具有改变的生长特性的植物及其制备方法

专利名称：具有改变的生长特性的植物及其制备方法
技术领域：
本发明广义上涉及分子生物学领域，涉及改变植物生长特性的方法。更具体的说，本发明涉及通过调节植物中B型CDK(细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶)核酸地表达，和/或通过调节植物中B型CDK蛋白的活性和/或水平来改变植物生长特性的方法。本发明也涉及具有B型CDK核酸的已调节的表达和/或B型CDK蛋白的已调节的活性和/或水平的植物，该植物相对于对应的野生型的植物具有改变的生长特性。本发明还提供了新的筛选方法，鉴定相对于对应的未突变CDK具有提高了CDK活性的CDK突变体。本发明同时提供了新的筛选方法，鉴定能够结合CKI(细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶的抑制剂)的无活性CDK。本发明还提供通过本发明的筛选方法可获得的CDK突变体。
世界人口的不断增长和农业可用耕地供应的不断减少加速为了提高农业效率的农业研究。传统的农作物和园艺改良方法是利用选择性繁殖技术鉴别具有期望特性的植物。但是，这种选择性繁殖技术具有许多缺点，即一般来说这些技术是劳动密集型的，产生的通常具有不同遗传组成的植物从亲本植物传代后不一定总能得到期望的性状。分子生物学的进展使人类可以改变动物和植物的种质。植物基因工程承担着遗传物质(一般以DNA或RNA的形式)的分离和操纵、和该遗传物质的随后导入的使命。这种技术具有提供具有各种改良经济、农艺或园艺特性的植物的能力。具体经济利益的一个特征就是产量。通常产量定义为作物的有经济价值的可测量产物。其可从量和/或质上定义。产量直接依赖与几个因素，例如器官的数量和大小、植物的结构(例如分枝的数目)、种子产量及其它。根的生长、养分的摄取和逆境耐性也是决定产量的重要因素。植物通常面临的压力包括环境(非生物的)压力(例如异常高或低温引起的温度压力；养分不足导致的压力；缺水(干旱)导致的压力)和生物压力(其他植物(杂草)、动物性害虫和病原体施加给植物的)。不仅通过优化上述因素中的一种可以增加作物的产量，而且通过改变植物内在的生长机制也可以增加作物的产量。
植物内在的生长机制是总称为“细胞周期”的高度有序的事件。细胞周期的进行是所有多细胞生物生长和发育的基础，对于细胞增殖至关重要。在酵母、哺乳动物和植物中细胞周期的主要组分是高度保守的。一般细胞周期分为下列有序的时期G0-G1-S-G2-M。DNA的复制或合成一般发生在S期(“S”代表DNA的合成)，染色体的有丝分裂分离发生在M期(“M”是有丝分裂)，和分裂间期(intervening gapphase)G1(DNA复制前的细胞生长时期)和G2(DNA复制后细胞准备分裂的时期)。M期的最后步骤，胞质分裂后细胞分裂完成。离开细胞周期的细胞和周期中静止的细胞称为处于G0期。这个时期内的细胞能够被刺激在G1期进入细胞周期。G1、G2和G0中的“G”表示“间期”。细胞周期程序的完成使每一子细胞在细胞分裂中得到亲代基因组的全部备份。
细胞分裂被两个主要的细胞周期事件控制，即DNA合成的起始和细胞分裂的起始。这些关键事件间的每个转化是由特殊蛋白质复合体(参与DNA复制和分离)代表的关卡控制的。在哺乳动物和植物细胞中，G1/S边界上DNA合成的必需基因的表达由转录因子中的E2F家族控制(La Thangue，1994(Curr.Opin.Cell Biol.6(3)，443-450)；Muller等人，2001(Genes Dev.15(3)，267-285)；De Veylder等人，2002(EMBO J.21(6)，1360-1368))。进入细胞周期由整合信号并激活细胞周期基因转录的E2F/Rb复合体调节/引发。细胞周期的不同阶段的转化和之后细胞周期的进行由不同的异源二聚化的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的形成和激活驱动，所述丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶一般指细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)。这些激酶活性的首要条件是和具体周期蛋白的物理结合，激活的时间选择主要由周期蛋白的表达决定。周期蛋白的结合导致相关CDK的N末端部位(lobe)的构像改变，导致复合体的定位和底物特异性。当与周期蛋白结合时，单体CDK被激活，并因此具有激酶的活性。在细胞周期中，细胞周期蛋白水平波动，并因此体现出一个决定CDK激活时间的主要因素。在细胞周期中，含有细胞周期蛋白和CDK的这些复合体的周期性活动介导细胞周期转化(关卡)的时间调节。调节CDK活性的其他因素包括CDK抑制剂(CKI或ICK、KIP、CIP、INK)，CDK激活激酶(CAK)，CDK磷酸酶(Cdc25)和CDK亚基(CKS)(Mironov等人，1999(Plant Cell11(4)，509-522)；Reed 1996(Progressin Cell cycle Research2，15-27))。
在植物中，一直研究两个主要CDK类别，已知的A型和B型CDK。A型CDK调节G1至S和G2至M的转化，而B型CDK似乎仅控制G2至M的关卡(Hemerly等人，1995(EMBO J.14(16)，3925-3936)；Magyar等人，1997(Plant Cell 9(2)，223-235)；Porceddu等人，2001(J.Biol.Chem.276(39)36354-36360))。另外，已有C型CDK和CDK激活激酶(CAK)存在的报道(Magyar等人，1997(Plant Cell9(2)，223-235)；Umeda等人，1998(Proc Natl Acad SciUSA.95(9)，5021-5026.；Joubès等人，2001(Plant Physiol.126(4)，1403-1415))，和D型、E型和F型CDK存在的报道(Vandepoele等人，2002(Plant Cell 14(4)，903-916))。
影响植物中细胞周期和由此改变植物的各种生长特性的能力将在多个领域中有许多应用，例如作物增殖、植物繁殖、观赏植物生产、aboriculture、园艺、林业、藻类或植物生产(例如用作生物反应器，例如药品、抗体或疫苗的物质的生产，或有机废物生物转化或用作高产量藻类和植物的养料)。
现已发现调节在植物中B型CDK核酸的表达，和/或调节在植物中B型CDK蛋白的活性和/或水平，提供具有改变的生长特性的植物。因此，根据本发明的第一个实施方式，本发明提供了改变(改良)植物生长特性的方法，包括调节植物中B型CDK核酸的表达，和/或调节在植物中B型CDK蛋白的活性和/或水平，其中改变的生长特性选自提高生长速度、增加产量和改变的结构。
调节B型CDK核酸的表达即提高或增加B型CDK基因/核酸的表达。调节B型CDK蛋白的活性和/或水平即增加活性(可能是，或可能不是增加B型CDK蛋白水平的结果)。相对于对应的野生型植物中B型CDK的表达、活性和/或水平，变化了的表达、活性和/或水平被改变。在本领域中，获得提高或增加基因表达或基因产物的方法已被详尽记载，包括例如通过强启动子驱动的超表达、转录增强子或翻译增强子的使用。
改变(更具体的，改良)植物生长特性的优选方法包括在植物中导入和表达B型CDK核酸，所述核酸编码B型CDK蛋白。该核酸可通过，例如转化导入植物中。因此，根据本发明的一个优选方面，提供了改良植物生长特性的方法，包括向植物中导入B型CDK核酸的可表达形式，所述B型CDK核酸编码B型CDK蛋白，其中改良的生长特性是均相对于对应的野生型植物，且为生长速度的提高，产量的增加和改变的结构中的任意一种或几种。
本发明中“B型CDK核酸”定义为编码蛋白质的核酸/基因，其具有(i)没有错配，或在从左向右数的2位和/或4位上有错配的PPTALRE基序；(ii)催化激酶结构域；和(iii)T环激活激酶结构域(Magyar等人，1997(Plant Cell 9(2)，223-235)。
本领域中的普通技术人员使用常规技术可以容易的确定以上(i)到(iii)中定义的基序和结构域。激酶分析可以如Cockcroft等人，2000(Nature，405(6786)，575-579)的描述实施。该分析包括在液氮中研磨植物材料，在合适的缓冲液(例如1ml的50mM的Tris-HClpH7.5，75mM NaCl，15mM EGTA，15mM MgCl2，1mM二硫苏糖醇，0.1％Tween 20，1X完全Tm蛋白酶抑制剂，1mM NaF，0.2mM NaV，2mM焦磷酸钠，60mM β-甘油磷酸)中重悬。然后将悬浮液匀浆四次，每次30秒，匀浆之间在冰上放置30秒。接着，上清液与20μl蛋白A琼脂糖凝胶(50％悬浮)在4℃孵育30分钟。该上清液与1μl抗血清(针对CDC2b蛋白的羧基端多肽，如Setiady等人，1996(PlantCell Physiology 37(3)，369-376)在冰上孵育2小时，然后加入20μl蛋白A琼脂糖凝胶，样品在4℃旋转1小时。样品用激酶缓冲液(50mMTris-HCl pH7.5，100mM NaCl，5mM EGTA，1mM DTT)洗涤2次，在15μl分析缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5，100mM NaCl，5mMEGTA，10mM MgCl2，1mM DTT，1mM NaF，0.2mM钒酸钠，2mM焦磷酸钠，25mM β-甘油磷酸，0.5mM组蛋白H1作为底物，0.5mM PMSF，和74kBq[γ32P ATP(>185TBq mmol-1)每15μl反应物)中重悬，并在室温下孵育30分钟。该反应通过加入凝胶载样缓冲液停止，可以使用SDS-PAGE分析样品，使用磷光影像分析仪(Molecular Dynamics)定量。
本文中定义的术语“B型CDK氨基酸”是任何氨基酸序列，当其用于构建例如


图1所描述的CDK系统发生树时，倾向于聚簇在B型CDK周围而非其他CDK群周围。本领域的普通技术人员使用产生这种系统发生树的已知技术和软件，例如GCG、EBI或CLUSTAL包，使用默认值，能够容易的确定任何讨论的氨基酸序列是否符合“B型CDK氨基酸”的定义。构建这种系统发生树后，聚簇在B型CDK群中的序列将被认为符合“B型CDK”的定义，并将用于进行本发明的方法。另外或或者，本文中定义的术语“B型CDK氨基酸”包括(i)没有错配，或在从左向右数的2位和/或4位上有错配的PPTALRE基序；(ii)催化激酶结构域；(iii)T环激活激酶结构域(Magyar等人，1997(Plant Cell9(2)，223-235)。
下表1显示代表性的没有错配，或在从左向右数的2位和/或4位上有错配的B型CDK和PPTALRE基序。
表1
B型CDK核酸/基因可分离或衍生自任何植物或藻类或真菌来源。该核酸可以基本上由其在组成和/或有意的人工操作中的基因组环境中的天然形式修饰得到。B型CDK核酸可分离自单子叶或双子叶种，优选来自十字花科(Brassicaceae)，进一步优选来自鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)。该核酸优选是1类B型CDK，例如选自
图1种显示的1类CDK实例的1类B型CDK，也就是，来自鼠耳芥的CDK B1；1、来自鼠耳芥的CDK B1；2、来自番茄(Lycopersiconesculentum)(番茄)的CDK B1；1、来自金鱼草(Antirrhinum majus)的CDK B1；1、来自紫苜蓿(Medicago sativa)(紫苜蓿)的CDK B1；1和来自杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)的CDK B1，进一步优选1类B型CDK是来自鼠耳芥的CDK B1；1和来自鼠耳芥的CDK B1；2。或者，该核酸优选是2类B型CDK，例如选自
图1中显示的例子的2类B型CDK，也就是，来自鼠耳芥的CDK B2；1、来自鼠耳芥的CDK B2；2、来自金鱼草的CDK B2；1、来自Mesembryanthemum crassifolium的CDK B2；1、来自紫苜蓿的CDK B2；1、来自番茄的CDK B2；1和来自稻(Oryza sativa)的CDK B1，2类B型CDK进一步优选是来自鼠耳芥的CDK B2；2。
最优选的CDK B1；1核酸是SEQ ID NO1代表的序列或其部分，或可以与其杂交的核酸序列，并且其中CDK B1；1蛋白是SEQ ID NO2代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。最优选的CDK B1；2核酸是SEQ ID NO3代表的序列或其部分，或可以与其杂交的核酸序列，并且其中CDK B1；2蛋白是SEQ ID NO4代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。最优选的CDK B2；2核酸是SEQ ID NO5代表的序列或其部分，或可以与其杂交的核酸序列，并且其中CDK B2；2蛋白是SEQ ID NO6代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。每个CDK B1；1、CDK B1；2和CDK B2；2核酸/蛋白也包括本文后面描述的核酸和氨基酸变体。
虽然本发明由分别根据SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO5所代表的B型CDK，及根据SEQ ID NO2、SEQ ID NO4和SEQ IDNO6的对应氨基酸例证，但是对于本领域的普通技术人员而言，根据本发明的方法明显可以使用核酸变体和氨基酸变体进行，例如本文后面定义的那些。因此，从广义来说术语“B型CDK”蛋白/核酸也包括适合进行根据本发明的方法的核酸变体和氨基酸变体。适合进行根据本发明的方法的核酸变体和氨基酸变体包括符合“B型CDK”定义的那些，这意味着在例如
图1所描述的CDK系统发生树结构上，目的变异序列倾向于聚簇在B型CDK周围和/或变体编码(在变异核酸的情况下)，或是蛋白质(在变异氨基酸的情况下)其包括(i)没有错配，或在从左向右数的2位和/或4位上有错配的PPTALRE基序；(ii)催化激酶结构域；(iii)T环激活激酶结构域(Magyar等人，1997(PlantCell 9(2)，223-235)。
进行根据本发明的方法中有用的合适变体核酸和氨基酸序列包括
(i)B型CDK核酸/基因的功能部分；
(ii)能够与B型CDK核酸/基因杂交的序列；
(iii)B型CDK核酸/基因的可变剪接变体；
(iv)B型CDK核酸/基因的等位基因变体；
(v)B型CDK蛋白的同源物、衍生物或活性片段；
(vi)突变B型CDK。
变体B型核酸/基因的例子是B型核酸/基因的功能部分。对于本领域的普通技术人员而言，DNA序列全长不是进行根据本发明的方法的必要条件是显而易见的。根据本发明的方法可使用B型CDK的功能部分方便的进行。功能部分是指来自或制备自原始(大)B型CDK DNA分子的一段DNA，当该DNA部分导入植物并表达时，其产生具有改变的生长特性的植物，该部分编码的蛋白质包含i)没有错配，或具有在从左向右数的2位和/或4位上有错配的PPTALRE基序；(ii)催化激酶结构域；(iii)T环激活激酶结构域(Magyar等人，1997(PlantCell 9(2)，223-235)。该部分可以包含许多基因，具有或不具有其他的调节元件或可能含有间隔序列。该部分可以通过在例如SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO5中任意一个核酸序列中进行一个或多个缺失，和/或截短来制备。在核酸中导入截短和缺失的技术在本领域中是已知的。
另外B型CDK核酸变体的例子是能够与B型CDK杂交的序列。方便的，根据本发明的方法也可以使用能够与B型CDK杂交的序列进行，所述B型CDK特别是SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO5中任意一个代表的B型CDK，该杂交的序列是符合“B型CDK”定义的那些序列，即在例如
图1所描述的CDK系统发生树的结构上，杂交序列倾向于聚簇在B型CDK周围而非其他CDK群周围，和/或杂交序列编码的蛋白质包括(i)没有错配，或在从左向右数的2位和/或4位上有错配的PPTALRE基序；(ii)催化激酶结构域；(iii)T环激活激酶结构域(Magyar等人，1997(Plant Cell 9(2)，223-235)。
本文中定义的术语“杂交”是基本同源互补核苷酸序列相互退火的过程。该杂交过程能够完全发生在溶液中，即互补核酸均在溶液中。依赖这个过程的分子生物学方法包括聚合酶链式反应(PCR；和基于此的所有方法)、递减杂交(subtractive hybridisation)、随机引物延伸、核酸酶S1作图、引物延伸、反转录、cDNA合成、RNA差异显示和DNA序列测定。该杂交过程也能够发生在互补核酸序列之一固定在基质上，例如磁珠、琼脂糖凝胶珠或其他任何树脂。依赖这个过程的分子生物学方法包括poly(A+)mRNA的分离。此外，该杂交过程也能够发生在互补核酸序列之一固定在固体支持物上，例如硝化纤维素或尼龙膜或通过例如光版印刷术固定至硅酸玻璃支持物(后者称为核酸阵列或微阵列或核酸芯片)。依赖这个过程的分子生物学方法包括RNA和DNA凝胶印迹分析、集落杂交、噬斑杂交、原位杂交和微阵列杂交。为了使杂交发生，一般核酸分子热或化学变性以将双链解链成两条单链和/或从核酸单链上移去发夹结构其他二级结构。杂交的严紧性由例如温度、盐浓度和杂交缓冲液组成等条件影响。杂交的高严紧性条件包括高温和/或低盐浓度(包括NaCl和柠檬酸钠的盐)，和/或杂交缓冲液中甲酰胺的包含，和/或降低杂交缓冲液中例如SDS(去污剂)的化合物的浓度，和/或从杂交缓冲液中排除例如葡聚糖硫酸酯或聚乙二醇(促进分子的群集)的化合物。常规的杂交条件描述如下，例如Sambrook(2001)分子克隆实验手册(Molecular Cloningalaboratory manual)第三版，冷泉港实验室出版，CSH，纽约，但是技术人员可以理解，基于已知的或期望的核酸序列的同源性和/或长度能够设计大量不同的杂交条件。特别优选(至少第一种情况)足够低严紧性的杂交条件来分离本发明以上定义的DNA序列的异源核酸。低严紧性条件的例子是4-6XSSC/0.1-0.5％ w/v SDS，在37-45℃下进行2-3小时。基于杂交中核酸的来源和浓度，可以使用不同条件的严紧性，例如中度严紧条件。中度严紧条件的例子包括1-4XSSC/0.25％ w/vSDS，在大于等于45℃下进行2-3小时。高度严紧条件的例子包括0.1-1XSSC/0.1％ w/v SDS，在60℃下进行1-3小时。技术人员将意识到在杂交和洗涤中可以改变各种参数，并且这些参数可以保持或改变严紧条件。开始时严紧条件可是是低的，逐渐升高到提供杂交的如上定义的B型CDK核酸。导致异源性的元素包括等位性、遗传密码的简并性和优先密码子使用的差别。
变体B型CDK的另一实例是B型CDK的可变剪接变体。根据本发明的方法也可使用B型CDK核酸/基因的可变剪接变体实施。本文使用的术语“可变剪接变体”包括核酸的变体，所述核酸中选择的内含子和/或外显子已被切除、替换或增加。这种剪接变体可在自然界中找到，或使用本领域中已知的技术人工制造。可用于根据本发明的方法的剪接变体是“B型CDK”，即在例如
图1所描述的CDK系统发生树的结构上，目的剪接变体倾向于聚簇在B型CDK周围而非其他CDK群周围，和/或剪接变体编码的蛋白质包括(i)没有错配，或在从左向右数的2位和/或4位上有错配的PPTALRE基序；(ii)催化激酶结构域；(iii)T环激活激酶结构域(Magyar等人，1997(Plant Cell9(2)，223-235)。优选地，所述剪接变体是SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO5中任意一个所代表的序列的剪接变体。
B型CDK变体的另一个例子是等位基因变体。方便的，根据本发明的方法也可以使用B型CDK核酸的等位基因变体进行，优选使用SEQID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO5中任意一个所代表的序列的等位基因变体。等位基因变体存在于自然界中，根据本发明的方法的等位基因变体是使用那些根据本发明的方法分离的天然等位基因。可用于根据本发明的方法的等位基因变体是“B型CDK”，即在例如
图1所描述的CDK系统发生树的结构上，目的等位基因变体倾向于聚簇在B型CDK周围而非其他CDK群周围，和/或等位基因变体编码的蛋白质包括(i)没有错配，或在从左向右数的2位和/或4位上有错配的PPTALRE基序；(ii)催化激酶结构域；(iii)T环激活激酶结构域(Magyar等人，1997(Plant Cell 9(2)，223-235)。
变体B型氨基酸的例子包括B型CDK蛋白的同源物、衍生物或活性片段。方便的，根据本发明的方法也可以使用B型CDK的同源物、衍生物或活性片段进行，优选使用编码SEQ ID NO2、SEQ ID NO4和SEQ ID NO6中任意一个代表的B型CDK的同源物、衍生物或活性片段的核酸。
B型CDK蛋白的“同源物”包括相对于被讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸替代、缺失和/或插入，并与衍生其的未修饰蛋白质具有类似生物和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶。为了产生这种同源物，蛋白质中的氨基酸可以被其他具有相似性质(例如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或打断α-螺旋或β-折叠结构的倾向)的氨基酸取代。保守替换表在本领域内是公知的(例如见Creighton(1984)蛋白质(Proteins)W.H.Freeman and Company)。可用于根据本发明的方法的同源物优选是B型CDK，即在例如
图1所描述的CDK系统发生树的结构上，任何目的同源物将倾向于聚簇在B型CDK周围而非其他CDK群周围。这种B型CDK不断增加的优选与鼠耳芥CDK B1；1(SEQ ID NO2)具有至少60％或65％或70％或75％或80％或85％或90％或95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列相同性或相似性，并且同源物包含(i)没有错配，或在从左向右数的2位和/或4位上有错配的PPTALRE基序；(ii)催化激酶结构域；(iii)T环激活激酶结构域(Magyar等人，1997(Plant Cell 9(2)，223-235)。
多肽是否具有和鼠耳芥CDK B1；1至少60％的同一性可以容易的通过序列比对确定。序列比较的比对方法在本领域中是已知的，例如包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch 1970(J.Mol.Biol.48(3)，443-453)的算法来发现两个完全序列的对比，其最大化配对的数目，最小化缺口(gap)的数目。BLAST算法则计算相同序列的百分比，并进行两个序列之间相似性的统计分析。进行BLAST分析的软件可通过生物技术信息国家中心(NationalCentre for Biotechnology Information)公开获得。与鼠耳芥CDK B1；1具有至少60％相同性的蛋白质可以通过对比查询序列和已知的B型CDK序列(例如见
图1)容易的鉴别，使用例如，基于修饰的clustalW算法的VNTI AlignX多比对程序(InforMax，Bethesda，MD，http://www.informaxinc.com)，缺口开放处罚(penalty)的默认设置是10，一个缺口延伸0.05。
同源的两种具体形式直向同源物(orthologs)和平行进化同源物(paralogs)，是进化的概念，用于描述基因的祖先(ancestral)关系。术语“平行进化同源物”指在同一物种的基因组的基因复制导致的平行进化同源基因。术语“直向同源物”是指在由于祖先关系的不同生物中的同源基因。本文中所用的术语“同源”也包括根据本发明的方法中使用的蛋白质的直向同源物和平行进化同源物。
例如单子叶植物品种中的直向同源物可通过进行称为相互blast检索(reciprocal blast search)容易的发现。这可以通过涉及将讨论的序列(例如SEQ ID NO1或SEQ ID NO2)与任何序列数据库blasting的第一blast进行，所述数据库例如可公众获得的NCBI数据库，其可从以下地址发现http://www.ncbi.nlm.nih.gov。如果找到了稻中的直向同源物，讨论的序列将被再次blast，例如，可在NCBI上获得克隆自稻Nipponbare的全长为28,469的cDNA。使用标准默认值，当从核苷酸开始时，可以使用BLASTn或tBLASTX，当从蛋白质开始时，可以使用BLASTP或TBLASTN。筛选blast的结果。然后，全长序列的筛选结果或未筛选结果，对于讨论的序列来源的生物体的序列再进行blast(二次blast)。然后比较第一次和第二次blast的结果。当第二次blast的结果成功获得最相似的B型CDK核酸或蛋白质时，则找到直向同源物，例如该生物体是鼠耳芥，则找到了平行进化同源物。在大家族的情况下，可以使用ClustalW，然后通过相邻相接树来帮助显示聚簇。
蛋白质的“替代变体”是氨基酸序列中至少一个残基被移除，在它的位置上插入了不同残基的那些蛋白质。氨基酸替代一般是单个残基，但是根据多肽上的功能性约束可以是聚簇的；插入一般遵守大约1至10个氨基酸残基的规律，缺失将在大约1至20个残基的范围内。氨基酸替代优选包括保守氨基酸的替代。用于本发明的方法的替代变体将是包含以下的那些(i)没有错配，或在从左向右数的2位和/或4位上有错配的PPTALRE基序；(ii)催化激酶结构域；和(iii)T环激活激酶结构域(Magyar等人，1997(Plant Cell9(2)，223-235))。
蛋白质的“插入变体”是一个或多个氨基酸残基被引入到蛋白质中的预定位置的那些蛋白质。插入可以包括氨基末端和/或羧基末端的融合，和序列内插入一个或多个氨基酸。一般，氨基酸序列内的插入将比氨基或羧基末端的融合小，遵守大约1至10个残基的规律。蛋白质或肽氨基或羧基末端融合的例子包括用于酵母双杂交系统的转录激活物的结合结构域或激活结构域、噬菌体包被蛋白、(组氨酸)6-Tag、谷胱甘肽S-转移酶-tag、蛋白A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag100表位、c-myc表位、FLAG-表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合多肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。用于本发明的方法的插入变体将是包含以下的那些(i)没有错配，或在从左向右数的2位和/或4位上有错配的PPTALRE基序；(iii)T环激活激酶结构域(Magyar等人，1997(Plant Cell 9(2)，223-235)。
蛋白质的“缺失变体”特征在于从蛋白质中去除一个或多个氨基酸。蛋白质的氨基酸变体可以使用本领域内已知的肽合成技术容易的得到，例如固相肽合成等，或通过重组DNA操作。产生蛋白质替代、插入或缺失变体的DNA序列操作方法在本领域内是公知的。例如，对于本领域内的普通技术人员而言，在DNA预定位置上产生替代突变的技术是公知的，包括M13诱变、体外T7-Gen诱变(USB，Cleveland，OH)、QuickChange Site Directed诱变(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介导的定点诱变或其他定点诱变方案。用于本发明的方法的缺失变体将是包含以下的那些(i)没有错配，或在从左向右数的2位和/或4位上有错配的PPTALRE基序；(ii)催化激酶结构域；(iii)T环激活激酶结构域(Magyar等人，1997(Plant Cell 9(2)，223-235)。
寻找和确定B型CDK同源物的方法在本领域内的普通技术人员的领域内是公知的。比较用的比对序列的方法在本领域内是公知的。这些方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch1970(J.Mol.Biol.48(3)，443-453)的算法来发现两个完全序列的比对，其最大化配对的数目，最小化缺口的数目。BLAST算法则计算相同序列的百分比，并进行两个序列之间相似性的统计分析。进行BLAST分析的软件可通过生物技术信息国家中心公开获得。
术语“衍生物”指相对于蛋白质的天然产生形式的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO2、SEQ ID NO4和SEQ ID NO6中任意一个所代表的，可以包括自然或非自然产生的氨基酸残基的替代、缺失或加入的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶。B型CDK蛋白的“衍生物”包括相对于该肽天然产生形式的氨基酸序列，可以包括自然产生的氨基酸残基的改变、糖基化、酰化或非自然产生的氨基酸残基的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶。衍生物也可以相对于其来源的氨基酸序列，包含一个或多个非氨基酸取代基，例如，报告分子或其他配体，共价或非共价结合到氨基酸序列上，和相对于天然产生的蛋白质的氨基酸序列的非自然产生的氨基酸残基，所述的报告分子或其它配体例如报告分子的结合有利于其检测。用于本发明的方法的衍生物将是包含以下的那些(i)没有错配，或在从左向右数的2位和/或4位上有错配的PPTALRE基序；(ii)催化激酶结构域；(iii)T环激活激酶结构域(Magyar等人，1997(Plant Cell 9(2)，223-235)。
B型CDK蛋白的“活性片段”包含(i)没有错配，或在从左向右数的2位和/或4位上有错配的PPTALRE基序；(ii)催化激酶结构域；(iii)T环激活激酶结构域(Magyar等人，1997(Plant Cell9(2)，223-235)。
更方便的，根据本发明的方法也可以使用突变的植物CDK来进行，其中CDK突变体相对于对应的野生型CDK蛋白质具有至少是基本相似的，优选提高的生物活性。
本发明进一步提供迄今未知的筛选方法，其用于鉴定相对于对应的未突变的或野生型CDK具有提高的CDK活性的植物CDK。这些具有提高的CDK活性的植物来源的CDK突变体可以用于根据本发明的方法或可以发现在其他领域内的用途。
因此，根据本发明的另一个实施方案，提供了相对于对应的未突变的CDK具有基本相似的或提高的CDK活性的突变的植物CDK的方法，该方法包括以下步骤
(i)提供植物来源的CDK突变体；
(ii)鉴定ICK不反应的突变体；
(iii)鉴定具有细胞周期蛋白结合活性的突变体；并且可选地接有，
(iv)步骤(ii)和(ii)中得到的突变体的酵母互补测试。
在植物ICK中具有基本相似的或提高的CDK活性。
如果需要，对于突变野生型CDK的新筛选方法可以由以下步骤进行。这些步骤包括
(a)提供野生型CDK的氨基酸；和
(b)在至少一个氨基酸位置上基本突变每个CDK氨基酸。
使用常规技术，可将突变导入CDK，例如易错聚合酶链式反应。突变可以随机导入或通过定点诱变导入。
虽然鉴定CDK突变体的方法已经通过CDK A型蛋白突变体证明，但是这个方法同样很适用于鉴定其他CDK突变体。
通过根据本发明的上述筛选方法可得到的具体优选突变体(突变体1至3)的例子列在下表A中。该突变体是A型CDK突变体；即来自稻的A；1CDK(见SEQ ID NO8)。这些突变体可以具体用于使用本文上述新方法改变植物生长特性的方法中。
或者，具有由表A中的七个氨基酸改变中的至少一个组成的突变的CDK也可以用于根据本发明的方法。根据本发明的方法中的这种突变体的适宜性可以如下容易的确定通过将该突变体通过上述的新筛选方法，以确定该突变体相对于对应的未突变的CDK，是否具有基本相似的或提高的CDK活性。
表A与细胞周期蛋白结合，但不与ICK结合的突变体
该突变体通过在合适氨基酸残基上的改变来表示。例如，在突变体1的情况下，4位上的Y被H替代；79位的V被D替代；152位的A被T替代。突变位置从SEQ ID NO8的第一个甲硫氨酸计算。
因此，根据本发明的另一个实施方案，提供了改变植物生长特性的方法，其包括调节、优选增加包含上表A中的七个氨基酸改变中的至少一个的CDK突变体的活性和/或水平。突变的氨基酸本身可以直接导入植物细胞或导入植物本身(包括导入植物的组织、器官或任何其他部分)。
同样感兴趣的是没有活性，但仍然能够结合CKI的CDK，由此组成CKI陷阱(trap)。这种迄今未知的方法包括以下步骤
(i)提供CDK突变体；
(ii)鉴定ICK结合突变体；和
(iii)鉴定非细胞周期蛋白结合突变体。
步骤(i)至(iii)中的每一个均在上述方法中进行。
如有必要，该新筛选方法可以进行突变野生型CDK的步骤。这些步骤包括
(a)提供野生型CDK的氨基酸；和
(b)在至少一个氨基酸位置上基本突变每个CDK氨基酸。
使用常规技术，可将突变导入CDK，例如易错聚合酶链式反应(error prone PCR)。突变可以随机导入或定点诱变导入。
通过上述筛选方法可得到的具体适宜CDK突变体列在下表B中。该突变体是A型CDK突变体，即A、来自鼠耳芥的A；1CDKl(见SEQ IDNO7和SEQ ID NO8)。
表B与ICK结合，但不与细胞周期蛋白结合的突变体
突变位置从SEQ ID NO8的第一个甲硫氨酸计算。
根据本发明的第三个实施方案，提供了分离的CDK核酸分子，其包含
(a)SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ IDNO12和SEQ ID NO13中任一个代表的CDK突变体的编码核酸；
(b)SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ IDNO12和SEQ ID NO13中任一个代表的CDK突变体的同源物、衍生物或活性片段的编码核酸，其中同源物、衍生物或活性片段包含表A中所示的七个氨基酸位置改变中的至少一个，或表B中所示的八个氨基酸位置改变中的至少一个；
(c)能够与上面(a)或(b)中的核酸杂交的核酸，其中该杂交序列编码的蛋白质包含表A中所示的七个氨基酸位置改变中的至少一个，或表B中所示的八个氨基酸位置改变中的至少一个；
(d)遗传密码导致的上面(a)至(c)的核酸的简并核酸；
(e)(a)至(d)的核酸的等位基因变体，该等位基因变体编码的蛋白质包含表A中所示的七个氨基酸位置改变中的至少一个，或表B中所示的八个氨基酸位置改变中的至少一个；
(f)(a)至(e)的核酸的可变剪接变体，该可变剪接变体编码的蛋白质包含表A中所示的七个氨基酸位置改变中的至少一个，或表B中所示的八个氨基酸位置改变中的至少一个。
根据本发明的第四个实施方案，提供了CDK突变体，包括
(a)SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ IDNO12和SEQ ID NO13中任一个代表的氨基酸；和
(b)SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ IDNO12和SEQ ID NO13代表的氨基酸的片段，该片段包含表A中所示的七个氨基酸位置改变中的至少一个，或表B中所示的八个氨基酸位置改变中的至少一个。
根据本发明的第五个实施方案，提供利于导入和/或表达用于根据本发明的方法的核苷酸序列的遗传构建体和载体。因此，根据本发明的第五个实施方案，提供的遗传构建体包含
(i)B型CDK基因/核酸；或
(ii)编码CDK突变体的核酸，该CDK突变体包含表A中所示的七个氨基酸位置改变中的至少一个，或表B中所示的八个氨基酸位置改变中的至少一个；
(iii)能够驱动(i)或(ii)的核酸表达的一个或多个控制序列；和任选
(iv)转录终止序列。
用于根据本发明的方法的构建体可以使用本领域中普通技术人员公知的重组DNA技术构建。该基因构建体可以插入适合转化进植物并适合在转化的细胞内表达目的基因的载体，该载体可以商业购得。
编码CDK突变体的核酸可以是上文中描述的任何编码突变体的核酸。
B型CDK基因/核酸可以分离自单子叶或双子叶物种，优选分离自十字花科，进一步优选自鼠耳芥。该核酸优选是1类B型CDK，例如选自
图1中显示的1类CDK的实例的1类B型CDK，也就是，来自鼠耳芥的CDK B1；1、来自鼠耳芥的CDK B1；2、来自番茄(番茄)的CDK B1；1、来自金鱼草的CDK B1；1、来自紫苜蓿(紫苜蓿)的CDK B1；1和来自杜氏藻的CDK B1。进一步优选1类B型CDK是来自鼠耳芥的CDK B1；1和来自鼠耳芥的CDK B1；2。或者，该核酸优选是2类B型CDK，例如选自
图1中显示的例子的2类B型CDK，也就是，来自鼠耳芥的CDK B2；1、来自鼠耳芥的CDK B2；2、来自金鱼草的CDK B2；1、来自Mesembryanthemum crassifolium的CDK B2；1、来自紫苜蓿的CDK B2；1、来自番茄的CDK B2；1和来自稻(Oryza sativa)的CDK B1。2类B型CDK进一步优选是来自鼠耳芥的CDK B2；2。
最优选的CDK B1；1核酸如SEQ ID NO1所代表或其部分，或可以与其杂交的核酸序列，并且其中CDK B1；1蛋白是SEQ ID NO2代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。最优选的CDK B1；2核酸是SEQ ID NO3代表的序列或其部分，或可以与其杂交的核酸序列，并且其中CDK B1；2蛋白是SEQ ID NO4代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。最优选的CDK B2；2核酸是SEQ ID NO5代表的序列或其部分，或可以与其杂交的核酸序列，并且其中CDK B2；2蛋白是SEQ ID NO6代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。每个CDK B1；1、CDK B1；2和CDK B2；2核酸/蛋白也包括上文中描述的核酸和氨基酸变体。
然后用构建体或载体转化植物，所述的构建体或载体含有目的序列(即编码B型CDK蛋白的B型CDK核酸或编码CDK突变体的核酸)，该序列可操作性的和一个或多个控制序列(至少一个启动子)连接。
术语“调节元件”、“控制序列”和“启动子”在本文中均可以互换使用，并指能够影响它们连接的序列表达的调节核酸序列。前述术语包括来自典型真核基因组的基因(包括精确启始转录的TATA盒，有或没有CCAAT盒序列)的转录调节序列，和响应发育和/或外在刺激、或以组织特异的方式改变基因表达的其他调节元件(即，上游激活序列、增强子和沉默子)。该术语也包括来自典型原核基因的转录调节序列，其中它可以包括-35盒序列和/或-10盒转录调节序列。术语“调节元件”也包括合成的融合分子或衍生物，其给予、激活或增强核酸在细胞、组织或器官中的表达。术语“控制序列”、“调节序列”、“调节元件”和“启动子”在本文中可以互换使用。本文使用的术语“可操作性连接”指在启动子序列和目的序列之间的功能性连接，这样启动子序列能够起始目的基因的转录。
方便的，B型CDK核酸可以可操作性的和任何启动子连接。在CDKB1；1的情况下，表达优选由未成熟的膨胀的(expanding)组织中有活性的启动子的驱动，例如未成熟的叶子、花、茎和根。本文定义的这种“未成熟的膨胀组织优选的启动子”指主要在未成熟的膨胀组织内表达的启动子，但没必要一定在这种组织内。该“未成熟的膨胀组织优选的启动子”优选是来自稻的β-苹果青霉素EXPB8启动子。其他合适的启动子包括任何苹果青霉素启动子，pLEAFY等。优选地，在CDKBl；2和CDK B2；2的情况下，表达以组成型方式驱动，最优选地，其中的组成型启动子是GOS2启动子。组成型启动子在生长和发育的大多数(但不必全部)时期均有转录活性。组成型植物启动子的例子如下表C所示。下表C所示的启动子可有利的用于进行根据本发明的方法。
表C组成型启动子的例子
诱导型驱动子具有响应发育、化学、环境或物理刺激的诱导的或增加的转录起始。例如当植物暴露于各种应激条件时，应激诱导型驱动子被激活。在如下所示的表D中给出适于实施根据本发明的方法的应激诱导型驱动子。该驱动子也可用于实施本发明的方法，因为在应激下诱导的改变的生长(例如增加的生长)也可有许多优点。
表D应激诱导的启动子的实例
表C和表D中所列的启动子仅为举例的目的，本发明并不限于本文所列举的这些。本领域的普通技术人员将能够容易的提供可用于执行本发明的其他启动子。所列启动子也可以被修饰，以提供所需的特殊表达。
任意的，一个或多个终止子序列也可以用于导入植物的构建体中。术语“终止子”包括是转录单元末端的DNA序列的控制序列，其发出3’加工和初转录物的聚腺苷酸化和转录的终止的信号。其他的调节元件包括转录增强子和翻译增强子。本领域的普通技术人员将意识到终止子序列和增强子序列可以适合用于执行本发明。这种序列可以是已知的或本领域的普通技术人员可以容易获得的。
本发明的遗传构建体可以进一步包含复制起点序列，其在特定细胞类型的保持和/或复制中是需要的。一个例子是作为附加型遗传元件(即质粒分子或粘粒分子)在细菌细胞中保持所需要的遗传构建体。优选的复制起点包括，但不限于f1-ori和colE1。
该遗传构建体可任选包括可选择的标记基因。本文中所用的术语“可选择的标记基因”包括赋予细胞表型的任何基因，在该细胞中所述可选择的标记基因表达，利于鉴别和/或选择转染和/或转化了本发明的核酸构建体的细胞。合适的标记可以选自赋予抗生素抗性或除草剂抗性的标记。含有重组DNA的细胞由此能够在杀死未转化细胞的抗生素或除草剂浓度存在下存活。可选择的标记基因的例子包括提供抗除草剂Basta的bar基因；给予抗生素卡那霉素抗性的npt基因；给予潮霉素抗性的hpt基因。可视标记，例如绿色荧光蛋白(GFP，Haseloff等人，1997(Proc Natl Acad Sci USA.94(6)，2122-2127))，β-葡糖醛酸酶(GUS)或萤光素酶，也可以用作选择标记。合适的选择标记基因的例子包括氨苄青霉素抗性(Ampr)、四环素抗性基因(Tcr)、细菌卡那霉素抗性基因(Kanr)、草铵膦(phosphinothricin)抗性基因、新霉素磷酸转移酶基因(nptll)、潮霉素抗性基因和氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因等。
本发明也包括可根据本发明的方法获得的植物。因此，本发明提供根据本发明的方法可获得的植物，该植物具有选自一个或多个增加产量、提高生长速度和改变的结构的改良植物生长特性，和该植物具有提高的B型CDK的表达和/或活性和/或水平。
本发明也提供具有选自一个或多个增加产量、提高生长速度和改变的结构的改良植物生长特性的植物，该植物具有提高的B型CDK的表达和/或活性和/或水平。
根据本发明的第六个实施方案，提供了生产具有选自一个或多个增加产量、提高生长速度和改变的结构的改良植物生长特性的转基因植物的方法，其包括在植物中导入和表达本发明的核酸分子。
更具体的，本发明提供生产具有改变的生长特性的植物的方法，该方法包括
(i)在植物或植物细胞中导入或表达B型CDK基因/核酸；或
(ii)编码CDK突变体的核酸，该CDK突变体包含表A中显示的七个氨基酸位置改变中的至少一个；
(iii)在促进植物再生和成熟植物生长的条件下培养植物细胞。
该核酸分子本身可以直接导入植物细胞或导入植物本身(包括导入植物的组织、器官或任何其他部分)。根据本发明的优选特征，该核酸优选通过转化导入植物。
该编码CDK突变体的核酸可以是上文中描述的任何突变体的编码核酸。
该B型CDK基因/核酸优选是1类B型CDK，例如选自
图1种显示的1类CDK例子的1类B型CDK，也就是，来自鼠耳芥的CDK B1；1、来自鼠耳芥的CDK B1；2、来自番茄(番茄)的CDK B1；1、来自金鱼草的CDK B1；1、来自紫苜蓿(紫苜蓿)的CDK B1；1和来自杜氏藻的CDK B1。进一步优选1类B型CDK是来自鼠耳芥的CDK B1；1或来自鼠耳芥的CDK B1；2。或者，该核酸优选是2类B型CDK，例如选自
图1中显示的例子的2类B型CDK，也就是，来自鼠耳芥的CDK B2；1、来自鼠耳芥的CDK B2；2、来自金鱼草的CDK B2；1、来自Mesembryanthemum crassifolium的CDK B2；1、来自紫苜蓿的CDK B2；1、来自番茄的CDK B2；1和来自稻(Oryza sativa)的CDK B1。2类B型CDK进一步优选是来自鼠耳芥的CDK B2；2。
最优选的CDK B1；1核酸是SEQ ID NO1代表的序列或其部分，或可以与其杂交的核酸序列，并且其中CDK B1；1蛋白是SEQ ID NO2代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。最优选的CDK B1；2核酸是SEQ ID NO3代表的序列或其部分，或可以与其杂交的核酸序列，并且其中CDK B1；2蛋白是SEQ ID NO4代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。最优选的CDK B2；2核酸是SEQ ID NO5代表的序列或其部分，或可以与其杂交的核酸序列，并且其中CDK B2；2蛋白是SEQ ID NO6代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。每个CDK B1；1、CDK B1；2和CDK B2；2核酸/蛋白也包括上文中描述的核酸和氨基酸变体。
本文中的术语“转化”包括将外源多核苷酸转入宿主细胞中，与转化所用方法无关。随后能够无性繁殖的植物组织，无论是器官发生或胚胎发生，可以被本发明的遗传构建体转化，并且由此再生整个植物。选择的具体组织根据被转化的具体物种的可用的无性繁殖系统和最适合性而不同。代表性的组织目标包括叶盘(leaf disk)、花粉、胚、子叶、下胚轴、雌配子体、愈伤组织、存在的分生组织(即，顶端分生组织、腋芽和根分生组织)，和诱导分生组织(即，子叶分生组织和下胚轴分生组织)。该多核苷酸可以是瞬时的或稳定的导入宿主细胞，并可以非整合保持，例如，作为质粒。或者，其可整合入宿主基因组。然后，得到的转化植物细胞可用本领域普通技术人员已知的方式再生转化植物。
植物品种的转化现在是相当常规的技术。有利的，任何几个转化方法可用于在合适的祖细胞中导入目的基因。转化方法包括使用脂质体、电穿孔法、增加自由DNA摄取的化学制品、直接向植物中注射DNA、粒子枪轰击、使用病毒或花粉的转化和微注射。方法可选自原生质体的钙/聚乙二醇法(Krens，F.A.等人，1982，Nature 296，72-74；Negrutiu等人，1987年6月，Plant Mol.Biol.8，363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等人，1985 Bio/Technol 3，1099-1102)；植物材料的微注射(Crossway A.等人，1986，Mol.Gen Genet 202，179-185)；用病毒(非整合性)感染的包被DNA或RNA的颗粒的轰击(Klein T.M.等人，1987，Nature 327，70)等。表达B型CDK基因的转基因稻植物优选通过使用任何公知的稻转化方法的农杆菌介导的转化产生，所述公知的稻转化方法例如如下描述的任何一种公开的欧洲专利申请EP 1198985 A1，Aldemita和Hodges(Planta，199，612-617，1996)；Chan等人(Plant Mol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等人(Plant J.6(2)271-282，1994)，其公开的内容在此全部引为参考。在玉米转化的情况下，优选的方法是Ishida等人(Nat.Biotechnol.1996年6月；14(6)745-50)或Frame等人(Plant Physiol.2002年5月；129(1)13-22)中描述的，其公开的内容在此全部引为参考。
一般转化后，选择一个或多个由和目的基因共转化的植物可表达基因编码的标记存在的植物细胞或细胞群，接着，转化的材料再生为整个植物。
DNA转化和再生后，测定假设转化了的植物中目的基因的存在、复制数和/或基因组组构，例如使用Southern分析。或者或另外，新导入的DNA的表达水平可以使用Northern和/或Western分析监控，这两个技术均是本领域普通技术人员公知的。
产生的转化植物可以通过各种方法繁殖，例如通过无性繁殖或传统的繁殖技术。例如，第一代(或T1)转化植物可以自交产生纯合的第二代(或T2)转化体，通过传统的繁殖技术T2植物进一步繁殖。
产生的转化生物体可以有多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆转化体(即，所有的转化细胞均含有表达盒)；转化的和非转化的组织的嫁接体(即，转化的根茎嫁接到未转化的幼芽上)。
本发明无疑可扩展到通过本文描述的任何方法产生的任何植物细胞或植物上，并且可扩展到所有植物部分和其繁殖体上。本发明进一步扩展到包含由任何一种前述方法产生的初级转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的后代，唯一的前提是后代显示的遗传型和/或表型特征与采用根据本发明的方法在父代中产生的这些特征相同。本发明也包括含有编码能够调节B-型CDK蛋白的蛋白的分离核酸分子的宿主细胞，优选其中的蛋白是B-型CDK蛋白。根据本发明优选的宿主细胞是植物细胞。本发明也扩展到植物的可收获部分，例如但不限于种子、叶子、果实、花、茎培养物、根茎、块茎和鳞茎。
本文中的术语“植物”包括完整植物、植物的原种(ancestor)和后代和植物部分，包括种子、芽、茎、根(包括块茎)和植物细胞，组织和器官。术语“植物”所以也包括悬浮培养物、胚胎、分生组织区、愈伤组织、叶、配子体、孢子体、花粉和小孢子。在本发明的方法中特别有用的植物包括藻类、蕨类和所有属于绿色植物总科(superfamily)的植物，尤其是单子叶和双子叶植物，包括饲料或草料的豆类、观赏植物、粮食作物、树、或灌木，其选自秋葵属(Abelmoschus spp.)、槭属(Acer spp.)、猕猴桃属(Actinidiaspp.)、冰草属(Agropyron spp.)、葱属(Allium spp.)、苋属(Amaranthus spp.)、凤梨(Ananas comosus)、番荔枝属(Annonaspp.)、旱芹(Apium garaveolens)、鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)、落花生属(Arachis spp.)、波罗蜜属(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麦(Avena sativa)、阳桃(Averrhoacarambola)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletiaexcelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属(Braaaica spp.)、Cadaba farinosa、茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒属(Capsicum spp.)、番木瓜(Carica Papaya)、大花假虎刺(Carissa mccrocarpa)、红花(Carthamus tinctorius)、山核桃属(Carya spp.)、栗属(Castanea spp.)、菊苣(Cichorium endivia)、樟属(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑橘属(Citrusspp.)、椰子属(Cocos spp.)、咖啡属(Coffea Spp.)、可乐果属(Cola spp.)、芋(Colocasia esculenta)、榛属(Corylus spp)、山楂属(Crataegus spp.)、甜瓜属(Cucumis spp.)、南瓜属(Cucurbitaspp.)、菜蓟属(Cynara spp.)、野胡萝卜(Daucus carota)、山蚂蝗属(desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属(Dioscorea spp.)、柿树属(Diospyros spp.)、稗属(Echinochloaspp.)、
(Eleusine coracana)、枇杷(Eriobotrya japonica)、红果仔(Eugenia uniflora)、荞麦属(Fagopyrum spp.)、水青冈属(Fagus spp.)、无花果(Ficus carica)、金橘属(Fortunellaspp.)、草莓属(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属(Glycine spp.)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、向日葵属(Helianthus spp.)、木槿属(Hibiscus spp.)、大麦属(Hordeumspp.)、甘薯(Ipomoea batatas)、胡桃属(Iuglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属(Lathyrus spp.)、浮萍属(Lemnaspp.)、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linum usitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属(Lotus.Spp.)、棱角丝瓜(Luffa acutangula)、羽扇豆属(Lupinus spp.)、硬皮豆属(Macrotyloma spp.)、西印度樱桃(Malpighia emarginata)、苹果属(Malus spp.)、满美果(Mammea americana)、芒果(MangiferaIndica)、木薯属(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、紫苜蓿(Medicago sativa)、草木樨属(Melilotus spp.)、薄荷属(Mentha spp.)、苦瓜属(Momordica spp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属(Musa spp.)、烟草属(Nicotiana spp.)、樨榄属(Olea spp.)、仙人掌属(Opuntia spp.)、乌足豆属(Ornithopus spp.)、稻属(Oryzaspp.)、黍糜(Panicum miliaceum)、Passiflora edulis欧防风(Pastinaca sativa)、鳄梨属(Persea spp.)、皱叶欧芹(Petroselinum crispum)、菜豆属(Phaseolus spp.)、刺葵属(Phoenix spp.)、酸浆属(Physalis spp.)、松属(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属(Pisum spp.)、早熟禾属(Poaspp.)、杨属(Populus spp.)、牧豆树属(prosopis spp.)、李属(Prunus spp.)、番石榴属(Psidium spp.)、石榴(Punica granatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属(Quercus spp.)、萝卜(Raphanussativus)、大黄(Rheum rhabarbarum)、茶藨子属(Ribes spp.)、悬钩子属(Rubus spp.)、甘蔗属(Saccharum spp.)、接骨木属(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、胡麻属(Sesamum spp.)、茄属(Solanum spp.)、高粱(Sorghum bicolor)、菠菜属(Spinaciaspp.)、蒲桃属(Syzygium spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可(Theobroma CaCao)、车轴草属(Trifolium spp.)、triticosecalerimpaui、小麦属(Triticum spp.)、越桔属(Vaccinium spp.)、野豌豆属(Vicia spp.)、豇豆属(Vigna spp.)、葡萄属(Vitis spp.)、玉蜀黍(Zea mays)、野生稻(Zizania palustris)、枣属(Ziziphusspp.)及其它。
根据本发明的优选特征，植物是作物植物，例如大豆、向日葵、油菜、紫苜蓿、油菜籽或棉花。进一步优选，根据本发明的植物是单子叶植物，例如甘蔗。最优选的，植物是谷类，例如稻、玉米、小麦、高粱、粟和大麦。
有利的，实施根据本发明的方法得到具有各种改变的生长特性的植物，该改变的生长特性包括增加产量、提高生长速度和改变的结构，都相对于相应的野生植物而言。
本文中定义的术语“增加产量”包括植物的一部分或几部分的生物量(重量)的增加，尤其是地上(可收获)部分，增加根的生物量或增加其他任何可收获部分的生物量，相对于相应的野生植物的相应部分。该术语也包括种子产量的增加，种子产量包括种子生物量(种子重量)的增加，并可以是每株植物的种子重量或单个种子的增加，和/或(饱满)种子数量的增加和/或种子大小的增加和/或种子体积的增加，都相对于相应的野生植物而言。种子大小和/或种子体积的增加也可能影响种子的成分。种子产量的增加可归于花的数量和/或大小的增加。产量的增加也可能增加收获系数，收获系数以总生物量与可收获部分例如种子的产量比表示。产量的增加也可能增加千粒重(TKW)，从该数量的饱满种子总重量推算出千粒重。TKW的增加可能由于种子大小和/或种子重量的增加。
以谷物为例，可由以下一个或多个原因说明产量增加每公顷或亩植物数量的增加，每株植物穗量的增加，排数量的增加，每排谷粒数量，谷粒重量，千粒重，穗长度/直径等等。以稻为例，可由以下一个或多个方面的增加说明产量增加每公顷或亩植物数量，每株植物圆锥花序的数量，每个圆锥花序的小穗数量，每个圆锥花序的花数量，种子饱满率的增加，千粒重的增加等等。产量的增加也可能导致改变的结构，或可能由于改变结构而产生。
根据本发明的优选特征，实施根据本发明的方法得到具有改变的产量的植物。优选的，改变的产量至少包括以下特征之一相对于对比植物，面积的增加，圆锥花序数量的增加，高度的增加，种子数量的增加，饱满种子数量的增加，种子总重量的增加，千粒重(TKW)的增加和收获系数的增加。所以，根据本发明，提供一种提高植物产量的方法，该方法包括调节B型CDK在植物中的表达和/或调节B型CDK蛋白在植物中的活性和/或水平。
由于根据本发明的转基因植物提高了产量，显然，这些植物表现出生长速度提高(至少在生命周期的部分时段)，相对于相应的野生植物。提高生长速度可能是植物的一部分或多部分(包括种子)，或整个植物特异的。生长速度提高的植物甚至可能出现提前开花。生长速度的提高可能出现在植物的生命周期的一个或多个阶段，或出现在整个植物生命周期。在植物生命周期的早期提高生长速度表现为强化了的生命力。生长速度的增加可能改变植物的收获时间，使植物比未增加生长速度时的可能收获时间提前收获。如果充分提高生长速度，可以允许再次播种相同植物品种(例如紧随稻植物的播种和收获之后，再一次播种和收获稻植物，都在一个常规生长期)或不同植物品种(例如紧随稻的播种和收获之后，再一次播种和任选地收获大豆、土豆或其他合适的植物)，因此增加每年每亩生物量产量(由于任何特定植物生长和收获次数的增加(例如在1年里))。生长速度的提高也可允许在比对应的野生植物生长区域更广阔的区域培育转基因植物，由于地域限制，种植谷物通常由在种植(早季)或者在收获(晚季)时的不利环境条件决定。如果收获周期缩短，该不利环境条件可以避免。从生长实验获得的生长曲线上获得的各种参数可以确定较快的生长速度，该参数可以是T-Mid(植物达到最大大小的50％时所用的时间)和T-90(植物达到最大大小的90％时所用的时间)。
根据本发明的优选特征，实施根据本发明的方法得到具有改变的生长速度的植物。所以，根据本发明，提供提高植物生长速度的方法，该方法包括调节B型CDK在植物中的表达和/或调节B型CDK蛋白在植物中的活性和/或水平。在实例中，转基因植物达到成熟所用的时间比对比植物降低，表明了生长速度的增加。
产量的增加也包括在无应激条件下以及在应激条件下植物与野生植物相比更好的性能。一般植物响应暴露于压力而生长得更慢。然而，因为根据本发明的转基因植物具有增加的产量和增加的生长速度，很明显，在压力条件下，转基因植物也将比对应的同样暴露于相同压力条件下的野生植物生长得更快。该压力条件一般是每天植物可以接触的生物和/或非生物(环境)压力。典型的非生物或环境压力包括由反常的热或冷/冷冻温度导致的温度压力；盐压力；水压力(干旱或过多的水)。非生物压力也可以由化学制品产生。生物压力一般是病原体，例如细菌、病毒、真菌和昆虫导致的压力。
本文定义的术语“改变的结构”包括叶子、芽、茎、分蘖、花序(对于单子叶和双子叶植物)、圆锥花序、花粉、胚珠、种子、胚、胚乳、种皮和糊粉的任何一个或多个的表现上的任何变化。
根据本发明优选特征，实施根据本发明的方法产生具有改变的结构的植物。该改变结构通过至少以下一种表现地上面积的增加、圆锥花序数量的增加和高度的增加。因此，根据本发明，提供了改变植物结构的方法，其包括调节B型CDK核酸/基因在植物中的表达，和/或调节B型CDK蛋白在植物中的活性和/或水平。
根据本发明的方法产生具有如上文所述的改变的生长特性的植物。这些有利的生长特性可以结合其他商业上有利的特性，例如进一步增加产量的特性、对各种压力的抗性、改变各种结构特征的特性和/或生化和/或生理特征。
根据本发明的另一个实施方案，提供B型CDK的用途。例如，B型CDK可用于繁殖过程。该核酸序列或其部分可以在染色体上，包含至少编码B型CDK蛋白的核酸序列，并优选包含一个或多个相关家族成员。这种繁殖过程的一个例子中，鉴别了DNA标记，该DNA标记可以遗传性的连接到能够调节植物中编码B型CDK蛋白的核酸的表达的基因上，该基因可以是编码B型CDK蛋白本身的基因，或任何其他能够直接或间接影响B型CDK基因的表达和/或B型CDK蛋白的活性和/或水平的基因。然后，该DNA标记可用于筛选具有改变的生长特性的植物的繁殖过程中。
B型CDK的等位基因变体可用于特定的传统繁殖过程，例如标记辅助的繁殖。这种繁殖过程有时需要在植物中通过植物的诱变处理导入等位基因变异。一个合适的诱变方法是EMS诱变。然后，通过例如PCR鉴定等位基因变体。然后进行筛选步骤，筛选目的序列的较好的等位基因变体，该较好的等位基因变体产生改变的植物生长特性。一般通过监控含有目的序列的不同等位基因变体的植物的生长表现来进行筛选，例如，SEQ ID NO1的不同等位基因变体。生长表现的监控能够在温室或田野中进行。另外任选的步骤包括植物(其中通过鉴定较好的等位基因变体)与另一种植物杂交。这可以例如用于产生目的表型特征的组合。等位基因变体也包括单核苷酸多态性(SNP)，和小插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常是小于100bp。SNP和INDEL在大多数生物体自然产生的多态株中形成大量的序列变异体。
本发明也涉及B型CDK核酸和/或基因，和B型CDK蛋白在改变植物生长特性中的用途，优选在改变一种或多种以下特征中的用途增加植物的面积、增加第一圆锥花序的数量、增加植物的高度、增加种子的数量、增加饱满种子的数量、增加种子的总重量、增加生长速度、增加收获系数和增加千粒重(TKW)。
该B型CDK核酸可分离自单子叶或双子叶物种，优选来自十字花科，进一步优选来自鼠耳芥。该核酸优选是1类B型CDK，例如选自
图1种显示的1类CDK例子的1类B型CDK，也就是，来自鼠耳芥的CDK B1；1、来自鼠耳芥的CDK B1；2、来自番茄(番茄)的CDK B1；1、来自金鱼草的CDK B1；1、来自紫苜蓿(紫苜蓿)的CDK B1；1和来自杜氏藻的CDK B1。进一步优选的1类B型CDK是来自鼠耳芥的CDKB1；1和来自鼠耳芥的CDK B1；2。或者，该核酸优选是2类B型CDK，例如选自
图1中显示的例子的2类B型CDK，也就是，来自鼠耳芥的CDK B2；1、来自鼠耳芥的CDK B2；2、来自金鱼草的CDK B2；1、来自Mesembryanthemum crassifolium的CDK B2；1、来自紫苜蓿的CDKB2；1、来自番茄的CDK B2；1和来自稻的CDK B1。2类B型CDK进一步优选是来自鼠耳芥的CDK B2；2。
最优选的CDK B1；1核酸是SEQ ID NO1代表的序列或其部分，或可以与其杂交的核酸序列，并且其中CDK B1；1蛋白是SEQ ID NO2代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。最优选的CDK B1；2核酸是SEQ ID NO3代表的序列或其部分，或可以与其杂交的核酸序列，并且其中CDK B1；2蛋白是SEQ ID NO4代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。最优选的CDK B2；2核酸是SEQ ID NO5代表的序列或其部分，或可以与其杂交的核酸序列，并且其中CDK B2；2蛋白是SEQ ID NO6代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。每个CDK B1；1、CDK B1；2和CDK B2；2核酸/蛋白也包括本文描述的核酸和氨基酸变体。
本发明也涉及B型CDK核酸/基因和/或B型CDK蛋白作为生长调节物的用途。上文描述的B型CDK核酸序列和上文描述的B型CDK氨基酸序列可明显用于改变植物的生长特性。因此，发现该序列可用于作为生长调节物或生长刺激物。本发明也提供含有如上文描述的B型CDK蛋白的组合物，作为生长调节物。
相反，根据本发明的序列也可以是农用化学品化合物的目的靶标。因此，本发明包括上述B型CDK核酸作为农用化学品化合物(例如除草剂)靶标的用途。
附图描述
现在本发明将根据以下附图进行描述，其中
图1是显示各种植物的CDK的关系的进化树。
图2是
图1的进化树中CDK A分支的放大图。
图3是鼠耳芥CDKB1；1基因在公认的(putative)β-苹果青霉素启动子，EXPB8(SEQ ID NO14)控制下，在稻中表达的双载体(binaryvector)图。
图4是鼠耳芥CDKB1；2基因在GOS2启动子(SEQ ID NO15)控制下，在稻中表达的双载体(binary vector)图。
图50是鼠耳芥CDKB2；2基因在GOS2启动子(SEQ ID NO15)控制下，在稻中表达的双载体(binary vector)图。
图6详细例示了用于实施根据本发明的方法的序列。
图7是一些代表性CDK B型序列的CLUSTAL W(1.82)多序列比对。黑体是B型CDK中发现的基序；下划线是催化激酶结构域，斜体表示T环激酶结构域(Magyar等人，1997(Plant Cell 9(2)，223-235))。
实施例
现在参考以下实施例详细描述本发明，所述实施例仅为说明目的。
DNA操作除非另有说明，重组DNA技术按照(Sambrook(2001)Molecular Cloninga laboratory manual(分子克隆实验室手册)，第3版Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版)，CSH，New York)中描述的或Ausubel等人(1994)编著的CurrentProtocols in Molecular Biology，Current Protocols第一卷和第二卷描述的标准方案进行。BIOS科学出版公司(英国)和Blackwell科学出版社(英国)出版，R.D.D.Croy编著的Plant MolecularBiology Labfase(1993)描述了植物分子工作的标准材料和方法。
实施例1基因克隆-CDK B1；1
用鼠耳芥幼苗cDNA文库(Invitrogen，Paisley，UK)作为模板通过PCR扩增鼠耳芥属CDKB1；1。从幼苗中提取出的RNA反转录后，cDNA被克隆到pCMV Sport 6.0中。该库的平均插入大小为1.5kb，克隆的初始数目为1.59×107cfu。初始滴度确定为9.6×105cfu/ml，第一次扩增后为6×1011cfu/ml。提取质粒后，200ng模板用于50μ1 PCR昆合物中。包括用于Gateway重组的AttB位点的引物prm0350(有义，启始密码是黑体，AttB1位点是斜体5’GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACAATGGAGAAGTACGAGAAGCTAGA3’)和prm0351(反义，互补，终止密码是黑体，AttB2位点是斜体5’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCAGAACTGAGACTTGTCAAAGG3’)被用于PCR扩增。在标准条件下，使用Hifi Taq DNA聚合酶进行PCR。采用标准方法扩增并纯化930bp的PCR片段。然后执行Gateway程序的第一步，BP反应，其间，将PCR片段与pDONR201质粒体内重组，来生产按照Gateway术语学的“进入克隆(entry clone)”，p0438。作为Gateway技术的一部分，pDONR201购自Invitrogen。
实施例2载体构建-CDK B1；1
随后进入克隆p0438被用在与用于稻转化的目标载体p3169的LR反应。该载体在T-DNA边缘内含有功能元件植物可选择性标记、植物可筛选性植物标记，和用于LR在体内与已经克隆到进入克隆里的目的序列重组的Gateway盒。将公认在未成熟膨胀组织中用于表达的β-苹果青霉素启动子定位在该Gateway盒的上游。
LR重组步骤后，如图3中所示的得到的表达载体(CDK B1；1β-苹果青霉素-过表达)被转化进入农杆菌，并随后转化进入稻植物。使转化后的稻植物生长，并随后如实施例7所述检验其各种参数。
实施例3基因克隆-CDK B1；2
用鼠耳芥幼苗cDNA文库(Invitrogen，Paisley，UK)作为模板通过PCR扩增鼠耳芥属CDKB1；2。从幼苗中提取出的RNA反转录后，cDNAs被克隆到pCMV Sport 6.0中。该库的平均插入大小为1.5kb，克隆的初始数目为1.59×107cfu。初始滴度确定为9.6×105cfu/ml，第一次扩增后为6×1011cfu/ml。提取质粒后，200ng模板用于50μl PCR混合物中。包括Gateway重组的AttB位点的引物prm439(有义，启始密码是黑体，AttB1位点是使斜体5’GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACAATGGAGAAATACGAGAAGCTC 3’)和prm440(反义，互补，终止密码是黑体，AttB2位点是斜体5’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGGTCAGAACTGAGATTTGTC 3’)被用于PCR扩增。在标准条件下，使用Hifi Taq DNA聚合酶进行PCR。采用标准方法扩增并纯化936bp的PCR片段。然后执行Gateway程序的第一步BP反应，其间，将PCR片段与p DONR201质粒体内重组，来生产按照Gateway术语学的“进入克隆”，即p538。作为Gateway技术的一部分，质粒pDONR201购自Invitrogen。
实施例4载体构建-CDK B1；2
随后进入克隆p538被用在与用于稻转化的目标载体p640的LR反应中。该载体在T-DNA边缘包含功能元件植物可选择性标记、植物可筛选性标记，和用于LR在体内与已经克隆到进入克隆里的目的序列重组的Gateway盒。用于上调的GOS2启动子定位在该Gateway盒的上游。
LR重组后，如图4中所示的得到的表达载体(CDK B1；2GOS2-过表达)被转化进入农杆菌，并随后转化进入稻植物。允许转化后的稻植物生长，并随后如实施例7所述检验其各种参数。
实施例5基因克隆-CDK B2；2
用鼠耳芥幼苗cDNA文库(Invitrogen，Paisley，UK)作为模板通过PCR扩增鼠耳芥属CDKB2；2。从幼苗中提取出的RNA反转录后，cDNA被克隆到pCMV Sport 6.0中。该库的平均插入大小为1.5kb，克隆的初始数目为1.59×107cfu。初始滴度确定为9.6×105cfu/ml，第一次扩增后为6×1011cfu/ml。提取质粒后，200ng模板用于50μl PCR混合物中。包括Gateway重组的AttB位点的引物prm2213(有义，启始密码是黑体，AttB1位点是斜体5’GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACAATGGACAACAATGGAGTTAA 3’)和prm2214(反义，互补，终止密码是黑体，AttB2位点是斜体5’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCAGAGAGAGGACTTGTCAG 3’)被用于PCR扩增。在标准条件下，使用Hifi Taq DNA聚合酶实施PCR。采用标准方法扩增并纯化948bp的PCR片段。然后执行Gateway程序的第一步BP反应，其间，将PCR片段与pDGNR201质粒体内重组，来生产按照Gateway术语学的“进入克隆”，即p2660。作为Gateway技术的一部分，质粒pDONR201购自Invitrogen。
实施例6载体构建-CDK B2；2
随后进入克隆p2660被用在与用于稻转化的目标载体p640的LR反应。该载体在T-DNA边缘包含功能元件植物可选择性标记、植物可筛选性标记，和用于LR在体内与已经克隆到进入克隆里的目的序列重组的Gateway盒。用于过表达的pGOS2启动子定位在该Gateway盒的上游。
LR重组后，如图5所示的得到的表达载体(CDK B2；2GOS2-过表达)被转化进入农杆菌，并随后转化进入稻植物。允许转化后的稻植物生长，并随后如实施例7所述检验其各种参数。
实施例7评价和结果
大致产生了15到20个独立的T0稻转化体。将最初的转化体从组织培养室转到用于培育和收获T1种子的温室。保留5个事件，其中T1的后代转基因有/无比为3∶1。对这些事件中的每个事件，大致10个T1幼苗含有转基因(杂合子和纯合子)，并且大致10个T1幼苗缺少转基因(零合子(nullizygote))，这是通过监测可视标记的表达来选择的。
统计分析t-检验和F-检验
采用双因素ANOVA(变量分析)统计模型全面评价植物表型特征。对目的基因转化后的所有事件的所有植物的所有被测量参数实施F-检验。实施F-检验检测所有转化事件对基因的影响，并测定对基因的全面影响或“全局基因影响”。F-检验值确定的显著数据指示“基因”影响，意味着观察到的表型不仅仅是由基因的存在或位置决定。在F-检验情况下，全局基因影响的显著性阀值设定在5％的概率水平。
为了在一个事件内检测基因影响，例如line-specific影响，在每个事件内执行t-检验，使用来自转基因植物和相应零合植物(nullplant)的数据。“零合植物”或“零合分离子”是按照处理转基因植物相同的方法处理的植物，但转基因从中分离出来。也可将零合植物描述为纯合阴性转化子。t-检验的显著性阀值设定在10％概率的水平。在一群转化事件内，一些事件可以低于或高于该t-检验阀值。这是基于一个假设，即基因只可能对基因组的某些位置有作用，并且依赖该位置的影响不是经常出现。也可以将这类基因影响指为“基因线性作用”。比较t-值和t-分布或者比较F-值和F-分布，获得P值。P值代表零假设(零假设是指“没有转基因影响”)正确的概率。
7.1植物生长测量
将所选的T1植物(大约有10个带有转基因，大约有10个不带转基因)转到温室。每株植物接受一个独一无二的条形码标记，清晰地将表型数据与相应植物联系。所选的T1植物培育在直径为10cm的盆里的土壤里，环境条件设定如下光照时间＝11.5小时，日光强度＝30,000lux或更强，日间温度＝28℃或更高，夜间温度＝22℃，相对湿度＝60-70％。转基因植物和相应的零合子在随机位置相伴生长。从播种期到成熟期，将每株植物数次经过数字成像室并成像。每次至少从6个不同角度拍摄数字图像(2048×1536像素，16百万彩色)。采用图像分析软件，从所有植物的所有数字图像中以自动化方式获取以下所述参数。
结果如下表所示，每行对应一个事件。给出了阳性植物和阴性植物的数量差异(dif)以及这些植物之间百分比差(％dif)。P-值代表对每个植物株实施t-检验的概率。最后一行表示所有事件的平均数。在该行里，P-值是F-检验的P-值。
(a)地上植物面积
通过计算区别于背景的植物地上部分的总像素数量确定植物地上面积。该值是在同一时间点从不同角度拍摄的照片的平均值，并通过校准转化成以平方毫米表示的实体面积值。实验显示，该法测量的植物地上面积与植物地上部分的生物量相关。
表2 T1地上植物面积-CDKB1；1
如表1所示，第3株显示转基因植物的地上面积相对于对照植物有显著增长，t-检验的p-值为0.0011。第2株和第4株显示地上植物面积与对照植物相比也出现增长。可以看出转基因植物的地上面积相对于对照植物有10％的总体增长。
表3T1地上植物面积-CDKB1；2
如表2所示，第11株和12株显示地上植物面积显著增长，t-检验的p-值分别为0.0002和0.0573。由F-检验的p值为0.0178可见，总体基因影响也明显。可以看出转基因植物的地上面积相对于对照植物有11％的总体增长。第11株的T2代(见下表4)也证实，相对于相应的零合子有30％增长，并且t-检验的p值为0.0002。
表4T2植物地上面积-CDKB1；2
(b)植物高度
植物的高度由越过上部盆边缘的水平线和与植物地上部分相应的最高像素之间的距离确定。该值是在同一时间点从不同角度拍摄的照片的平均值，并通过校准转化成以毫米表示的实体距离。实验显示，该法测量的植物高度与用刻度尺手工测量的植物高度相关。
表5T1高度-CDK B1；1
结果在表5中显示。如表所示，第3株显示植物高度相对于对应的对照植物(t-检验p值为0.0045)有明显增长。
表6T1高度-CDK B1；2
表7T2高度-CDK B1；2
表6显示第11株和12株T1代高度增长。如表7所示，第11株显示T2代植物的高度相对于对照植物显著增长，并且t-检验的p值为0.019。
7.2与种子相关的参数测量
将成熟的初级圆锥花序(primary panicles)收获，装袋，打条形码标记，然后在37℃的烘箱中干燥3天。然后将圆锥花序脱粒，并将所有的种子收集起来并计数。使用鼓风机将饱满种粒(husk)与空的分离。将空壳丢弃，余下部分再次计数。在分析天平上称量饱满种粒。该过程产生一组以下描述的与种子相关的参数。
(c)每株植物的种子总数
通过计数从植物中收获的种粒(husk)数量测量该参数。
表8T1总种子数-CDK B1；1
结果显示在上表8中。如表所示，第3株显示转基因植物产生的种子总数量相对于对照植物产生的种子总数量有显著增长(t-检验的p值为0.0002)。
表9T2总种子数-CDK B1；2
如表9显示，第11株显示转基因植物的种子总数相对于对照植物的种子总数显著增长(t-检验的p值为0.0047)。
(d)饱满种子数量
通过计数分离后余下的饱满种粒(husk)数量确定饱满种子的数量。
表10T1饱满种子数量-CDK B1；1
结果显示在上表10中。如表所示，第3株显示饱满种子数量相对于对照植物的饱满种子数量有显著增长(t-检验的p值为0.0072)。
表11T1饱满种子数量-CDKB1；2
表12T2饱满种子数量-CDK B1；2
如表11所示，第11株显示饱满种子数量相对于对照植物的饱满种子数量有显著增长，t-检验的p值为0.0091。观察到转基因植物的饱满种子数量与对应对照植物的饱满种子数量总体差异为14％。T2代结果显示在表12中，第11株表现特别好。
(e)每株植物的总种子产量
通过称量每株植物上收获的所有饱满谷粒(husk)确定总种子产量。
表13T1种子总重量-CDK B1；1
结果显示在上表13中。如表所示，第3株显示转基因植物种子总重量相对于相应的非转基因植物的种子总重量有显著增长(t-检验的p值为0.005)。观察到转基因植物的种子总重量相对于对照植物的种子总重量有16％的总体增长。
表14T1种子总重量-CDK B1；2
如表14所示，第11株显示转基因植物种子总重量相对于对照植物的种子总重量有显著增长，t-检验的p值为0.0139。T2代结果显示在下表15中，第11株表现尤其好。
表15T2种子总重量-CDK B1；2
(f)植物收获指数
本发明中收获指数定义为总种子产量和地上面积(mm2)的比乘以系数106。
表16T1收获指数-CDK B1；1
结果显示在上表16中。如表所示，笫3株显示转基因植物的收获指数相对于对照植物的收获指数增长(t-检验的p值为0.0201)。
(g)千粒重
千粒重(TKW)从计数的饱满种子数量和它们的总重量推算该参数。
表18T1千粒重(TKW)-CDK B1；2
表19T2千粒重(TKW)-CDK B1；2
T1代结果显示在表18中。表19列出了T2代的结果。如表所示，第11株显示转基因植物的TKW相对于对照植物的TKW有显著增长，t-检验的p值为0.0347。
(h)周期时间-CDK B2；2
将每周植物面积测量模式化，来获得每株植物的生长曲线。绘制植物面积(mm2)随时间(天)变化曲线，并从获得的生长曲线计算以下参数。
表20T1增长速度-CDK B2；2
结果显示在上表13中。如表所示，第21株和27株显示转基因植物的生长速度相对于对照植物的生长速度有显著增长，两种情况下观察到的增长值为4天。
实施例8转基因谷物表达B-型CDK
在未成熟膨胀组织优选的或组成型启动子的控制下将B型CDK克隆入适合于农杆菌介导的谷物转化的植物转化载体。从以下所述的任意资料中选择谷物转化的载体和方法EP0604662，EP0672752，EP0971578，EP0955371，EP0558676，Ishida等人(Nat.Biotechnol.1996 Jun；14(6)745-50)；和Frame等人(Plant Physiol.2002 May；129(1)13-22)。
用这些方法制备的转基因植物在温室中培育用于T1种子生产。通过定量的实时PCR和Southern blot分析检测转基因的遗传性和拷贝数量。通过反向PCR和Northern分析测定转基因的表达水平。选择带有转基因单拷贝插入和具有不同转基因表达水平的转基因株，用于T2种子生产。
在适于玉米的条件下(168光照期，26-28℃日间温度和22-24℃夜间温度)以及缺水、缺氮和NaCl过量的条件下，使后代种子在温室中发芽、生长。在自交的情况下，来自同一亲本株中的零合分离子以及同一栽培种的野生植物被用作对照。对自交或杂交产生的后代植物进行不同生物量和生长参数评价，包括植物高度，茎厚度、叶子数量、总地上面积、叶子绿色、成熟时间、开花时间、穗数量、收获时间。也对这些株的种子进行各种参数的变化评价，例如谷粒大小、每株植物总谷粒产量和谷粒品质(淀粉含量、蛋白含量和脂肪含量)。
选择与相应对照株相比提高最显著的株用于进一步田间实验和标记辅助繁殖，目标是将田间有效的转基因性状转入商用种质中。采用建立完善的方案进行对玉米生长和与产量相关参数的田间测试。类似地，也采用建立完善的方案进行从一个种质到另一个种质的特异基因座渐渗(例如包含转基因的基因座)。
实施例9B-型CDK突变体的鉴定
按照以下标准程序实施所有分子生物学实验。使用大肠杆菌(Escherishia coli)DB3.1菌株(F-，gyrA462，endA-，Δ(srl-recA)，mcrB，mrr，hsdS20(rB-，mB-)，supE44，ara14，galK2，lacY1，proA2，rpsL20(Smr)，xy15，λ-，leu，mtll)扩增Gateway目标载体。使用E。coli DH5-α菌株(F-，phi80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)，U169，deoR，recA1，hadR17(rk-，mk+)，gal-，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96m，relA1)扩增其他构建体。
9.0使用的菌株和培养基
啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)CDK突变体菌株USl02(MATa；leu2-3；ura3；trp1-1；his3-11；ade2-1；can1-100；cdc28-1N)用于互补研究。将酵母细胞培养在丰富培养基中(YPG-gal；酵母提取物0.5％w/v；蛋白胨0.5％v/w；半乳糖1％w/v；棉子糖1％w/v；琼脂2％w/v)或合成培养基中(YNB无氨基酸酵母氮源(Difco BectonDickinson，Sparks，Madison，USA)0.7％ w/v；琼脂2％ w/v)，补充适当的糖和充足的氨基酸去除混合物(amino-acid drop-out mixture)(Clontech，Palo-Alto，California，USA)中培养。准备感受态酵母细胞，并将其用于转化，该转化使用Frozen-EZ YeastTransformation II试剂盒(ZymoResearch，Orange，California，USA)，按照生产商的指导进行。
9.1双杂交载体的构建
用Sam I将pAD-Gal4.2.1和pBD-gal4-cam(Stratagene，La，Jolla，California，USA)切开，去磷酸化，连接到Gateway盒C(LifeTechnologies，Invitrogen Ltd，Paisley，UK)并导入大肠杆菌DB3.1。检查该盒的方向。得到的载体pGW-AD和pGW-BD含有分别和GAL4 AD或BD结构域融合的gateway盒的AttR1位点，这样，通过使用Gateway程序(Life Technologies，Invitrogen Ltd，Paisley，UK)，允许编码序列符合读框地插入GAL4 AD或BD结构域。
使用包含AttB位点的引物(Cdc2-1-AttB1GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGG CTTCACAATGGAGCAGTACGAGAAGGAGGAG，cdc2-1-AttB2GGGGACCACTTT GTACAAGAAAGCTGGGTCCCCTGTCATTGTACCATCTCAAG)扩增稻cdc2-1(CDK A；1)细胞周期蛋白依赖性激酶全长cDNA(登录号X60374，还参见SEQ ID NO 7和8)。采用Gateway BP程序将PCR产物导入pDONR201(Life Technologies，Invitrogen Ltd，Paisley，UK)。使用得到的进入克隆pDONR-cdc2-1，通过gateway LR反应将cdc2编码序列转入pGW-AD和pGW-BD载体。得到的质粒pAD-cdc2-1和pBD-cdc2-1包含融合GAL4 AD或BD结构域的稻CDK A；1编码序列。
按照配对双杂交程序使用PJ69-4A(MATa，ura3-52，his3-200，ade2Δ，trp-1901，leu2-3112，gal4Δ，gal80Δ，LYS2GALlHIS3，ade2GAL2-ADE2，met2GAL7-lacZ.James等人，1996)和PJ69-4α(MATα，ura3-52，his3-200，ade2Δ，trp-1901，leu2-3112，gal4Δ，gal80Δ，LYS2GAL-1HIS3，ade2GAL2-ADE2，met2GAL7-lacZ.Uetz等人，2000)进行蛋白质和蛋白质相互作用的研究。
9.2随机诱变
使用易错PCR(error-prone PCR)产生随机突变的CDK A；1编码序列。将30ng pAD-cdc2-1质粒加到PCR混合物中(dATP 0.2mM，dGTP0.2mM，dCTP 1mM，dTTP 1mM，缓冲液1X，MnCl2 0.5mM，正向引物(AGGGATGTTTAATACCACTAC)1mM，反向引物(GCACAGTTGAAGTGAACTTGC)1mM，Taq聚合酶1U)。将反应混合物在94℃下变性5分钟，30个循环的94℃下变性1分钟，40℃下退火1分钟，72℃下延伸2分钟，最后72℃下延伸5分钟。该程序导入错误率为每1千个碱基对中2-3个碱基的替代(Miyazaki和Arnold(1999)。J Mol Evol 49716-720；Shafikhani等人(1997)，BioTechniques23304-310)。通过缺口修复克隆(Fusco等人(1999)Yeast 15715-720)直接将PCR片段克隆入由EcoR I和Sal I消化的线性化的pAD载体，将包含pBD-OsICK2或pBD-OsICK4质粒的酵母菌株MaV203(Life technology)用作受体。采用反向双杂交方法筛选CDK A；1。将酵母菌株置于包含0.2％(w/v)5-氟-乳清酸的-Leu-Trp的选择性培养基上，并在28℃下培育。能够在该培养基中存活的酵母克隆是不能与ICK2或ICK4相互作用的CDK A；1突变体。
9.3双杂交配对程序
用具有目的编码序列的pAD或pBD质粒转化酵母菌株PJ69-4A(MAT-a)和PJ69-4α(MAT-α)。将单个菌株分别以带状或平行或垂直置入-Leu或-Trp选择性培养基上，并在28℃下生长1-2天。按照带形成网格、AD和BD菌株在带的交点混合的方式，将酵母菌株转到非选择性YPG培养基上。将酵母在28℃下培育8小时，以使MAT-a和MAT-α菌株之间的配对出现。随后将网格转到-Leu-Trp-His-Ade选择性培养基上，并在28℃下培育2天。能够在该培养基上生长的酵母是含有表达相互作用蛋白质的AD和BD质粒的MAT-a/α二倍体酵母(James等人，(1996)Genetics 1441425-1436.Uetz等人(2000)Nature 403623-627)。
9.4酵母表达载体的构建和突变体互补
用Apa I和Sal I将酵母半乳糖诱导性表达载体pESC-Trp(Stratagene)切开，连接到来自pBSK-GWA的Apa I和Sal I片段上，该片段含有克隆在pBlueScript的EcoR V位点上的Gateway盒A。将产生的载体pE-GW导入E.coli DB3.1，含有的gateway盒AttR1位点直接在GAL1启动子的下游。通过gateway LR反应，将目的编码序列转入来自pDONR进入克隆的pE-GW载体。
酵母菌株US102(Loy CJ等人(1999)Mol Cell Biol.193312-3327)在CDK cdc28中突变，并且不能在37℃下生长，但能够在24℃下生长。在37℃下，使包含用于表达目的基因的质粒的转基因酵母菌株在含有半乳糖的培养基中生长。表达能拯救cdc28突变的基因的酵母菌株是那些能够在该限制温度下生长的酵母菌株。
结果
9.5筛选
使用易错PCR和所述的在MaV203株中的缺口修复克隆来产生pAD载体中的稻CDK A；1突变体文库。通过反向双杂交从该库筛选稻ICK4。大约100 000个变体被筛选出来，并获得79个能在5-氟乳清酸中生长的克隆。通过配对双杂交将其中的74个转到PJ69-4A，用于进一步分析。然后将突变体编码序列测序。观察到的平均诱变水平是每千碱基对5.6±3.4的替代。
9.6表征
野生型稻cdc2-1能与稻ICK4和小鼠疱疹病毒细胞周期蛋白D的同源物强烈结合，与稻细胞周期蛋白D3结合不太强。研究了cdc2突变体与这3个蛋白结合的能力。也研究了它们与US102 cdc28酵母突变菌株，如野生cdc2蛋白互补的能力。
9.6.1与细胞周期蛋白结合但不与ICK结合的突变体
特别有意义的突变体是那些能与细胞周期蛋白结合、但不与ICK4结合、同时仍然保持它们与酵母突变体互补的能力的突变体。这些突变体导致细胞周期蛋白-CDK复合体对ICK介导的抑制不敏感。鉴定出的三个特别重要的突变体如下面重复的表A中所示。
表A与细胞周期蛋白结合，但不与ICK结合的突变体
突变位置从CDK A；1的第一个甲硫氨酸计算。
9.6.2与CKI结合但不与细胞周期蛋白结合的突变体
也特别令人感兴趣的突变体是那些能与ICK结合、但不与细胞周期蛋白结合、并失去它们与酵母US102突变体互补的能力的突变体。这些突变体将滴定出使它们不能抑制CDK细胞周期蛋白复合体的ICK。下面的重复的表B显示的突变体显示该特征。
表B与CKI结合，但不与细胞周期蛋白结合的突变体
序列表
<110>CropDesign N.V.
<120>具有改变的生长特性的植物及其制备方法
<130>CD-103-PCT
<150>EP 03077811.2
<151>2003-09-05
<160>21
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>930
<212>DNA
<213>鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)
<400>1
atggagaagt acgagaagct agagaaggtc ggagaaggaa catacgggaa agtctacaaa 60
gcgatggaga aaggaactgg taagcttgtt gctctgaaga aaactcgtct cgagatggac120
gaagaaggta ttccaccaac tgctcttcgt gagatctcgc ttctccagat gttatcaaca180
tcgatctatg ttgttcgatt actctgcgtc gaacatgttc atcaaccatc aaccaaatct240
caatctacca aatccaatct ctatctcgtt ttcgagtatc tcgatactga tcttaagaaa300
ttcatcgatt cgtataggaa aggacctaat cctaagcctc ttgagccttt tttgattcag360
aagttgatgt ttcagctttg taaaggtgtt gcgcattgtc atagtcatgg tgtgcttcac420
cgtgatctta aaccgcagaa tcttcttctg gtgaaagata aagagcttct taagattgct480
gatttgggtc ttggtcgtgc ttttactgtt cctcttaagt cttatacgca tgagattgtt540
actctttggt atagagctcc tgaagttctt cttggatcta ctcattattc aactggtgtt600
gacatgtggt ctgttggttg tatctttgct gagatggttc ggaggcaagc tcttttccct660
ggtgattctg agtttcagca attgcttcat atcttcaggt tgctaggaac accaactgag720
cagcaatggc cgggtgtttc cacactgcgt gactggcatg tttaccctaa gtgggagccg780
caagacttaa ctcttgctgt tccttctctt tcacctcaag gagttgatct tctcacgaaa840
atgctcaagt acaatccagc cgaaagaatt tcagcaaaaa cagcacttga tcacccatat900
tttgacagcc ttgacaagtc tcagttctga 930
<210>2
<211>309
<212>PRT
<213>鼠耳芥
<400>2
Met Glu Lys Tyr Glu Lys Leu Glu Lys Val Gly Glu Gly Thr Tyr Gly
1 5 10 15
Lys Val Tyr Lys Ala Met Glu Lys Gly Thr Gly Lys Leu Val Ala Leu
20 25 30
Lys Lys Thr Arg Leu Glu Met Asp Glu Glu Gly Ile Pro Pro Thr Ala
35 40 45
Leu Arg Glu Ile Ser Leu Leu Gln Met Leu Ser Thr Ser Ile Tyr Val
50 55 60
Val Arg Leu Leu Cys Val Glu His Val His Gln Pro Ser Thr Lys Ser
65 70 75 80
Gln Ser Thr Lys Ser Asn Leu Tyr Leu Val Phe Glu Tyr Leu Asp Thr
85 90 95
Asp Leu Lys Lys Phe Ile Asp Ser Tyr Arg Lys Gly Pro Asn Pro Lys
100 105 110
Pro Leu Glu Pro Phe Leu Ile Gln Lys Leu Met Phe Gln Leu Cys Lys
115 120 125
Gly Val Ala His Cys His Ser His Gly Val Leu His Arg Asp Leu Lys
130 135 140
Pro Gln Asn Leu Leu Leu Val Lys Asp Lys Glu Leu Leu Lys Ile Ala
145 150 155 160
Asp Leu Gly Leu Gly Arg Ala Phe Thr Val Pro Leu Lys Ser Tyr Thr
165 170 175
His Glu Ile Val Thr Leu Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Val Leu Leu Gly
180 185 190
Ser Thr His Tyr Ser Thr Gly Val Asp Met Trp Ser Val Gly Cys Ile
195 200 205
Phe Ala Glu Met Val Arg Arg Gln Ala Leu Phe Pro Gly Asp Ser Glu
210 215 220
Phe Gln Gln Leu Leu His Ile Phe Arg Leu Leu Gly Thr Pro Thr Glu
225 230 235 240
Gln Gln Trp Pro Gly Val Ser Thr Leu Arg Asp Trp His Val Tyr Pro
245 250 255
Lys Trp Glu Pro Gln Asp Leu Thr Leu Ala Val Pro Ser Leu Ser Pro
260 265 270
Gln Gly Val Asp Leu Leu Thr Lys Met Leu Lys Tyr Asn Pro Ala Glu
275 280 285
Arg Ile Ser Ala Lys Thr Ala Leu Asp His Pro Tyr Phe Asp Ser Leu
290 295 300
Asp Lys Ser Gln Phe
305
<210>3
<211>936
<212>DNA
<213>鼠耳芥
<400>3
atggagaaat acgagaagct cgaaaaggtc ggtgaaggaa cctatggaaa agtctacaaa 60
gcaatggaga aaaccaccgg aaaactcgtc gctctgaaga aaactaggct cgaaatggac120
gaagaaggta taccaccaac ggctctccgt gagatctctc ttctccaaat gctttctcaa180
tcaatctaca tcgttcgtct cctctgcgtc gaacatgtta ttcaatcgaa agattcgact240
gtttctcact ctcccaaatc caatctctat ctcgtttttg agtatctcga cactgatctc300
aagaaattta tagattctca tagaaagggc tcgaatccta gaccgctt9a ggcttctctt360
gtgcagaggt ttatgtttca gctttttaaa ggtgtggctc attgtcatag ccatggtatg420
cttcaccgtg atcttaaacc gcagaatctt ctattggata aggataaagg gattcttaag480
attgctgatt tgggtcttag tcgtgctttt actgtgcctc ttaaggctta tacacatgag540
attgttactc tttggtatag agctcctgaa gttttgcttg gttctactca ttactctact600
gctgttgata tttggtctgt tggatgcatc tttgccgaga tgattaggag gcaagctctt660
ttccctggtg attctgagtt tcagcaacta cttcatattt tcagattgtt aggaacacca720
actgagcagc aatggccggg tgtaatggca ttgcgtgact ggcatgtcta tccaaagtgg780
gagccgcaag acttatcacg tgctgttcca tctctatctc ctgaaggaat tgatcttctc840
acgcaaatgt tgaagtacaa tccagcagaa agaatttcag caaaagcagc tctcgatcat900
ccctactttg acagccttga caaatctcag ttctga 936
<210>4
<211>311
<212>PRT
<213>鼠耳芥
<400>4
Met Glu Lys Tyr Glu Lys Leu Glu Lys Val Gly Glu Gly Thr Tyr Gly
1 5 10 15
Lys Val Tyr Lys Ala Met Glu Lys Thr Thr Gly Lys Leu Val Ala Leu
20 25 30
Lys Lys Thr Arg Leu Glu Met Asp Glu Glu Gly Ile Pro Pro Thr Ala
35 40 45
Leu Arg Glu Ile Ser Leu Leu Gln Met Leu Ser Gln Ser Ile Tyr Ile
50 55 60
Val Arg Leu Leu Cys Val Glu His Val Ile Gln Ser Lys Asp Ser Thr
65 70 75 80
Val Ser His Ser Pro Lys Ser Asn Leu Tyr Leu Val Phe Glu Tyr Leu
85 90 95
Asp Thr Asp Leu Lys Lys Phe Ile Asp Ser His Arg Lys Gly Ser Asn
100 105 110
Pro Arg Pro Leu Glu Ala Ser Leu Val Gln Arg Phe Met Phe Gln Leu
115 120 125
Phe Lys Gly Val Ala His Cys His Ser His Gly Val Leu His Arg Asp
130 135 140
Leu Lys Pro Gln Asn Leu Leu Leu Asp Lys Asp Lys Gly Ile Leu Lys
145 150 155 160
Ile Ala Asp Leu Gly Leu Ser Arg Ala Phe Thr Val Pro Leu Lys Ala
165 170 175
Tyr Thr His Glu Ile Val Thr Leu Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Val Leu
180 185 190
Leu Gly Ser Thr His Tyr Ser Thr Ala Val Asp Ile Trp Ser Val Gly
195 200 205
Cys Ile Phe Ala Glu Met Ile Arg Arg Gln Ala Leu Phe Pro Gly Asp
210 215 220
Ser Glu Phe Gln Gln Leu Leu His Ile Phe Arg Leu Leu Gly Thr Pro
225 230 235 240
Thr Glu Gln Gln Trp Pro Gly Val Met Ala Leu Arg Asp Trp His Val
245 250 255
Tyr Pro Lys Trp Glu Pro Gln Asp Leu Ser Arg Ala Val Pro Ser Leu
260 265 270
Ser Pro Glu Gly Ile Asp Leu Leu Thr Gln Met Leu Lys Tyr Asn Pro
275 280 285
Ala Glu Arg Ile Ser Ala Lys Ala Ala Leu Asp His Pro Tyr Phe Asp
290 295 300
Ser Leu Asp Lys Ser Gln Phe
305 310
<210>5
<211>948
<212>DNA
<213>鼠耳芥
<400>5
atggacaaca atggagttaa acccgctgtt tccgccatgg aagcctttga aaagcttgag 60
aaagtaggtg aagggactta tgggaaagtt tacagagcaa gagagaaagc tactgggatg120
atcgttgctt tgaagaagac gcgtctccat gaggatgaag aaggtgttcc tcccactact180
cttcgcgaga tctctatctt gcgtatgctc gctcgtgatc ctcacatcgt taggttgatg240
gatgttaagc aaggaataaa caaagaagga aaaactgtac tttaccttgt tttcgagtat300
gttgatactg atctcaagaa attcatcaga agctttcgtc aagctggaca gaacattcca360
caaaatactg tcaagtgctt gatgtaccag ttatgcaaag gcatggcttt ttgccatggt420
catggagtgt tgcacaggga tcttaagcct cacaatctct tgatggaccg gaagacaatg480
acgctcaaaa tagcagatct tggattagcc agagccttca ctctcccaat gaaaaagtat540
acacatgaga ttctaactct atggtataga gctccggaag ttcttcttgg agcaacccat600
tactctactg gagtggatat gtggtctgtt ggctgtattt ttgctgaact agtgaccaag660
caagcaatct ttgcgggaga ctctgagctc caacagctcc tccgtatatt caggttgttg720
ggaacaccaa acgaagaagt ttggcctgga gtaagcaaac tcaaggactg gcatgaatac780
ccgcaatgga aaccgttgag tctctccaca gctgtgccaa acctcgacga ggctggactt840
gatctcttat ctaaaatgct ggagtacgag ccagcaaaac gaatctcagc aaagaaagct900
atggagcatc cttacttcga tgatttgcct gacaagtcct ctctctga 948
<210>6
<211>315
<212>PRT
<213>鼠耳芥
<400>6
Met Asp Asn Asn Gly Val Lys Pro Ala Val Ser Ala Met Glu Ala Phe
1 5 10 15
Glu Lys Leu Glu Lys Val Gly Glu Gly Thr Tyr Gly Lys Val Tyr Arg
20 25 30
Ala Arg Glu Lys Ala Thr Gly Met Ile Val Ala Leu Lys Lys Thr Arg
35 40 45
Lau His Glu Asp Glu Glu Gly Val Pro Pro Thr Thr Leu Arg Glu Ile
50 55 60
Ser Ile Leu Arg Met Leu Ala Arg Asp Pro His Ile Val Arg Leu Met
65 70 75 80
Asp Val Lys Gln Gly Ile Asn Lys Glu Gly Lys Thr Val Leu Tyr Leu
85 90 95
Val Phe Glu Tyr Val Asp Thr Asp Leu Lys Lys Phe Ile Arg Ser Phe
100 105 110
Arg Gln Ala Gly Gln Asn Ile Pro Gln Asn Thr Val Lys Cys Leu Met
115 120 125
Tyr Gln Leu Cys Lys Gly Met Ala Phe Cys His Gly His Gly Val Leu
130 135 140
His Arg Asp Leu Lys Pro His Asn Leu Leu Met Asp Arg Lys Thr Met
145 150 155 160
Thr Leu Lys Ile Ala Asp Leu Gly Leu Ala Arg Ala Phe Thr Leu Pro
165 170 175
Met Lys Lys Tyr Thr His Glu Ile Leu Thr Leu Trp Tyr Arg Ala Pro
180 185 190
Glu Val Leu Leu Gly Ala Thr His Tyr Ser Thr Gly Val Asp Met Trp
195 200 205
Ser Val Gly Cys Ile Phe Ala Glu Leu Val Thr Lys Gln Ala Ile Phe
210 215 220
Ala Gly Asp Ser Glu Leu Gln Gln Leu Leu Arg Ile Phe Arg Leu Leu
225 230 235 240
Gly Thr Pro Asn Glu Glu Val Trp Pro Gly Val Ser Lys Leu Lys Asp
245 250 255
Trp His Glu Tyr Pro Gln Trp Lys Pro Leu Ser Leu Ser Thr Ala Val
260 265 270
Pro Asn Leu Asp Glu Ala Gly Leu Asp Leu Leu Ser Lys Met Leu Glu
275 280 285
Tyr Glu Pro Ala Lys Arg Ile Ser Ala Lys Lys Ala Met Glu His Pro
290 295 300
Tyr Phe Asp Asp Leu Pro Asp Lys Ser Ser Leu
305 310 315
<210>7
<211>1115
<212>DNA
<213>稻(Oryza sativa)
<400>7
acctctcctc cgattaatcc cctcccctcc tcttcctccc acttctgcgc ctgctcttcc 60
tcccctcgcc gaccctacct actcgcgccg ccgccgtcgc attgggcggc aaacggaggg120
ggggttaacc ctgatggagc agtacgagaa ggaggagaag attggggagg gcacgtacgg180
ggtggtgtac agggcgcggg acaaggtcac caacgagacg atcgcgctca agaagatccg240
gcttgagcag gaggatgagg gcgtcccctc caccgcaatc cgcgagatct cgctcctcaa300
ggagatgcat cacggcaaca tcgtcaggtt acacgatgtt atccacagtg agaagcgcat360
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gtttgcgaaa aaccccactt taattaagtc atatctctat cagatactcc gcggcgttgc 480
ttactgtcat tctcatagag ttcttcatcg agatttgaaa cctcagaatt tattgataga 540
tcggcgtact aatgcactga agcttgcaga ctttggttta gccagggcat ttggaattcc 600
tgtccgcacg tttactcacg aggttgtaac cttgtggtat agagctccag agatccttct 660
tggatcaagg cagtattcta caccagttga tatgtggtca gttggttgta tctttgcaga 720
aatggtgaac cagaaaccac tgttccctgg tgattctgag attgatgaat tatttaagat 780
attcagggta ctaggaactc caaatgaaca aagttggcca ggagttaget cattacctga 840
ctacaagtct gctttcccca agtggcaagc acaggatctt gcaactattg tccctactct 900
tgaccctgct ggtttggacc ttctctctaa aatgcttcgg tacgagccaa acaaaaggat 960
cacagctaga caggctcttg agcatgaata cttcaaggac cttgagatgg tacaatgacc1020
ctgctatggc tttacattgg attggcatat gtatgggctg ggctcctcat ttcattcctt1080
ctgtgaacgc tgtgcccttc gtttgggcat ttttg 1115
<210>8
<21l>294
<212>PRT
<213>稻
<400>8
Met Glu Gln Tyr Glu Lys Glu Glu Lys Ile Gly Glu Gly Thr Tyr Gly
1 5 10 15
Val Val Tyr Arg Ala Arg Asp Lys Val Thr Asn Glu Thr Ile Ala Leu
20 25 30
Lys Lys Ile Arg Leu Glu Gln Glu Asp Glu Gly Val Pro Ser Thr Ala
35 40 45
Ile Arg Glu Ile Ser Leu Leu Lys Glu Met His His Gly Asn Ile Val
50 55 60
Arg Leu His Asp Val Ile His Ser Glu Lys Arg Ile Tyr Leu Val Phe
65 70 75 80
Glu Tyr Leu Asp Leu Asp Leu Lys Lys Phe Met Asp Ser Cys Pro Glu
85 90 95
Phe Ala Lys Asn Pro Thr Leu Ile Lys Ser Tyr Leu Tyr Gln Ile Leu
100 105 110
Arg Gly Val Ala Tyr Cys His Ser His Arg Val Leu His Arg Asp Leu
115 120 125
Lys Pro Gln Asn Leu Leu Ile Asp Arg Arg Thr Asn Ala Leu Lys Leu
130 135 140
Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Ala Phe Gly Ile Pro Val Arg Thr Phe
145 150 155 160
Thr His Glu Val Val Thr Leu Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Ile Leu Leu
165 170 175
Gly Ser Arg Gln Tyr Ser Thr Pro Val Asp Met Trp Ser Val Gly Cys
180 185 190
Ile Phe Ala Glu Met Val Asn Gln Lys Pro Leu Phe Pro Gly Asp Ser
195 200 205
Glu Ile Asp Glu Leu Phe Lys Ile Phe Arg Val Leu Gly Thr Pro Asn
210 215 220
Glu Gln Ser Trp Pro Gly Val Ser Ser Leu Pro Asp Tyr Lys Ser Ala
225 230 235 240
Phe Pro Lys Trp Gln Ala Gln Asp Leu Ala Thr Ile Val Pro Thr Leu
245 250 255
Asp Pro Ala Gly Leu Asp Leu Leu Ser Lys Met Leu Arg Tyr Glu Pro
260 265 270
Asn Lys Arg Ile Thr Ala Arg Gln Ala Leu Glu His Glu Tyr Phe Lys
275 280 285
Asp Leu Glu Met Val Gln
290
<210>9
<211>294
<212>PRT
<213>稻
<400>9
Met Glu Gln His Glu Lys Glu Glu Lys Ile Gly Glu Gly Thr Tyr Gly
1 5 10 15
Val Val Tyr Arg Ala Arg Asp Lys Val Thr Asn Glu Thr Ile Ala Leu
20 25 30
Lys Lys Ile Arg Leu Glu Gln Glu Asp Glu Gly Val Pro Ser Tnr Ala
35 40 45
Ile Arg Glu Ile Ser Leu Leu Lys Glu Met His His Gly Asn Ile Val
50 55 60
Arg Leu His Asp Val Ile His Ser Glu Lys Arg Ile Tyr Leu Asp Phe
65 70 75 80
Glu Tyr Leu Asp Leu Asp Leu Lys Lys Phe Met Asp Ser Cys Pro Glu
85 90 95
Phe Ala Lys Asn Pro Thr Leu Ile Lys Ser Tyr Leu Tyr Gln Ile Leu
100 105 110
Arg Gly Val Ala Tyr Cys His Ser His Arg Val Leu His Arg Asp Leu
115 120 125
Lys Pro Gln Asr Leu Leu Ile Asp Arg Arg Thr Asn Ala Leu Lys Leu
130 135 140
Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Thr Phe Gly Ile Pro Val Arg Thr Phe
145 150 155 160
Thr His Glu Val Val Thr Leu Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Ile Leu Leu
165 170 175
Gly Ser Arg Gln Tyr Ser Thr Pro Val Asp Met Trp Ser Val Gly Cys
180 185 190
Ile Phe Ala Glu Met Val Asn Gln Lys Pro Leu Phe Pro Gly Asp Ser
195 200 205
Glu Ile Asp Glu Leu Phe Lys Ile Phe Arg Val Leu Gly Thr Pro Asn
210 215 220
Glu Gln Ser Trp Pro Gly Val Ser Ser Leu Pro Asp Tyr Lys Ser Ala
225 230 235 240
Phe Pro Lys Trp Gln Ala Gln Asp Leu Ala Thr Ile Val Pro Thr Leu
245 250 255
Asp Pro Ala Gly Leu Asp Leu Leu Ser Lys Met Leu Arg Tyr Glu Pro
260 265 270
Asn Lys Arg Ile Thr Ala Arg Gln Ala Leu Glu His Glu Tyr Phe Lys
275 280 285
Asp Leu Glu Met Val Gln
290
<210>l0
<211>294
<212>PRT
<213>稻
<400>10
Met Glu Gln Tyr Glu Lys Glu Glu Lys Ile Gly Glu Gly Thr Tyr Gly
1 5 10 15
Val Val Tyr Arg Ala Arg Asp Lys Val Thr Asn Glu ThA Thr Ala Leu
20 25 30
Lys Lys Ile Arg Leu Glu Gln Glu Asp Glu Gly Val Pro Ser Thr Ala
35 40 45
Ile Arg Glu Ile Ser Leu Leu Lys Glu Met His His Gly Asn Ile Val
50 55 60
Arg Leu His Asp Val Ile His Ser Glu Lys Arg Ile Tyr Leu Val Phe
65 70 75 80
Glu Tyr Leu Asp Leu Asp Leu Lys Lys Phe Met Asp Ser Cys Pro Glu
85 90 95
Phe Ala Lys Asn Pro Thr Leu Ile Lys Ser Tyr Leu Tyr Gln Ile Leu
100 105 110
Arg Gly Val Ala Tyr Cys His Ser His Arg Val Leu His Arg Asp Leu
115 120 125
Lys Pro Gln Asn Leu Leu Ile Asp Arg Arg Thr Asn Ala Leu Lys Leu
130 135 140
Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Ala Phe Gly Ile Pro Val Arg Thr Phe
145 150 155 160
Thr His Glu Val Val Thr Leu Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Ile Leu Leu
165 170 175
Gly Ser Arg Gln Tyr Ser Thr Pro Val Asp Met Trp Ser Val Gly Cys
180 185 190
Ile Phe Ala Glu Met Val Asn Gln Lys Pro Leu Phe Pro Gly Asp Ser
195 200 205
Glu Ile Asp Glu Leu Phe Lys Ile Phe Arg Val Leu Gly Thr Pro Asn
210 215 220
Glu Gln Ser Trp Pro Gly Val Ser Ser Leu Pro Asp Tyr Lys Ser Ala
225 230 235 240
Phe Pro Lys Trp Gln Ala Gln Asp Leu Ala Thr Ile Val Pro Thr Leu
245 250 255
Asp Pro Ala Gly Leu Asp Leu Leu Ser Lys Met Leu Arg Tyr Glu Pro
260 265 270
Asn Lys Arg Ile Thr Ala Arg Gln Ala Leu Glu His Glu Tyr Phe Lys
275 280 285
Asp Leu Glu Met Val Gln
290
<210>11
<211>294
<212>PRT
<213>稻
<400>11
Met Glu Gln Tyr Va1 Lys Glu Glu Lys Ile Gly Glu Gly Thr Tyr Gly
l 5 10 15
Val Val Tyr Arg Ala Arg Asp Lys Val Thr Asn Glu Thr Ile Ala Leu
20 25 30
Lys Lys Ile Arg Leu Glu Gln Glu Asp Glu Gly Val Pro Ser Thr Ala
35 40 45
Ile Arg Glu Ile Ser Leu Leu Lys Glu Met His His Gly Asn Ile Val
50 55 60
Arg Leu His Asp Val Ile His Ser Glu Lys Arg Ile Tyr Leu Val Phe
65 70 75 80
Glu Tyr Leu Asp Leu Asp Leu Lys Lys Phe Met Asp Ser Cys Pro Glu
85 90 95
Phe Ala Lys Asn Pro Thr Leu Ile Lys Ser Tyr Leu Tyr Gln Ile Leu
100 105 110
Arg Gly Val Ala Tyr Cys His Ser His Ser Val Leu His Arg Asp Leu
115 120 125
Lys Pro Gln Asn Leu Leu Ile Asp Arg Arg Thr Asn Ala Leu Glu Leu
130 135 140
Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Ala Phe Gly Ile Pro Val Arg Thr Phe
145 150 155 160
Thr His Glu Val Val Thr Leu Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Ile Leu Leu
165 170 175
Gly Ser Arg Gln Tyr Ser Thr Pro Val Asp Met Trp Ser Val Gly Cys
180 185 190
Ile Phe Ala Glu Met Val Asn Gln Lys Pro Leu Phe Pro Gly Asp Ser
195 200 205
Glu Ile Asp Glu Leu Phe Lys Ile Phe Arg Val Leu Gly Thr Pro Asn
210 215 220
Glu Gln Ser Trp Pro Gly Val Ser Ser Leu Pro Asp Tyr Lys Ser Ala
225 230 235 240
Phe Pro Lys Trp Gln Ala Gln Asp Leu Ala Thr Ile Val Pro Thr Leu
245 250 255
Asp Pro Ala Gly Leu Asp Leu Leu Ser Lys Met Leu Arg Tyr Glu Pro
260 265 270
Asn Lys Arg Ile Thr Ala Arg Gln Ala Leu Glu His Glu Tyr Phe Lys
275 280 285
Asp Leu Glu Met Val Gln
290
<210>12
<211>294
<212>PRT
<213>稻
<400>12
Met Glu GIn Tyr Glu Lys Glu Glu Lys Ile Gly Glu Gly Thr Tyr Gly
1 5 10 15
Val Val Tyr Arg Ala Arg Asp Lys Val Thr Asn Glu Thr Ile Ala Leu
20 25 30
Lys Lys Ile Arg Leu Glu Gln Glu Asp Glu Gly Val Pro Ser Thr Ala
35 40 45
Ile Arg Glu Ile Ser Leu Leu Lys Glu Met His His Gly Asn Ile Val
50 55 60
Arg Leu His Asp Val Ile His Ser Glu Lys Arg Ile Tyr Leu Val Phe
65 70 75 80
Glu Tyr Leu Asp Leu Asp Leu Lys Lys Phe Met Asp Ser Cys Pro Glu
85 90 95
Phe Ala Lys Asn Pro Thr Leu Ile Lys Ser Tyr Leu Tyr Gln Ile Leu
100 105 110
Arg Gly Val Ala Tyr Cys His Ser His Arg Val Leu His Arg Asp Leu
115 120 125
Lys Pro Gln Asn Leu Leu Ile Asp Arg Arg Thr Asn Ala Leu Lys Leu
130 135 140
Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Ala Phe Arg Ile Pro Val Arg Thr Phe
145 150 155 160
Thr His Glu Val Val Thr Leu Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Ile Leu Leu
165 170 175
Gly Ser Arg Gln Tyr Ser Thr Pro Val Asp Met Trp Ser Val Gly Cys
180 185 190
Ile Phe Ala Glu Met Val Asn Gln Lys Pro Leu Phe Pro Gly Asp Ser
195 200 205
Glu Ile Asp Glu Leu Phe Lys Ile Phe Arg Val Leu Gly Thr Pro Asn
210 215 220
Glu Gln Ser Trp Pro Gly Val Ser Ser Leu Pro Asp Tyr Lys Ser Ala
225 230 235 240
Phe Pro Lys Trp Gln Ala Gln Asp Leu Ala Thr Ile Val Pro Thr Leu
245 250 255
Asp Pro Ala Gly Leu Asp Leu Leu Ser Lys Met Leu Arg Tyr Glu Pro
260 265 270
Asn Lys Arg Ile Thr Ala Arg Gln Ala Leu Glu His Glu Tyr Phe Lys
275 280 285
Asp Leu Glu Met Val Gln
290
<210>13
<211>294
<212>PRT
<213>稻
<400>13
Met Glu Pro Tyr Glu Lys Glu Glu Lys Ile Gly Glu Gly Thr Tyr Gly
1 5 10 15
Val Val Tyr Arg Ala Arg Asp Lys Val Thr Asn Glu Thr Ile Ala Leu
20 25 30
Lys Lys Ile Arg Leu Ala Gln Glu Asp Glu Gly Val Pro Ser Thr Ala
35 40 45
Ile Arg Glu Ile Ser Leu Leu Lys Glu Met His His Gly Asn Ile Val
50 55 60
Arg Leu His Asp Val Ile His Ser Glu Lys Arg Ile Tyr Leu Val Phe
65 70 75 80
Glu Tyr Leu Asp Leu Asp Leu Lys Lys Phe Met Asp Ser Cys Pro Glu
85 90 95
Phe Ala Lys Asn Pro Thr Leu Ile Lys Ser Tyr Leu Tyr Gln Ile Leu
100 105 110
Arg Gly Val Ala Tyr Cys His Ser His Arg Val Leu His Arg Asp Leu
115 120 125
Lys Pro Gln Asn Leu Leu Ile Asp Leu Arg Thr Asn Ala Leu Lys Leu
130 135 140
Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Ala Phe Gly Ile Pro Val Arg Thr Phe
145 150 155 160
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165 170 175
Gly Ser Arg Gln Tyr Ala Thr Pro Val Asp Met Trp Ser Val Gly Cys
180 185 190
Thr Phe Ala Glu Met Val Asn Gln Lys Pro Leu Phe Pro Gly Asp Ser
195 200 205
Glu Ile Asp Glu Leu Phe Lys Ile Phe Arg Val Leu Gly Thr Pro Asn
210 215 220
Glu Gln Ser Trp Pro Gly Val Ser Ser Leu Pro Asp Tyr Lys Ser Ala
225 230 235 240
Phe Pro Lys Trp Gln Ala Gln Asp Leu Ala Thr Ile Val Pro Thr Leu
245 250 255
Asp Pro Ala Gly Leu Asp Leu Leu Ser Lys Val Leu Arg Tyr Glu Pro
260 265 270
Asn Lys Arg Ile Thr Ala Gln Gln Ala Leu Glu His Glu Tyr Phe Lys
275 280 285
Asp Leu Glu Met Val Gln
290
<210>14
<211>1243
<212>DNA
<213>稻
<400>14
aaaaccaccg agggacctga tctgcaccgg ttttgatagt tgagggaccc gttgtgtctg 60
gttttccgat cgagggacga aaatcggatt cggtgtaaag ttaagggacc tcagatgaac120
ttattccgga gcatgattgg gaagggagga cataaggccc atgtcgcatg tgtttggacg180
gtccagatct ccagatcact cagcaggatc ggccgcgttc gcgtagcacc cgcggtttga240
ttcggcttcc cgcaaggcgg cggccggtgg ccgtgccgcc gtagcttccg ccggaagcga300
gcacgccgcc gccgccgacc cggctctgcg tttgcaccgc cttgcacgcg atacatcggg360
atagatagct actactctct ccgtttcaca atgtaaatca ttctactatt ttccacattc420
atattgatgt taatgaatat agacatatat atctatttag attcattaac atcaatatga480
atgtaggaaa tgctagaatg acttacattg tgaattgtga aatggacgaa gtacctacga540
tggatggatg caggatcatg aaagaattaa tgcaagatcg tatctgccgc atgcaaaatc600
ttactaattg cgctgcatat atgcatgaca gcctgcatgc gggcgtgtaa gcgtgttcat660
ccattaggaa gtaaccttgt cattacttat accagtacta catactatat agtattgatt720
tcatgagcaa atctacaaaa ctggaaagca ataagaaata cgggactgga aaagactcaa780
cattaatcac caaatatttc gccttctcca gcagaatata tatctctcca tcttgatcac840
tgtacacact gacagtgtac gcataaacgc agcagccagc ttaactgtcg tctcaccgtc900
gcacactggc cttccatctc aggctagctt tctcagccac ccatcgtaca tgtcaactcg960
gcgcgcgcac aggcacaaat tacgtacaaa acgcatgacc aaatcaaaac caccggagaa 1020
gaatcgctcc cgcgcgcggc ggcgacgcgc acgtacgaac gcacgcacgc acgcccaacc 1080
ccacgacacg atcgcgcgcg acgccggcga caccggccgt ccacccgcgc cctcacctcg 1140
ccgactataa atacgtaggc atctgcttga tcttgtcatc catctcacca ccaaaaaaaa 1200
aaggaaaaaa aaacaaaaca caccaagcca aataaaagcg aca 1243
<210>15
<211>2191
<212>DNA
<213>稻
<400>15
aatccgaaaa gtttctgcac cgttttcacc ccctaactaa caatataggg aacgtgtgct 60
aaatataaaa tgagacctta tatatgtagc gctgataact agaactatgc aagaaaaact120
catccaccta ctttagtggc aatcgggcta aataaaaaag agtcgctaca ctagtttcgt180
tttccttagt aattaagtgg gaaaatgaaa tcattattgc ttagaatata cgttcacatc240
tctgtcatga agttaaatta ttcgaggtag ccataattgt catcaaactc ttcttgaata300
aaaaaatctt tctagctgaa ctcaatgggt aaagagagag atttttttta aaaaaataga360
atgaagatat tctgaacgta ttggcaaaga tttaaacata taattatata attttatagt420
ttgtgcattc gtcatatcgc acatcattaa ggacatgtct tactccatcc caatttttat480
ttagtaatta aagacaattg acttattttt attatttatc ttttttcgat tagatgcaag540
gtacttacgc acacactttg tgctcatgtg catgtgtgag tgcacctcct caatacacgt600
tcaactagca acacatctct aatatcactc gcctatttaa tacatttagg tagcaatatc660
tgaattcaag cactccacca tcaccagacc acttttaata atatctaaaa tacaaaaaat720
aattttacag aatagcatga aaagtatgaa acgaactatt taggtttttc acatacaaaa780
aaaaaaagaa ttttgctcgt gcgcgagcgc caatctccca tattgggcac acaggcaaca840
acagagtggc tgcccacaga acaacccaca aaaaacgatg atctaacgga ggacagcaag900
tccgcaacaa ccttttaaca gcaggctttg cggccaggag agaggaggag aggcaaagaa960
aaccaagcat cctcctcctc ccatctataa attcctcccc ccttttcccc tctctatata 1020
ggaggcatcc aagccaagaa gagggagagc accaaggaca cgcgactagc agaagccgag 1080
cgaccgcctt cttcgatcca tatcttccgg tcgagttctt ggtcgatctc ttccctcctc 1140
cacctcctcc tcacagggta tgtgcccttc ggttgttctt ggatttattg ttctaggttg 1200
tgtagtacgg gcgttgatgt taggaaaggg gatctgtatc tgtgatgatt cctgttcttg 1260
gatttgggat agaggggttc ttgatgttgc atgttatcgg ttcggtttga ttagtagtat 1320
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gattttgtga taccttttgt ttgaggtaaa atcagagcac cggtgatttt gcttggtgta 1440
ataaaagtac ggttgtttgg tcctcgattc tggtagtgat gcttctcgat ttgacgaagc 1500
tatcctttgt ttattcccta ttgaacaaaa ataatccaac tttgaagacg gtcccgttga 1560
tgagattgaa tgattgattc ttaagcctgt ccaaaatttc gcagctggct tgtttagata 1620
cagtagtccc catcacgaaa ttcatggaaa cagttataat cctcaggaac aggggattcc 1680
ctgttcttcc gatttgcttt agtcccagaa ttttttttcc caaatatctt aaaaagtcac 1740
tttctggttc agttcaatga attgattgct acaaataatg cttttatagc gttatcctag 1800
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ttctgatctc catttttaat tatatgaaat gaactgtagc ataagcagta ttcatttgga 1920
ttattttttt tttagctctc accccttcat tattctgagc tgaaagtctg gcatgaactg 1980
tcctcaattt tgttttcaaa ttcacatcga ttatctatgc attatcctct tgtatctacc 2040
tgtagaagtt tctttttggt tattccttga ctgcttgatt acagaaagaa atttatgaag 2100
ctgtaatcgg gatagttata ctgcttgttc ttatgattca tttcctttgt gcagttcttg 2160
gtgtagcttg ccactttcac cagcaaagtt c 2191
<210>16
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>有义引物prm0350
<400>16
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggag aagtacgaga agctaga57
<210>17
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义引物prm0351
<400>17
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt cagaactgag acttgtcaag g 51
<210>18
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>有义引物prm439
<400>18
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggag aaatacgaga agctc 55
<210>19
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义引物prm440
<400>19
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg gtcagaactg agatttgtc 49
<210>20
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>有义引物prm2213
<400>20
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggac aacaatggag ttaa 54
<210>21
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义引物prm2214
<400>21
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt cagagagagg acttgtcag 49
权利要求
1.改良选自增加产量、增加生长速度和改变的结构中的一种或多种植物生长特性的方法，所述方法包括在植物中增加编码B型CDK蛋白的核酸的表达，和/或增加植物中B型CDK蛋白的活性和/或水平。
2.根据权利要求1中所述的方法，其中所述增加表达是通过在植物中导入和表达B型CDK核酸来实现。
3.根据权利要求1或2中所述的方法，其中所述B型CDK来自植物、藻类或真菌来源。
4.根据权利要求3中所述的方法，其中所述来自植物的B型CDK优选来自双子叶植物，进一步优选来自十字花科，更优选该核酸序列来自鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述B型CDK是1类B型CDK，优选来自鼠耳芥的CDK B1；1或来自鼠耳芥的CDK B1；2。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述B型CDK是2类B型CDK，优选来自鼠耳芥的CDK B2；2。
7.根据权利要求5中所述的方法，其中所述CDK B1；1核酸是SEQID NO1代表的序列或其部分序列，或可以与其杂交的核酸序列，并且其中CDK B1；1蛋白是SEQ ID NO2代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。
8.根据权利要求5中所述的方法，其中所述CDK B1；2核酸是SEQ ID NO3代表的序列或其部分序列，或可以与其杂交的核酸序列，并且其中CDK B1；2蛋白是SEQ ID NO4代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。
9.根据权利要求6中所述的方法，其中所述CDK B2；2核酸是SEQ ID NO5代表的序列或其部分序列，或可以与其杂交的核酸序列，并且其中CDK B2；2蛋白是SEQ ID NO6代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述B型CDK是选自下列的核酸变体或氨基酸变体
(a)B型CDK核酸/基因的功能部分；
(b)能够与B型CDK核酸/基因杂交的序列；
(c)B型CDK核酸/基因的可变剪接变体；
(d)B型CDK核酸/基因的等位基因变体；
(e)B型CDK蛋白的同源物、衍生物或活性片段；
(f)突变的B型CDK。
11.根据权利要求5至10中任一项所述的方法，其中所述CDK B1；1核酸的表达是由在未成熟的膨胀组织中有活性的启动子驱动的，优选所述启动子是β-苹果青霉素启动子。
12.根据权利要求5至10中任一项所述的方法，其中所述CDK B1；2核酸的表达和其中所述CDK B2；2核酸的表达是由组成型启动子驱动的，优选其中所述启动子是GOS2启动子。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述增加产量包括以下中的一种或多种相对于对照植物，增加面积、增加圆锥花序的数量、增加高度、增加种子的数量、增加饱满种子的数量、增加种子的总重量、增加千粒重(TKW)和增加收获系数。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述改变的结构包括以下中的一种或多种地上面积的增加、圆锥花序数量的增加和高度的增加。
15.可由权利要求1至14中任一项所述的方法得到的植物。
16.构建体，包含
(a)编码B型CDK蛋白的B型CDK基因/核酸；或
(b)编码CDK突变体的核酸，该CDK突变体包含表A中所示的七个氨基酸位置改变中的至少一个，或表B中所示的八个氨基酸位置改变中的至少一个；
(c)能够驱动(a)或(b)的核酸表达的一个或多个控制序列；和任选
(d)转录终止序列。
17.根据权利要求16中所述的构建体，其中所述(a)中的核酸是SEQ ID NO3代表的CDK B1；2核酸或其部分，或可以与其杂交的核酸序列，并且所述核酸编码CDK B1；2蛋白，所述蛋白是SEQ ID NO4代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。
18.根据权利要求16中所述的构建体，其中所述(a)中的核酸是SEQ ID NO5代表的CDK B2；2核酸或其部分，或可以与其杂交的核酸序列，并且所述核酸编码CDK B2；2蛋白，所述蛋白是SEQ ID NO6代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的构建体，其中所述的控制序列包含组成型启动子，优选是GOS2启动子。
20.生产具有选自增加产量、增加生长速度和改变的结构中的一种或多种的改良的植物生长特性的转基因植物的方法，该生长特性相对于对应的野生型植物的生长特性而被改良，所述方法包括以下步骤
(a)在植物或植物细胞中导入B型CDK基因/核酸；或
(b)编码CDK突变体的核酸，该CDK突变体包括表A中显示的七个氨基酸位置改变中的至少一个；
(c)在促进再生和成熟植物生长的条件下培养所述的植物细胞。
21.具有选自增加产量、增加生长速度和改变的结构中的一种或多种的改良植物生长特性的转基因植物，其特征在于所述植物相对于对应的野生型植物，在植物中具有B型CDK核酸的增加表达，和/或植物中B型CDK蛋白的增加的活性和/或水平。
22.根据权利要求21中所述的转基因植物，其中所述植物是单子叶植物。
23.CDK B型核酸或CDK B型氨基酸在改良植物的生长特性中的应用，所述生长特性选自增加产量、增加生长速度和改变的结构中的一种或多种。
24.用作生长调节物的组合物，包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO6代表的蛋白质，或前述序列中任一个的同源物、衍生物或活性片段。
25.鉴定相对于对应的未突变植物CDK，具有提高的CDK活性的突变植物细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)的筛选方法，所述方法包括以下步骤
(a)提供植物来源的CDK突变体；
(b)鉴定细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶的抑制剂(ICK)不反应的突变体；
(c)鉴定具有细胞周期蛋白结合活性的突变体；并且可选地接有，
(d)步骤(b)和(c)中得到的突变体的酵母互补测试。
26.鉴定基本没有活性，但能够结合植物ICK的植物CDK的筛选方法，其包括以下步骤
(i)提供植物来源的CDK突变体；
(ii)鉴定植物来源的ICK结合的突变体；和
(iii)鉴定非细胞周期蛋白结合的突变体。
27.根据权利要求25或26中所述的筛选方法，其中所述CDK突变体由以下步骤提供
(i)提供野生型植物CDK；和
(ii)在至少一个氨基酸位置上突变所述CDK。
28.根据权利要求25或27中所述的筛选方法可得到的突变CDK，其中所述突变CDK如表A所示。
29.根据权利要求26或27中所述的筛选方法可得到的突变CDK，其中所述突变CDK如表B所示。
30.分离的核酸分子，其包含
(a)SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12和SEQ ID NO13中任一个代表的CDK突变体的编码核酸；
(b)SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12和SEQ ID NO13中任一个代表的CDK突变体的同源物、衍生物或活性片段的编码核酸，该同源物、衍生物或活性片段包含表A中所示的七个氨基酸位置改变中的至少一个，或表B中所示的八个氨基酸位置改变中的至少一个；
(c)能够与上面(a)或(b)中的核酸杂交的核酸，其中该杂交序列编码的氨基酸包含表A中所示的七个氨基酸位置改变中的至少一个，或表B中所示的八个氨基酸位置改变中的至少一个；
(d)由于遗传密码子所致的上面(a)至(c)的核酸的简并核酸；
(e)(a)至(d)的核酸的等位基因变体，该等位基因变体编码的氨基酸包含表A中所示的七个氨基酸位置改变中的至少一个，或表B中所示的八个氨基酸位置改变中的至少一个；和
(f)(a)至(e)的核酸的可变剪接变体，该可变剪接变体编码的氨基酸包含表A中所示的七个氨基酸位置改变中的至少一个，或表B中所示的八个氨基酸位置改变中的至少一个。
31.CDK突变体，包含
(a)SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12和SEQ ID NO13中任一个代表的氨基酸；和
(b)SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12和SEQ ID NO13代表的氨基酸的片段，该片段包含表A中所示的七个氨基酸位置改变中的至少一个，或表B中所示的八个氨基酸位置改变中的至少一个。
全文摘要
本发明涉及通过调节植物中B型CDK核酸的表达，和/或通过调节植物中B型CDK蛋白的活性和/或水平来改变植物生长特性的方法。本发明也涉及具有改变的生长特性的转基因植物，该植物相对于对应的野生型的植物中的表达、活性和/或水平，具有调节的植物中B型CDK核酸的表达，和/或调节的B型CDK蛋白的活性和/或水平。本发明还提供了新的筛选方法，鉴定相对于对应的未突变CDK具有提高了CDK活性的CDK突变体。本发明同时提供了新的筛选方法，鉴定能够结合CKI(细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂)的无活性CDK。本发明还提供通过本发明的筛选方法得到的CDK突变体。
文档编号A01H5/00GK1845997SQ20048002544
公开日2006年10月11日 申请日期2004年9月3日 优先权日2003年9月5日
发明者W·布罗科特, V·弗兰卡德, Y·哈茨菲尔德, V·米罗诺夫 申请人:作物培植股份有限公司