 1320gttctgtcac gcgatatgcc gtcagctaaa aggagggact ttgcctttat taattacatt 1380actcgtgagg ctgcaatctc gtgtcttgaa tcttttgaca aggaagagtt cagtaagaac 1440ggctcaaagg tgaatattaa agtttcattg gctaaacctg cccaacagag caagcagacc 1500aaggaagacc ataaatctag tattactggg gaaggcaaaa tgaagacttc taaaataaga 1560
taccctgttc aagattatac ccacatttat tctggagaga agcgtccctt ttcaacactg1620ggtgatcctt attatccatt gagaggtcat tcttgtcgtc gtcatgaggg tagcacctat1680actacagcag catcaagcta tggtgcgctg ccccctgcta ctgctgaatc ttctctgcca1740cattatcatg acagcaatag atatcctcca cacctaggtg aggcaatcaa gttctcgcca1800accagcgcag tcctatcgaa gcaggcatgg caaaaaatgt aa 1842<210>10<211>613<212>PRT<213>稻<400>10Met Glu Pro Thr Arg Arg Cys Val Pro Gly His Leu Ala Thr Ala Ala1 5 10 15Ala Ala Ala Ala Ala Ser Pro Phe Ser Pro Pro Pro Ser Leu Pro Leu20 25 30Pro Ser Ala Leu Met Pro Pro Lys Lys Arg Arg Leu Phe Thr Pro Ala35 40 45Pro Arg His Ala Ala Thr Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Thr Pro50 55 60Ala Val Glu Pro Thr Leu Pro Ile Pro Pro Ala Ser Thr Pro Pro Thr65 70 75 80Pro Pro Gln Pro Ser Ala Ser Thr Glu Pro Ser Thr Ala Pro Pro Pro85 90 95Ala Val Asp Asp Ala Ala Ala Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Pro Ala100 105 110Ser Ala Ala Ala Ala Arg Lys Val Arg Lys Val Val Lys Lys Val Ile115 120 125Val Lys Lys Val Val Pro Lys Gly Thr Phe Ala Ala Arg Lys Ala Ala130 135 140Ala Ala Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Gly Ala Ala Ala Ser145 150 155 160Ser Glu Ala Gly Gly Glu Ala Pro Thr Asp Glu Pro Ala Ser Asp Gln165 170 175Asp Gly Gly Val Gly Asn Glu Gln Lys Leu Asp Glu Ser Lys Pro Ala180 185 190Thr Asp Cys Asn Ala Val Ala Val Val Glu Glu Ser Val Cys Lys Glu195 200 205
Glu Glu Glu Val Ala Leu Val Val Gly Lys Gly Val Glu Glu Glu Glu210 215 220Ala Gly Met Ser Glu Arg Arg Lys Arg Met Thr Met Glu Val Phe Val225 230 235 240Gly Gly Leu His Arg Asp Ala Lys Glu Asp Asp Val Arg Ala Val Phe245 250 255Ala Lys Ala Gly Glu Ile Thr Glu Val Arg Met Ile Met Asn Pro Leu260 265 270Ala Gly Lys Asn Lys Gly Tyr Cys Phe Val Arg Tyr Arg His Ala Ala275 280 285Gln Ala Lys Lys Ala Ile Ala Glu Phe Gly Asn Val Lys Ile Cys Gly290 295 300Lys Leu Cys Arg Ala Ala Val Pro Val Gly Asn Asp Arg Ile Phe Leu305 310 315 320Gly Asn Ile Asn Lys Lys Trp Lys Lys Glu Asp Val Ile Lys Gln Leu325 330 335Lys Lys Ile Gly Ile Glu Asn Ile Asp Ser Val Thr Leu Lys Ser Asp340 345 350Ser Asn Asn Pro Val Cys Asn Arg Gly Phe Ala Phe Leu Glu Leu Glu355 360 365Thr Ser Arg Asp Ala Arg Met Ala Tyr Lys Lys Leu Ser Gln Lys Asn370 375 380Ala Phe Gly Lys Gly Leu Asn Ile Arg Val Ala Trp Ala Glu Pro Leu385 390 395 400Asn Asp Pro Asp Glu Lys Asp Met Gln Val Lys Ser Ile Phe Val Asp405 410 415Gly Ile Pro Thr Ser Trp Asp His Ala Gln Leu Lys Glu Ile Phe Lys420 425 430Lys His Gly Lys Ile Glu Ser Val Val Leu Ser Arg Asp Met Pro Ser435 440 445Ala Lys Arg Arg Asp Phe Ala Phe Ile Asn Tyr Ile Thr Arg Glu Ala450 455 460Ala Ile Ser Cys Leu Glu Ser Phe Asp Lys Glu Glu Phe Ser Lys Asn465 470 475 480
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<213>人工序列<220>
<223>基序I-共有序列<400>12Pro Tyr Glu Ala Ala Val Val Ala Leu Pro Val Val Val Lys Glu Arg1 5 10 15Leu Val Arg Ile Leu Arg Leu Gly Ile Ala Thr Arg Tyr Asp20 25 30<210>13<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>基序II-共有序列<400>13Arg Phe Asp Pro Phe Thr Gly Glu Pro Tyr Lys Phe Asp Pro1 5 10<210>14<211>2166<212>DNA<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>14aagatttggg cttacaatct ttatcacaaa ggctttttta aagcccatta gttacattca 60tcattatctc tcgacattaa aaaaaaaaag ttaaactgaa gaagctaaaa agagttttta120acttttaact ctcttcgtct tctccctcgt gccgtgtcaa atcaatctac tgttctctct180cctatctggt aaacttttcc tcttcgccat gaaatttttt tcttgctagg gttttagttt240ctacagttcg cttcccaaaa attaggggtt ttgtcacaat ttctcaattt cttgttccat300ttttcttctt ttctccataa tcattgctta atttagaatc ccaaatttta caaattaggg360tttttgttta attttagggg tttttgattt tcaactgtta atagtgttct cgatgtcata420attctgattt tttttattat ctattccgaa attagggcaa aaatctcaga caaacctgca480aaattagggt atttgaggat atggattatg atcggtacaa gttatttgtt ggtggtattg540cgaaagagac aagtgaagaa gctctgaagc agtattttag cagatatgga gctgtgttgg600aagctgttgt agctaaagag aaagtcactg gaaaacctag aggttttggg tttgttcgct660ttgctaatga ttgtgatgtt gttaaagctc ttagagacac tcacttcatt ctcggtaaac720ccgtaagtgt taccgccttt ttatgcttgt gtcaattggg ttttgtgtat actctgtgga780ttgattatgt gtgtgtttgt attaggttga tgtgagaaag gcgattagga aacatgaact840ataccaacag ccgtttagca tgcagttttt ggagagaaaa gtgcaacaga tgaatggtgg900tttgcgtgag atgtcgagta atggtgtgac cagtaggact aagaagatat ttgttggggg960tttgtcgtct aacacgactg aggaagagtt taagagttac tttgagaggt ttggtaggac 1020tactgatgta gttgtgatgc atgacggtgt gactaacagg ccaaggggtt ttgggtttgt 1080tacttatgat tcggaggact ctgttgaggt tgttatgcag agtaatttcc atgagttgag 1140
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Arg Ser Gly Ser Ser Glu Leu Asp Gly Thr Ser Pro Phe Gly Tyr Gly435 440 445Leu Gly Asn Ala Ala Ser Asp Val Thr Ala Lys Asn Ser Ala Gly Tyr450 455 460Met Gly His465<210>34<211>1146<212>DNA<213>普通小麦(Triticum aestivum)<400>34aaaaagcagg tgggaccggc ccggaattct cgggatatcg tcgacccacg cgtccgcgca 60cccgagcgcg agagaatccg aggagaggag cggcgcaagg aggcggtgat ggagtcggat120cagggcaagc tcttcatcgg cggcatctcc tgggagacga cggaggagaa gctgcaggag180cacttctcca acttcggcga ggtctcccag gccgccgtca tgcgcgacaa gctcactggc240cgcccgcggg gcttcggctt cgtagtctac gccgaccccg ccgccgtcga cgccgccctc300caggagcccc acaccctcga cggccgcacg gtcgatgtga agcgggcgct ctcgcgggag360gagcagcagg ctaccaaggc ggtgaaccct agcgcaggaa ggaacgctgg aggtggtggc420ggcggcggcg gcggcggcgg cgatgccggt ggtgctagga caaagaagat ttttgtgggc480ggactgccct ccagtctgac agatgaggag ttccggcagt acttccagac cttcggggct540gtcaccgatg ttgtggtgat gtatgaccag acaacacagc gtccccgggg cttcggcttc600attacctttg actcggagga tgcggttgac cgtgtgctgc acaaaacctt ccacgatctt660ggagggaaga tggtagaggt gaagcgtgct ctgccccgag aggcgaatcc tggctctggc720ggcggcggcc gttccatggg aggtgggggg tttcatagta acaatggacc ccactccaat780gctagcagct atgatggcag aggcgatgct agcagatatg ggcaggcgca gcaaggcatg840ggtggctacc caggttatgg tgctggagct tatggcagtg ctccaactgg gtttggatat900gggccaccca atccgggaac tacttatgga aatattgggt ctgcagggtt aggagctttt960ccttggtgcg tatgcggggg gcttatgggc aacccaggtg gctgcgggtt tcgggttacc 1020cgggggggcc cctccggggc cctaaataag ggaccctggg ggcagccaaa cctccgccct 1080ggtttatggc acctgggggc tttatcctgg gcacgtgcgg ggctattggg tgcgtggaaa 1140taaccc 1146<210>35<211>344<212>PRT<213>普通小麦<400>35Met Glu Ser Asp Gln Gly Lys Leu Phe Ile Gly Gly Ile Ser Trp Glu1 5 10 15Thr Thr Glu Glu Lys Leu Gln Glu His Phe Ser Asn Phe Gly Glu Val20 25 30
Ser Gln Ala Ala Val Met Arg Asp Lys Leu Thr Gly Arg Pro Arg Gly35 40 45Phe Gly Phe Val Val Tyr Ala Asp Pro Ala Ala Val Asp Ala Ala Leu50 55 60Gln Glu Pro His Thr Leu Asp Gly Arg Thr Val Asp Val Lys Arg Ala65 70 75 80Leu Ser Arg Glu Glu Gln Gln Ala Thr Lys Ala Val Asn Pro Ser Ala85 90 95Gly Arg Asn Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp100 105 110Ala Gly Gly Ala Arg Thr Lys Lys Ile Phe Val Gly Gly Leu Pro Ser115 120 125Ser Leu Thr Asp Glu Glu Phe Arg Gln Tyr Phe Gln Thr Phe Gly Ala130 135 140Val Thr Asp Val Val Val Met Tyr Asp Gln Thr Thr Gln Arg Pro Arg145 150 155 160Gly Phe Gly Phe Ile Thr Phe Asp Ser Glu Asp Ala Val Asp Arg Val165 170 175Leu His Lys Thr Phe His Asp Leu Gly Gly Lys Met Val Glu Val Lys180 185 190Arg Ala Leu Pro Arg Glu Ala Asn Pro Gly Ser Gly Gly Gly Gly Arg195 200 205Ser Met Gly Gly Gly Gly Phe His Ser Asn Asn Gly Pro His Ser Asn210 215 220Ala Ser Ser Tyr Asp Gly Arg Gly Asp Ala Ser Arg Tyr Gly Gln Ala225 230 235 240Gln Gln Gly Met Gly Gly Tyr Pro Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Tyr Gly245 250 255Ser Ala Pro Thr Gly Phe Gly Tyr Gly Pro Pro Asn Pro Gly Thr Thr260 265 270Tyr Gly Asn Ile Gly Ser Ala Gly Leu Gly Ala Phe Pro Trp Cys Val275 280 285Cys Gly Gly Leu Met Gly Asn Pro Gly Gly Cys Gly Phe Arg Val Thr290 295 300
Arg Gly Gly Pro Ser Gly Ala Leu Asn Lys Gly Pro Trp Gly Gln Pro305 310 315 320Asn Leu Arg Pro Gly Leu Trp His Leu Gly Ala Leu Ser Trp Ala Arg325 330 335Ala Gly Leu Leu Gly Ala Trp Lys340<210>36<211>800<212>DNA<213>甘蔗(Saccharum officinarum)<220>
<221>misc_feature<222>(8)..(8)<223>n为a、c、g或t<220>
<221>misc_feature<222>(381)..(381)<223>n为a、c、g或t<220>
<221>misc_feature<222>(425)..(425)<223>n为a、c、g或t<220>
<221>misc_feature<222>(428)..(428)<223>n为a、c、g或t<220>
<221>misc_feature<222>(481)..(481)<223>n为a、c、g或t<220>
<221>misc_feature<222>(514)..(514)<223>n为a、c、g或t<400>36agaattcncg gttcgaccta cgcgtccgcc cggaatcccc aattccgctc tcttcctctc 60tccctctctc ccccaccgca gcatcaggcg agcgcgaggc ggaggtggag gagagatgga120gttggaccag ggcaagctct tcatcggcgg catctcctgg gagacgacgg aggagaagct180gagcgagcac ttctccgcct acggcgaggt tacgcaggcc gccgtcatgc gggacaagat240caccggccgc ccccgtggct tcgggttcgt cgtcttcgcc gaccccgccg tcgtcgaccg300
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<221>misc_feature<222>(89)..(89)<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸<220>
<221>misc_feature<222>(104)..(105)<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸<220>
<221>misc_feature<222>(133)..(133)<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸<400>38Met Glu Leu Asp Gln Gly Lys Leu Phe Ile Gly Gly Ile Ser Trp Glu1 5 10 15Thr Thr Glu Glu Lys Leu Ser Glu His Phe Ser Ala Tyr Gly Glu Val20 25 30Thr Gln Ala Ala Val Met Arg Asp Lys Ile Thr Gly Arg Pro Arg Gly35 40 45Phe Gly Phe Val Val Phe Ala Asp Pro Ala Val Val Asp Arg Ala Leu50 55 60Gln Asp Pro His Thr Leu Asp Gly Arg Thr Val Asp Val Lys Arg Ala65 70 75 80Leu Ser Arg Glu Glu Gln Gln Ala Xaa Lys Ala Ala Asn Pro Ser Gly85 90 95Gly Arg Asn Thr Gly Gly Gly Xaa Xaa Gly Gly Trp Arg Gly Gly Asp100 105 110Ala Ser Gly Ala Arg Thr Gln Glu Asp Leu Trp Gly Ala Gly Leu Pro115 120 125Ser Thr Leu Thr Xaa Gly Trp Val Ser Ala Val Leu Ser Gly Pro Ser130 135 140Glu Gly Ser Leu Met Val Gly Gly His Gly145 150<210>39<211>59<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物prm00405<400>39ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggat tatgatcggt acaagttat 59
<210>40<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物prm00406<400>40ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt taaaagagtc caaagaattt cact 5权利要求
1.改良植物生长特性的方法，其包括增加植物中RNA结合蛋白或其同源物的活性，其中所述RNA结合蛋白或其同源物为以下任一(i)具有RNA结合活性的多肽并且包含2或3个RNA识别基序RRM以及与基序IPYEAAVVALPVVVKERLVRILRLGIATRYD具有至少75％序列同一性的基序和/或与基序IIRFDPFTGEPYKFDP具有至少50％序列同一性基序；或(ii)RBP1多肽或其同源物，其具有(a)RNA结合活性；(b)两个RRM结构域；(c)以下两个基序(i)KIFVGGL和(ii)RPRGFGF，基序中允许至多三个氨基酸取代和任意的保守的改变；和(d)与SEQ ID NO15所代表的氨基酸具有至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％序列同一性；和(iii)任选地选择具有改良生长特性的植物。
2.根据权利要求1的方法，其中所述增加的活性是通过优选地在编码RNA结合蛋白或其同源物的基因座引入遗传修饰实现。
3.根据权利要求2的方法，其中所述遗传修饰是通过定点诱变、同源重组、TILLING或T-DNA激活中的任一实现。
4.改良植物生长特性的方法，其包括在植物中引入和表达RNA结合蛋白编码核酸或其功能变体，其中所述编码的RNA结合蛋白或其同源物为下列任一(i)具有RNA结合活性的多肽并且包含2或3个RNA识别基序RRM以及与基序IPYEAAVVALPVVVKERLVRILRLGIATRYD具有至少75％序列同一性的基序和/或与基序IIRFDPFTGEPYKFDP具有至少50％序列同一性的基序；或(ii)RBP1多肽或其同源物，其具有(a)RNA结合活性；(b)两个RRM结构域；(c)以下两个基序(i)KIFVGGL和(ii)RPRGFGF，基序中允许至多三个氨基酸取代和任意的保守的改变；和(d)与SEQ ID NO15所代表的氨基酸具有至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％序列同一性。
5.根据权利要求4的方法，其中所述变体是RNA结合蛋白编码核酸的部分或者能与RNA结合蛋白编码核酸杂交的序列。
6.根据权利要求4或5的方法，其中所述RNA结合蛋白编码核酸或其功能变体在植物中过表达。
7.根据权利要求4到6中任一项的方法，其中权利要求4(i)所述RNA结合蛋白编码核酸或其功能变体是植物来源的，优选来自双子叶植物，进一步优选来自烟草科，更优选核酸来自烟草。
8.根据权利要求4到6中任一项的方法，其中权利要求4(ii)所述RNA结合蛋白编码核酸或其功能变体是植物来源的，优选来自双子叶植物，进一步优选来自十字花科，更优选核酸来自拟南芥。
9.根据权利要求4到7中任一项的方法，其中所述RNA结合蛋白编码核酸或其功能变体有效地连接于种子偏好的启动子。
10.根据权利要求9的方法，其中所述启动子是谷醇溶蛋白启动子，如来自稻的谷醇溶蛋白启动子。
11.根据权利要求4到6和权利要求8中任一项的方法，其中所述rbp1核酸或其功能变体有效地连接于能够在芽中偏好地表达所述核酸的启动子。
12.根据权利要求11的方法，其中所述启动子具有与β扩展蛋白启动子相似的表达谱。
13.根据权利要求1到12中任一项的方法，其中所述改良的植物生长特性是相对于相应的野生型植物增加的产率。
14.根据权利要求1到13中任一项的方法，其中所述改良的植物生长特性是增加的植物生物量。
15.根据权利要求13的方法，其中所述增加的产率是增加的种子产率。
16.根据权利要求15的方法，其中所述增加的种子产率选自以下的任一或更多(i)增加的种子生物量；(ii)增加的(饱满)种子数；(iii)增加的种子大小；(iv)增加的种子体积；(v)增加的收获指数；和(vi)增加的千粒重(TKW)。
17.根据权利要求1到16中任一项的方法，其中所述改良的植物生长特性是增加的生长速率。
18.可根据权利要求1到17中任一项的方法获得的植物。
19.构建体，包含(i)RNA结合蛋白编码核酸或其变体，该RNA结合蛋白具有RNA结合活性并且包含2或3个RNA识别基序RRM以及与基序IPYEAAVVALPVVVKERLVRILRLGIATRYD具有至少75％序列同一性的基序和/或与基序IIRFDPFTGEPYKFDP具有至少50％序列同一性的基序；(ii)能够驱动(i)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选的(iii)转录终止序列。
20.构建体，包含(i)rbp1编码核酸或其变体，其中所述编码的RBP1具有(a)RNA结合活性；(b)两个RRM结构域；(c)以下两个基序(i)KIFVGGL和(ii)RPRGFGF，基序中允许至多三个氨基酸取代和任意的保守的改变；和(d)与SEQ ID NO15所代表的氨基酸具有至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％序列同一性；(ii)能够驱动(i)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选的(iii)转录终止序列。
21.根据权利要求19的构建体，其中所述控制序列是能够驱动在种子组织中表达的启动子。
22.根据权利要求21的构建体，其中所述启动子是谷醇溶蛋白启动子，如来自稻的谷醇溶蛋白启动子。
23.根据权利要求20的构建体，其中所述启动子能够驱动在芽中的表达。
24.根据权利要求23的构建体，其中所述启动子与β扩展蛋白启动子具有相似的表达谱。
25.使用根据权利要求19到24中任一项的构建体转化的植物。
26.产生具有改良生长特性的转基因植物的方法，该方法包括(i)向植物中引入RNA结合蛋白编码核酸或其变体，其编码的RNA结合蛋白具有RNA结合活性并且包含2或3个RNA识别基序RRM以及与基序IPYEAAVVALPVVVKERLVRILRLGIATRYD具有至少75％序列同一性的基序和/或一个基序与基序IIRFDPFTGEPYKFDP具有至少50％序列同一性的基序；和(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
27.产生具有改良生长特性的转基因植物的方法，该方法包括(i)向植物中引入rbp1编码核酸或其变体，其中所述编码的RBP1具有(a)RNA结合活性；(b)两个RRM结构域；(c)以下两个基序(i)KIFVGGL和(ii)RPRGFGF，基序中允许至多三个氨基酸取代和任意的保守的改变；和(d)与SEQ ID NO15所代表的氨基酸具有至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％序列同一性；和(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
28.具有改良生长特性的转基因植物，其由将RNA结合蛋白编码核酸或其变体引入所述植物产生。
29.具有改良生长特性的转基因植物，其由将rbp1核酸或其变体引入所述植物产生。
30.根据权利要求18、25或28和29的转基因植物，其中所述植物是单子叶植物，如甘蔗，或者其中所述植物是谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、燕麦或高粱。
31.根据权利要求18、25或28至30中任一项的植物的可收获部分。
32.根据权利要求31的可收获部分，其中所述可收获部分是种子。
33.RNA结合蛋白编码核酸/基因或其变体或RNA结合蛋白或其同源物在改良植物生长特性特别是提高产率尤其是种子产率中的用途。
34.rbp1或其变体或RBP1多肽或其同源物在改良植物生长特性特别是提高产率尤其是种子产率中的用途。
35.根据权利要求33或34的用途，其中所述种子产率包括以下的一个或多个增加的(饱满)种子数、增加的种子重量、增加的收获指数和增加的TKW。
36.RNA结合蛋白或其变体或rbp1或其变体作为分子标记的用途。
全文摘要
本发明涉及通过增加植物中RNA结合蛋白或其同源物的活性来改良植物生长特性的方法，其中所述RNA结合蛋白或其同源物是(i)具有RNA结合活性的多肽并且其包含2或3个RNA识别基序(RRM)以及与基序IPYEAAVVALPVVVKERLVRILRLGIATRYD具有至少75％序列同一性的基序和/或与基序IIRFDPFTGEPYKFDP具有至少50％序列同一性的基序；或(ii)RBP1多肽或其同源物，其具有(a)RNA结合活性；(b)两个RRM结构域；(c)以下两个基序(i)KIFVGGL和(ii)RPRGFGF，基序中允许至多三个氨基酸取代和任意的保守的改变；和(d)与SEQ ID NO15代表的氨基酸具有至少20％序列同一性。本发明还涉及其中引入了RNA结合蛋白编码核酸或其变体的转基因植物，所述植物与相应的野生型植物相比，具有改良的生长特性。本发明也涉及在本发明方法中有用的构建体。
文档编号A01H5/00GK101040050SQ200580034841
公开日2007年9月19日 申请日期2005年8月16日 优先权日2004年8月16日
发明者V·弗兰卡德, C·鲁兹, A·I·桑兹莫林纳罗 申请人:克罗普迪塞恩股份有限公司