具有改良生长特性的植物及其制备方法

专利名称：：具有改良生长特性的植物及其制备方法
技术领域：
：本发明一般地涉及分子生物学领域，并涉及相对于相应的野生型植物或其他对照植物改良植物生长特性的方法。更具体地，本发明涉及改良植物生长特性的方法，包括调节植物中I类同源域亮氨酸拉链迈omeo這omainleucine-pper,HDZip)hox5多肽或其同源物编码核酸的表逸或包括调节植物中硝酸盐转运蛋白(NRT)或其同源物编码核酸的表达；或包括调节植物中命名为增产蛋白质16(XieldEnhancing￡rotein16，下文称为YEP16)的多肽或其同源物编码核酸的表达；或包括调节植物中i型糖原合酶激酶(I型shaggy样激酶)或其同源物编码核酸的表达。本发明还涉及具有调节的I类HDZiphox5多肽或其同源物编码核酸表达的植物；或具有调节的NRT多肽或其同源物编码核酸表达的植物；或具有调节的YEP16编码核酸表达的植物；或具有调节的I型shaggy样激酶或其同源物编码核酸表达的植物；所述植物相对于相应的野生型或其他对照植物具有改良的植物生长特性。本发明还提供在发明方法中有用的构建体。
背景技术：
：鉴于世界人口不断增长而农业可耕种土地面积逐渐缩小，激起提高农业效率方面的研究。作物和园艺改良的常规方法是利用选育技术来鉴定具有期望特性的植物。然而，这样的选育技术有若干缺点，即这些技术通常是劳动密集型的，并且产生通常含有异源遗传组分的植物，这些遗传组分并非总是产生从亲本植物遗传的期望性状。分子生物学的i^艮已经允许人类改造动物和植物的种质(germplasm)。植物遗传工程需要分离和操作遗传物质(通常为DNA或RNA的形式)及随后将所述遗传物质引入植物。这样的技术能够提供具有多种改良的经济、农业或园艺性状的作物或植物。特别具有经济利益的性状是产率。产率通常定义为来自作物经济价值的可测量产出。其可以根据数量和/或质量来定义。产率直接取决于几种因素，例如器官的数量和大小，植物构造(例如分枝数)，种子产量，叶衰老等等。根的发育，营养吸收和胁迫耐受性也是决定产率的重要因素。因此优化上述因素之一可以有助于增加作物的产率。种子产率是尤其重要的性状，原因在于许多植物的种子对于人类和动物营养至关重要。诸如谷物、稻类、小麦、芸苔和大豆的作物占人类总卡路里摄取量的一半以上，不论是通过种子本身的直接消耗，还是通过由加工的种子所飼养的肉类产品的消耗。它们也是工业加工所用的糖类、油类和多类代谢物的来源。种子含有胚(新的芽和根的来源)和胚乳(在萌发和幼苗早期生长过程中胚生长的营养源)。种子的发育涉及许多基因，并且需要代谢物自根、叶和茎转移至正在生长的种子。特别是胚乳，吸收糖类、油类和蛋白质的代谢前体，将其合成为贮存高分子，以使谷粒长大。特别具有经济利益的另一性状在于具有提高的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是导致全世界作物损失的首要原因，使大多数主要作物植物的平均产率下降超过50%(Wang等，Planta(2003)218:1-14)。非生物胁迫可以因千旱、盐度、极端温度、化学毒性和氧化胁迫而引起。提高植物非生物胁迫耐受性的能力将对全世界的农场主带来重大的经济利益，并将^f吏我们能够在不利条件下以及在否则将不可能栽培作物的地域来栽培作物。增加植物种子产率的能力将在诸如农业等领域中具有许多应用，包括观赏植物的生产、树木栽培、园艺和森林业。增加产率也可以用于在生物反应器中使用的藻类生产(用于诸如药物、抗体或疫苗等物质的生物技术生产，或用于有机废物的生物转化)及其它这类领域。
背景技术：
：同源域亮氨酸拉链(HDZip)蛋白构成转录因子家族，其特征在于存在DNA结合结构域(HD)和邻近的亮氨酸拉链(Zip)基序。同源域通常包括60个保守的氨基酸残基，形成与DNA结合的螺旋1-环-螺旋2-转角-螺旋3。此DNA结合位点通常为假回文结构。亮氨酸拉链邻近于同源域的C-末端，包括几个七肽重复单位(至少4个)，其中通常每隔6个氨基酸就出现亮氨酸(偶尔为缬氨酸或异亮氨酸)。亮氨酸拉链对于蛋白质二聚化非常重要。二聚化是DNA结合的前提条件(Sessa等(1993)EMBOJ12(9):3507-3517)，并且可以发生在两个相同的HDZip蛋白之间(同源二聚体)，或者两个不同的HDZip蛋白之间(异源二聚体)。同源域基因存在于所有真核细胞中，并构成拟南芥04^|6/甴/^&沩fl/iVimi)中至少89个成员的基因家族。亮氨酸拉链本身也见于除植物外的真核细胞中。不过，同源域和亮氨酸拉链两者同时存在却是植物所特有的(在拟南芥89个蛋白质中的至少47个中发现)，并且除了维管束植物之外，还已经在藓类植物(moss)中遇到(Sakakibara等(2001)MolBiolEvol18(4):491-502)。亮氨酸拉链则位于同源域的C-末端，这两个要素特征彼此重叠3个氨基酸。基于序列相似性标准，已将拟南芥HDZip基因分为四个不同的类另iJ:HDZipI至IV(Sessa等(1994)InPlantMolecBiol，412-426页)。同其他三类HDZip蛋白一样，I类HDZip蛋白在同源域和亮氨酸拉链以外的一级氛基酸结构方面差异相当大。I类HDZip蛋白的特征还在于同源域和亮氨酸拉链内的两个特定特征1)在同源域中，除了不变的氨基酸LeuwTrp48Phe49Asi^Arg53之外，第46位为Ala(A)，而第56位为Try(W)(或者偶尔为Phe(F))(Sessa等(1997)JMolBiol274(3):303-309;见图1)，这称为I类同源域，且2)亮氨酸拉链包括6个七肽，除了呈现7个七肽的蕨类植物Omto/7teWs〃(^"^///之夕卜(每个七肽内的^立置命名为a、b、c、d、e、f和g位，保守的亮氨酸在d位；Sakakibara等(2001)MolBiolEvol18(4):491-502;见图2)。HDZipII、III和IV呈现仅具5个七肽的亮氨酸拉链。至于其DNA结合特性，I类HDZip蛋白优先结合在中心位置处重叠的5bp半位点，即CAA(A/T)ATTG(Sessa等(1993)EMBOJ12(9):3507-3517)。已证明不同的HDZip蛋白要么激活要么阻遏转录。已利用报告基因(荧光素酶；Henriksson等(2005)PlantPhys139:509-518)在拟南芥中证明I类HDZipATHB1、-5、-6和-16在拟南芥叶子的瞬时表达测定中作为转录激活因子起作用。利用另一报告基因(葡萄糖醛酸酶;Meijer等(2000)MolGenGenet263:12-21)，证明两种稻I类HDZip蛋白即Oshox4和Oshox5在稻细胞悬浮培养物的瞬时表达测定中作为激活因子起作用。相反，两种稻II类HDZip蛋白即Oshoxl和Oshox3在相同的试验中作为转录阻遏物起作用(Meijer等(1997)PlantJ11:263-276;Meijer等(2000)，同前)。已证明多种I类HDZip蛋白参与光应答并且参与脱落酸(ABA)/水缺乏相关的应答(Hjellstr6m等(20(B)PlantCellEnviron26:1127-1136)。过表达I类HDZipATHB1、-3、-13、-20和-23的转基因拟南芥表明这些基因参与调控子叶以及叶子发育(Aoyama等(1995)PlantCell7:1773-1785;Hanson(2000)ComprehensivesummariesofUppsalaDissertationsfromtheFacultyofScienceandTechnology,Uppsala)。ATHB3、-13、-20和-23基因彼此相似，并构成I类HDZip—个独特的亚类。由于当这些基因组成型表达的时候引起相似的子叶形状变化，它们被称为尖子叶c0印/^fow，POC)HDZip基因。Hanson推断在系统发生方面密切相关的I类HDZip蛋白大多数情况下在功能方面也是相关的。^^凝转运蛋^rivir)植物营固着生活，不得不依赖于土壤中的资源提供养分。土壤中的氮主要作为胺盐或硝酸盐存在。植物的氮吸收可以借助于三种NCV吸收系统进行NCV浓度大于1mM时激活的低亲和力转运系统，针对1至1mMN(V浓度的组成型及诱导型高亲和力转运系统。这三种吸收系统以复杂的方式调控。硝酸盐一经吸收，便被转运至液泡或被还原成亚硝酸盐，后者依次又在叶绿体中被进一步代谢。硝酸盐也可以在质外体(apoplasm)中再次分泌，或分泌至木质部转运至枝条(shoot)。根细胞中负责硝酸盐吸收的蛋白质(NRT，硝酸盐转运蛋白)属于所谓的主要易化子超家族(MajorFacilitatorSuperfamily)，包括参与小分子溶质转运的蛋白质，且长度通常为450至600个氨基酸，具有12个跨膜结构域。NRT蛋白被归为两个家族NRT1和NRT2(Crawford&Glass,TrendsPlantSci.3，389-395，1998),且由多基因家族编码。NRT蛋白序列高度保守，例如来自藓类植物的NRT2蛋白与来自双子叶植物的NRT2蛋白享有60%的序列同一性，在双子叶植物群中，NRT2蛋白之间的序列同一性约为81%,而单子叶NRT2蛋白的序列同一性可高达89%。Orsel等深入研究了拟南芥的NRT2家族蛋白(PlantPhysiol.129，886-896，2002)。该家族包括7个成员，分布在三条染色体上。蛋白质结构保守，且7个NRT2蛋白中的5个在初生植物的根中偏好表达。就结构而言，NRT2蛋白包括跨越蛋白质约90%的MFS一1结构域，以及C-末端跨膜结构域。MFS一1结构域本身据推测包括10或11个跨膜结构域。认为NRT2蛋白主要与高亲和力转运系统有关。在高等植物中，这种高亲和力吸收系统据认为受由NRT2和NAR组成的双蛋白复合物控制，所述NAR蛋白功能尚不清楚(Zhou等FEBSLetters466,225-227;Tong等PlantJ.41，442-450，2005)。过表达NRT2提高这种高亲和力吸收系统的能力(Fraisier等PlantJ.23，489-496)。NRT2可能也发挥硝酸盐感受器的功負fe(Little等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA102，13693-13698，2005)。Mori等研究了过表达稻7V/r2基因的转基因稻类植物，并表明硝酸盐饥饿的幼苗与野生型植物相比具有更好的N(V吸收。Good等(US20050044585V^开了氮利用蛋白质特别是转氨酶水平升高的转基因植物，处于可能是也可能不是胁迫诱导型根特异性启动子的控制之下。这些植物表现出氮吸收效率提高，但是未报道对于种子产率的影响。另外，这篇文特性。此外，尚未在正常生长条件下或就完整的植物生命周期研究过NRT蛋白。YEP16多肽与F1F0-ATP合酶中ATPase3结构域S亚基的N-末端结构域享有一定的相似性(有关8亚基的的细节，参阅InterProIPR000711)。>y/tgggv#邀凝植物shaggy样激酶由多基因家族编码。已发现拟南芥基因组含有10个shaggy样激酶编码基因，它们被归为四个不同的亚家族。不同家族成员的蛋白质序列在全部激酶结构域中高度保守，不过N-和C-末端区域差异相当大，表明多种植物shaggy样激酶参与多种多样的生物过程，例如激素信号传导、发育和胁迫应答。基于蛋白质序列的同源性，可将植物shaggy样激酶归为四型(I-IV)，其中四型中的每一型都参与不同的过程(见图13)。除了可以获得拟南芥shaggy样激酶的全长cDNA序列以外，还可以在/>共数据库中获得来自欧洲油菜(J5mw/ai/i印附)、紫花苜蓿(AfW/0^0虚/vfl)、烟草(iV/c^iVm"a6acM附)、稻(of^flsflftVfl)、矮牵牛(iV似附Vi/^n.rfa)和玉蜀黍(Ze"附tfjw)等物种的shaggy样激酶的全长cDNA序列。^KiSKl为II型拟南芥shaggy样激酶的编码基因，已经报道其补偿酵母钙调磷酸酶突变体的盐敏感表型。已经表明幼苗中同一shaggy样激酶的产生被NaCl和脱落酸诱导。已经报道J/GSK1基因的过量产生诱导胁迫应答基因和花青素累积，并改变胞内阳离子水平，从而导致盐和干旱耐受性增强。考虑到不同型的shaggy样激酶公知参与多种多样的生物过程，我们令人惊讶地发现两种不同型的shaggy样激酶参与同一生物过程即胁迫应答。我们出乎意料地发现不同于II型的其他型shaggy样激酶能够赋予植物对非生物胁迫增加的耐受性。现已发现，调节植物中I类HDZiphox5多肽或其同源物编码核酸的表达；或调节植物中硝酸盐转运蛋白(NRT)或其同源物编码核酸的表达；或调节才直物中YEP16多肽编码核酸的表达；或调节植物中I型shaggy样激酶或其同源物的表达，使植物相对于相应的野生型植物或其他对照植物具有改良的植物生长特性。
发明内容本发明因此提供了改良植物生长特性的方法，包括调节植物中I类HDZiphox5多肽或其同源物编码核酸的表达；或包括调节植物中NRT或其同源物编码核酸的表达；或包括调节植物中YEP16多肽编码核酸的表达；或包括调节植物中I型shaggy样激酶或其同源物的表达。选择合适的对照植物是实验设置的常规部分，并且可以包括相应的野生型植物或不含目的基因的相应植物。对照植物通常为同一植物物种，或者甚至与待评估植物为同一品种。对照植物还可以是待评估植物的无效合子(nullizygote)。如本文所用的"对照植物"不仅指完整植物，而且指植物部分，包括种子和种子部分。有利地，实施根据本发明的方法产生相对于相应的野生型植物或其他对照植物生长特性改良的植物，特别是产率增加、生长改良、生物量改良、构造改良、细胞分裂改良和非生物胁迫耐受性提高中的一个或多个方面。文中所定义的术语"增加的产率"是指以下任意一个或多个方面的增加，每种都相对于相应的野生型或其他对照植物而言(i)植物一个或多个部分，特别是地上(可收获)部分增加的生物量(重量)，或增加的根生物量，增加的根体积，增加的根数量，增加的根直径或增加的根长度(粗根或细根)，或任何其它可收获部分增加的生物量；(ii)增加的种子总产率，这包括种子生物量(种子重量)的增加，并且其可以是每棵植抹或单粒种子基础上的种子重量增加和/或每公项或每英亩种子重量的增加；(m)增加的每个圆锥花序的花(小花floret)的数量，其表达为饱满种子数占初期(primary)圆锥花序数的比率；(iv)增加的种子饱满率(以百分比表示，为饱满种子数占小花数的比例)；(v)增加的(饱满)种子数量；(vi)增加的种子大小，这也可以影响种子的組成；(vii)增加的种子体积，这也可以影响种子的组成(包括油、蛋白质和糖的总含量和组成)；(viii)增加的(单个或平均)种子面积；(ix)增加的(单个或平均)种子长度；(x)增加的(单个或平均)种子宽度；(x)增加的(单个或平均)种子周长；(xi)增加的收获指数(HI)，其表达为可收获部分如种子的产率占总生物量的比率；和(xii)增加的千粒重(TKW)，这通过计数饱满种子数量及其总重量外推得到。增加的TKW可来自于种子大小和/或种子重量的增加。增加的TKW还可以来自胚大小和/或胚乳大小的增加。以谷物为例，产率增加可以表现为以下一个或多个方面每公项或每英亩建立的植物数量的增加，每棵植林谷穗数量的增加，行数、行粒数、粒重量、千粒重、谷穗长度/直径的增加，种子饱满率(其为饱满种子数除以种子总数乘以100)的增加，等等。以稻为例，产率增加可以表现为以下一个或多个方面每公项或每英亩的植物数量、每棵植抹的圆锥花序数量、每个圆锥花序的小穗数量、每个圓锥花序的花朵(小花)数量(其表达为饱满种子数占初期圆锥花序的比率)、种子饱满率(其为饱满种子数除以种子总数乘以100)的增加、千粒重的增加，等等。由于本发明的转基因植物具有增加的产率，相对于对照植物在其生命周期相应阶段的生长速率而言，这些植物可能呈现增加的生长速率(至少在其部分生命周期中)。增加的生长速率可以是植物的一个或多个部分(包括种子)特有的，或者可以基本上遍及整抹植物。具有增加生长速率的植物可以具有更短的生命周期。植物的生命周期可以理解为表示从成熟干种子生长至植物产生类似于起始材料的成熟干种子阶段所需的时间。此生命周期可以受到诸如早期活力、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度等因素的影响。生长速率的增加可以出现在植物生命周期的一个或多个阶段，或者出现在基本上整个植物生命周期的过程中。在植物生命周期的早期阶段，生长速率的增加可以反映出增强的活力。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，使植物能够比其他可能的情况更晚播种和/或更快收获(类似的效果可以通过较早的开花时间获得)。如果生长速率充分增加，可以允许4番种同一植物物种更多的种子(例如完全在一个常规的生长期内，播种和收获稻类植物、接着播种和收获更多的稻类植物)。与之类似，如果生长速率充分地增加，可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种和收获稻类植物，随后，例如，播种和任选的收获大豆、马铃薯或任何其他适宜的植物)。在一些作物植物的情况下，也有可能从同一根茎收获增加的次数。改变植物的收获周期可以导致每英亩年生物量产量的增加(这是由于(比方说在一年中)任何特定植物可以生长和收获次数的增加)。与野生型对应物相比，生长速率的增加还能够在更广阔的地域栽培转基因植物，因为种植作物的地域限制通常由种植时(早季)或收获时(晚季)不利的环境条件所决定。如果缩短收获周期，可以避免这类不利条件。可以由生长曲线获取多种参数，来确定生长速率，这类参数可以是T-Mid(植物达到其最大大小50%所需的时间)和T-卯(植物达到其最大大小90%所需的时间)，等等。实施本发明的方法产生与具有增加的生长速率的植物。因此，本发明提供了增加植物生长速率的方法，所述方法包括调节植物中I类HDZiphox5多肽或其同源物编码核酸的表达；或包括调节植物中NRT或其同源物编码核酸的表达；或包括调节植物中YEP16多肽编码核酸的表达；或包括调节植物中I型shaggy样激酶或其同源物的表达。无论植物处于非胁迫条件下，还是植物相对于对照植物接触多种胁迫，都发生产率和/或生长速率的增加。通常植物通过更加緩慢的生长来应答胁迫接触。在重度胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。另一方面，轻度胁迫在文中定义为当植物接触时不导致植物完全停止生长丧失重新开始生长能力的任何胁迫。本发明意义上的轻度胁迫导致胁迫植物的生长与非胁迫条件下的对照植物相比，下降低于40%、35%或30%，优选低于25%、20%或15%，更优选4氐于14%、13%、12%、11%或10%或更寸氐。由于耕作方法(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的发展，栽培的作物植物常常不会遇到重度胁迫。因此，由轻度胁迫诱导的受损的生长通常成为农业中不期望的因素。轻度胁迫可以是植物接触的日常的生物和/或非生物(环境)胁迫。非生物胁迫可以因干旱或过量的水、无氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫以及热、冷或水冻温度而引起。非生物胁迫可以是由于水胁迫(特别是由于干旱)、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。生物胁迫一般是由病原体如细菌、病毒、真菌和昆虫引起的那些胁迫。实施根据本发明的方法导致植物对非生物胁迫具有增加的耐受性。如Wang等(Planta(2003)218:l-14)所报道的那样，非生物胁迫引起一系列的形态学、生理学、生物化学和分子变化，对植物生长和生产力造成不利影响。已知干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫相互联系，并可以通过相似的机制诱导生长和细胞损害。例如，干旱和/或盐度主要表现为渗透胁迫，导致破坏细胞中的稳态和离子分布。氧化胁迫通常与高温或低温、盐度或干旱胁迫相伴，可以引起功能及结构蛋白质的变性。所以，这些多种多样的环境胁迫通常激活相似的细胞信号传导路径和细胞应答，例如应激蛋白的产生，抗氧化剂的上调、相容溶质的累积以及生长阻抑。既然多种多样的环境胁迫激活相似的路径，本发明关于干旱胁迫的举不应视为局限于干旱胁迫，而更应视为表明I类HDZiphox5多肽或其同源物总体而言参与非生物胁迫的屏显信息(screen)。此外，本发明的方法可以在非胁迫条件下或者轻度千旱条件下实施，以提供相对于相应的野生型或其他对照植物具有改良的生长特性(特别是增加的产率)的植物。本文所用的术语"非胁迫"条件优选为植物最可能遇到的那些不显著背离平常气候的条件及其他非生物条件，优选为允许植物最佳生长的那些条件。本领域技术人员知晓给定地点的正常土壤条件和气候条件。在干旱胁迫和高盐度胁迫之间报道存在特别高程度的"对话"(Rabbani等(2003)PlantPhysiol133:1755-1767)。因此，显然I类HDZiphox5多肽或其同源物连同其赋予植物干旱耐受性的用途一起，也将会在保护植物抵御多种其他非生物胁迫方面找到用武之地。与之相似，显然I型shaggy样激酶(如本文所定义的)连同其赋予植物盐耐受性的用途一起，也将会在保护植物抵御多种其他非生物胁迫方面找到用武之地。此外，Rabbani等(2003，PlantPhysiol133:1755-1767)报道，在双子叶和单子叶植物之间存在胁迫耐受性和应答的相似的分子机制。因此本发明的方法可以有利地应用于任何植物。如本文所定义的术语"非生物胁迫"应理解为表示如下一个或多个方面水胁迫(由于干旱或过量的水)、无氧胁迫、盐胁迫、温度胁迫(由于热、冷或冰冻温度)、化学毒性胁迫和氧化胁迫。根据本发明的一个方面，非生物胁迫是渗透胁迫，选自7jc胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和离子胁迫。优选水胁迫是干旱胁迫。术语盐胁迫不局限于常见盐，而可以是如下任何一种或多种NaCl、KCl、LiCl、MgCl2、CaCh等等。增加的非生物胁迫耐受性表现为非生物胁迫条件下增减的植物产率。特别是在本发明涉及I类HDZiphox5多肽及其编码核酸的用途的情况下，此类增加的产率可以包括如下一个或多个方面增加的饱满种子数、增加的种子总产率、增加的每个圆锥花序的花数、增加的种子饱满率、增加的HI、增加的TKW、增加的根长度或增加的根直径，其中每一方面都相对于相应的野生型;f直物而言。实施本发明的方法提供具有增加的非生物胁迫耐受性的植物。实施本物而言在非胁迫条件下或轻!l干旱条件下生长、的具有改良:长特性(特别是增加的产率)的植物。根据本发明，提供了增加植物非生物胁迫耐受性的方法，所述方法包括调节植物中I类HDZiphox5多肽或其同源物编码核酸的表达。根据本发明的一个方面，非生物胁迫是渗透胁迫，选自如下一个或多个方面水胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和离子胁迫。优选水胁迫是干旱胁迫。本发明还提供了提高植物非生物胁迫耐受性的方法，包括增加植物中I型shaggy样激酶或其同源物的活性，所述I型shaggy样激酶具有(i)与SEQIDNO:147所示的氨基酸序列至少77%的序列同一性；以及(ii)基序I:R/H/V/N/QE/GLKG/N和基序II:KQ/NCXXXG/A/S，其中X可以是任意氨基酸。本发明还提供了改良在非胁迫条件下或轻度干旱条件下生长的植物的生长特性(特别是增加产率)的方法，所述方法包括调节植物中NRT多肽或其同源物编码核酸的表达(特别是增加其表达)。在本发明优选的实施方案中，根据本发明的方法在非胁迫条件下发生产率和/或生长速率的增加。特别是在本发明涉及I类HDZiphox5多肽及其编码核酸的用途的情况下，实施本发明的方法导致绿度指数相对于相应的野生型植物增加。如本文所定义的绿度指数是数码相机记录的植物图像中黄色象素的比例(表达为％)。增加的绿度指数可以表明降低或延迟的衰老，这依次能够延长植物的光合作用活性，进而带来本领域众所周知的多种有益效果。本发明因此提供了增加植物绿度指数的方法，所述方法包括调节植物中I类HDZiphox5多肽或其同源物编码核酸的表达。优选绿度指数在非生物胁迫条件下增加，更优选在水胁迫条件下，还优选在干旱胁迫条件下。在本发明的方法包括调节植物中I类HDZiphox5多肽或其同源物编码核酸表达的情况下，优选增加的产率包括如下一个或多个方面增加的饱满种子数、增加的种子总产率、增加的每个圆锥花序的花数、增加的种子饱满率、增加的HI、增加的TKW、增加的根长度或增加的根直径，其中每一方面都相对于相应的野生型或其他对照植物而言。根据本发明优选的方面，提供了相对于相应的野生型或其他对照植物增加植物产率的方法，所述方法包括调节植物中I类HDZiphox5多肽或其同源物编码核酸的表达。在本发明的方法包括调节植物中NRT或其同源物编码核酸表达的情况下，优选所产生的植物具有增加的产率，且更特别地具有增加的生物量和/或增加的种子产率。优选增加的种子产率包括如下一个或多个方面的增加(饱满)种子数量、种子总重量、种子大小、千粒重和收获指数，其中每一方面都相对于相应的野生型或其他对照植物而言。根据本发明另一优选的方面，提供了增加植物产率的方法，所述方法包括调节植物中NRT多肽或其同源物编码核酸的表达(优选增加其活性和/或表达)。在本发明的方法包括调节植物中YEP16多肽编码核酸表达的情况下，优选增加或提高的产率是相对于相应野生型植物种子产率而言提高的种子产率。因此才艮据本发明另一优选的方面，提供了相对于相应的野生型或其他对照植物增加种子产率的方法，包括调节植物中YEP16多肽或其同源物编码核酸的表达。在本发明的方法包括调节植物中I型shaggy样激酶或其同源物编码核酸表达的情况下，优选改良的生长特性是提高的非生物胁迫耐受性。根据本发明另一优选的方面，提供了提高植物非生物胁迫耐受性的方法，包括调节植物中I型shaggy样激酶或其同源物编码核酸的表达(优选增加其活性和/或表达>所述I型shaggy样激酶具有(i)与SEQIDNO:147所示的氨基醋列至少77%的序列同一快以及(ii)基序IR/H/V/N/QE/GLKG/N和基序II:KQ/NCXXXG/A/S，其中X可以是任意氨基酸。因此可以有利地对任何植物应用本发明的方法。本文所用术语"植物"包括整林植物、植物的祖先和后代以及植物部分，包括种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花以及组织和器官，其中上述每一种都包含目的基因/核酸。术语"植物"也涵盖植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样其中上述每一种都包含目的基因/核酸。在本发明方法中尤其有用的植物包括所有属于植物界(Viridiplantae)超家族的植物，特别是单子叶和双子叶植物，包括选自以下的饲料或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木金合欢属物种04oi"Vi印/;.)、槭树属物种(^"r印a)、猕猴杉&属物种(J"/附Vft'a^/7.)、七叶树属物种(/4esrw/"s新西兰贝壳杉(jg"汰iy""W/yi/Zs^/i场/z/""附","、三色夥、椤(J&o;p/^7fl加"/or)、须芒草属物种(v4"flf/y/wg卵；s/p.)、落花生属物种必fl汰iVzea/7/Mf7〉M^1、桦木属物种(5e似/flsp/.)、芸苔属物种(jBnsww'ctf5/;/;.)、木揽(必r"g"/emg戸MO/r/^")、"/r/c朋"、紫铆(必"fe"/ro/i^/asfl)、(Tfl^i6a/a尸/wftso、朱缕花属物种(0^///""^*"5//7)、茶(6^附《//|"5ie"s/s)、美人蕉(CVm"fl//l&Cfl)、辣椒属物种(C"/WZCM/M5p/.)、决明属物种(03WSIfl5/7/7.)、3巨瓣豆(Ow/roe/wtf/7"6eyce"力、木瓜属物种(C"/r"e"o附e/^y5p/.)、肉才圭(CY"wa附0附m附cass/")、小果咖啡(OjQ^nam6/ca)、Cb/o/)/io印07Mii附附o/fl"e、变异'J、冠花(Cwo"///171vflWfl)、枸子(Coto"easfe,s^/vftVifl)、山楂属物种(Oflr/iaegws)、香瓜属物种((7"^附&spp.)、斥白木属物种(Cw/;mMW51印/.)、￡fe<i/6ato、木梨(Q^/owiVioWo"gfl)、圆球杉p杉(C，to附m'fl/apo"/c")、香茅属物种(C戸Ao/^o"sp/;.)、(^"幼e"cfe"/to"、木梨(QWo"/fl06/0wgfl)、Z)/6e/*giVi附owetonVi、；^4/fr^4h(Davfl//iVi必va尸/cflto)、山马虫皇属物种(De5w<w//"/印p.)、迪卡兰("/c/hwi'Vis^"flrmwi)、Z)幼etefv/wg柳tf附//ecte附、D/oc/easp/、嫌扁豆属物种(Z)0/,'c/w"/p.)、Z)ofjcw/w附re""附、雄穩摔(fc似"oc/r/ofl/;jT/i附油/iy)、^"/r/wft'"、糝子(^7e"5i"e、5//1.、刺桐属物种(五IJ幼f/"flsp/.)、桉属物种(五Mca(v/^"ss/^.)、五"c/e"c/r/w/^尸i、金茅(五"/"//"w7/f^fl)、荞麦属物种(尸"gcy^,w挑印/1.)、费约罗5e//owiVm")、草雷属物种(Ffagflrr/fl5/;/.)、千斤拔属物种(尸/e附/"g/"印/0、/>￡^/""/"6fl/iAs/i'、(7er"/i/"附幼"/iAew7、银杏(G7"^緒o6fl)、G7戸7ie/Viv朋/ca、G7/WciVfoVi5/p、陆地棉(G^s卿/M附/rzV虚"附)、银桦属物种(OeW〃e"s".)、G"幼ow,ftVico/e，mwfl、岩黄炙属物种(好e咖"r"附s早)、牛鞭草(^附ar狄iVifl船si附fl)、扭黄茅(^f"e/y"go"co牆W"s)、大麦(7/(/^m附vw/^we)、/^pa/r/rew/"r"/ff、小连翅(外/w/cw附e""m附)、Zfy/;eW/rCViflfeso/w似、白花庭蓝(/"cf/go/"cw"fl似)、秀尾属物种(/r/s)、丄e/;/jro/zyb/,'fl、胡枝子属物种(丄e印erf&a5//.)、莴苣属物种(丄c"wccrs".)、Z^wcfle/ifl/ewcoce/;/rfl/fl、Z^wdeftVisi'附//狄、6",Viw'/、百乐M艮属物种CLo加s早)、硬皮豆(A/flm^/o附aw7/flfe)、苹果属物种(Ma/"s5p/).)、ikf朋幼Wesc"/e她、紫花苜蓿(M^/aigo虚/va)、7K杉(Afetoe《Mo/ag(v/7tos^6wVfes)、大蕉(Af附fl柳f"附)、烟草属物种(A7cW"簡附卿.)、驴食草属物种(6>"—c/^卿.)、0"/幼o戸s卿.、稻属物种(6^vw^!P.)、非洲双翼豆(尸e/to//rw"mfl/ncflw"/w)、狼尾草属物种(尸e朋/s由附卿.)、辨梨(尸e度agmfc/舰)、碧冬痴属物种(尸"w"/fl卿.)、菜豆属物种(P/rflseo/"s1棋榔竹(尸/roe"/xc""flf/e"5&)、尸/ro,附,"附cooAi"/i"附、石楠属物种CP/rC"/nsp/;.)、白云杉(/to"g/"wcfl)、松属物种(尸iVi"ssp/.)、婉豆(尸/sw附sflftVw附)、新西兰罗汉松(iWoca/y"sto似m)、/^go朋f幼nViyZecAi/、/\>g￡mflW/r/7Vis^m"mw"、杨属物种(Aym/附s//;.)、牧豆树(Pms印/sciViem"Vi)、花旗松(/^"</她"^1膨"z/柳V)、户tera/oA,w附他//幽附、西洋梨(i^;msco附附"w/s)、栎属物种(g"erc"s印/>.)、及/r"//r/o/e/wis"附^//"似、l1^^^"^/^/^!/"^//s甲V/")、及A附"ato/e"j/y、欧洲醋粟gmw"/fl/7Vi)、茶薦子属物种(jR幼^s印/>.)、洋槐(io6/"/flj95^M甴"cac/a)、蔷薇属物种(及^fls/j^.)、悬钩子属物种(及《6附印/>.)、柳属物种OSff/ix印/.)、iSc/^flc/rj;W"附s朋wVie"附、金松(S"Wo//^sverri"7/a似)、北美红杉se附pe/t/re/w)、巨杉(5^《"oi'flfifewi/fowg/g"/ite"附)、两色蜀黍(5V^/rii附6/co/or)、菠菜属物种(iS//"fl"'asp/;.)、iS/wfo^/"s/Z附Ana,"s、iSV幼wr"sfl/o/^c"iYwV/es、5^tosfl/i幼osAn附i7/s、葫声茶属物种(7iwfeAflgi'5/j/;)、落羽杉(raxoW"wd/幼c/r"附)、阿拉伯黄背草(r/re/Mefite加Vi"^ra)、车轴草属物种(7>iyb/,"ws/〗，/;.)、小麦属物种(7Wftc"/fi、异叶4失杉(7i"g"/^tew//^//fl)、越桔属物种(KflcamM/iis/^.)、野豌豆属物种(W""印/;.)、葡萄(P7fev/"z/em)、锥穗沃森花(^itoo/wVi/jj;mwiV/flto)、马蹄莲(Z朋tecfesc似"a^/i/印iai)、玉蜀黍(Zea附tfj;s)、苋属植物(amaranth)、洋蓟(artichoke)、天门冬属(asparagus)、椰菜(broccoli)、孢子甘蓝(5r"Me/ss/7iv"te)、甘蓝、芸苔(canola)、胡萝卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘蓝(collardgreens)、亚麻、无头甘蓝(kale)、兵豆属(lentil)、油菜籽油菜(oilseedrape)、秋葵(okra)、洋葱、马铃薯、稻、大豆、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜(squash)、茶和藻类等等。根据本发明优选的实施方案，植物为作物植物如大豆、向日葵、芸苔、苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、马铃薯或烟草。还优选植物为单子叶植物如甘蔗。更优选植物是谷类，例如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、高粱或燕麦。核酸/基因如本文所定义的术语"I类HDZiphox5多肽或其同源物，，是指这样的多肽，其从N-末端到C-末端包含(i)酸性盒；和(ii)I类同源域；和(iii)具有5个以上七肽的亮氨酸拉链。另外，I类HDZiphox5多肽或其同源物可以包含如下任一或两者兼而有之(a)Trp尾巴；和(b)RPFF氨基酸基序，其中R为Arg,P为Pro,而F为Phe。在此基序中允许进行任意位置上的一个或多个保守改变，和/或任意位置上的一个或两个非保守改变。当从N-末端到C-末端研究蛋白质时，(b)中的基序位于酸性盒之前。如上文所定义的I类HDZiphox5多肽的一个实例从N-末端到C末端包含(i)酸性盒；和(ii)I类同源域；和(iii)具有5个以上七肽的亮氨酸拉链；并且另外包含(a)Trp尾巴；和(b)RPFF氨基酸基序，其中R为Arg,P为Pro，而F为Phe，如SEQIDNO:2所示。更多这才羊的实例在本文实施例1表A中给出。I类HDZiphox5多肽或其同源物由I类HDZiphox5核^/基因编码。因此如本文所定义的术语"I类HDZiphox5核^/基因"是编码如上文定义的I类HDZiphox5多肽或其同源物的任何核i^/基因。利用本领域众所周知的常规技术如通过序列比对，可以容易地鉴定I类HDZiphox5多肽或其同源物。用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP利用Needleman和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48;443陽453)的算法寻找可以使匹配数最大化并使空位数最小化的两完整序列的比对。BLAST算法(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-10)计算序列同一性百分比，并统计分析两序列间的相似性。实施BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开地获得。例如，使用获自http:〃dustalw.genome.jp/sit-bin/nph-ClustalW的ChistalW多重序列比对算法(1.83版)，采用缺省的两两比对参数和百分比评分方法，可以容易地鉴定包含I类同源域和具5个以上七肽的亮氨酸拉链的I类HDZiphox5同源物。可以进行细微的手工编辑，以优化保守基序间的比对，这对于本领域技术人员将是显而易见的。可以利用专业数据库来鉴定I类HDZiphox5蛋白的多种结构域，如同源域和亮氨酸拉链，例如SMART(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95，5857-5864;Letunic等(2002)NucleicAcidsRes30，242-244;http:〃smartembl國heidelberg.de/)、InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids-Res.31，315-318;httD:〃www.ebi.ac.uk/interpro/)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，Ageneralizedprofilesyntaxforbiomolecularsequencesmotifsanditsfunctioninautomaticsequenceinterpretation.(In)ISMB-94;Proceedings2ndInternationalConferenceonIntelligentSystemsforMolecularBiology.AltmanR.,BrutlagD.，KarpP"LathropR.，SearlsD编著，53-61页，AAAIPress，MenloPark;Hulo等，Nucl.Acids.Res.32:D134陽D137，(2004)，h加:〃www.exDasv.org/prosite/)或Pfam(Bateman等，NucleicAcidsResearch30(1):276誦280(2002)，http:〃www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)。可以利用专业数据库进4亍亮氨酸拉链预测和七肽鉴定，如2ZIP，该数据库将标准巻曲螺旋预测算法和特征性亮氨酸重复单位的模拟搜索结合在一起(Bornberg-Bauer等(1998)ComputationalApproachestoIdentifyLeucineZippers,NucleicAcidsRes.，26(11):2740-2746,h加:〃2zip.mol,.mpg.de)。此外，也可以容易地鉴定酸性盒的存在。可以利用来自ExPASy服务器的软件程序计算一级氨基酸组成(以％表示)，以确定多肽结构域是否富含特定的氨基酸，特别是ProtParam工具(GasteigerE等(20(B)ExPASy:theproteomicsserverforin-depthproteinknowledgeandanalysis.NucleicAcidsRes31:3784-3788)。然后可以将目的蛋白质的组成与Swiss-Prot蛋白质序列数据库中的平均氨基酸组成(以％表示)进行比较。在该Swiss-Prot数据库内，平均Asp(D)和Glu(E)含量分别为5.3%和6.6%，组合平均值为11.9%。作为实例，SEQIDNO:2的酸性盒含9.1。/。的D和54.5。/。的E，组合平均值为63.6%。如本文所定义的那样，酸性富含盒具有高于Swiss-Prot蛋白质序列数据库中蛋白质平均氨基酸组成(以％表示)的组合Asp(D)和Glu(E)含量(以y。表示)。酸性盒可以是转录激活结构域的一部分。已根据真核转录激活结构域的氨基酸含量对其进行了分类，且主要的类别包括酸性、谷氨酰胺富含和脯氨酸富含激活结构域(Rutherford等(2005)PlantJ.43(5):769-88，及其中的参考文献)。I类HDZiphox5多肽或其同源物中的一部分蛋白质还包含RPFF氨基酸基序，其中R为Arg,P为Pro,而F为Phe。在此基序中允许进行任意位置上的一个或多个保守改变，和/或任意位置上的一个或两个非保守改变。当从N-末端到C-末端研究蛋白质时，此基序位于酸性盒之前(见图2)。可以利用上文所述的用于比较的序列比对方法来鉴定RPFF的存在。在一些情况下，可以调整缺省参数，以更改搜索的严格度。例如利用BLAST,可以增加用于报告数据库序列匹配事件的统计学意义阈值(称为"预期"值，即E值)，以显示低严格度的匹配事件。通过这种方式可以鉴定短的几乎精确匹配的事件。I类HDZiphox5多肽或其同源物中的一部分蛋白质还包含Trp尾巴。如本文所定义的Trp尾巴是蛋白质C-末端包含至少一个Trp残基的最后IO个氨基酸(见图2)。I类HDZiphox5多肽或其同源物的实例(由括号中的多核苷*列登录号编码)在表A中给出。应该理解的是，落入"I类HDZiphox5多肽或其同源物，，定义的序列不限于表A中所给出的氨基^列，而是任何这样的多肽，其从N-末端到C末端包含(i)酸性盒；和(ii)I类同源域；和(iii)具有5个以上七肽的亮氨酸拉链，均适用于实施本发明的方法。I类HDZiphox5多肽或其同源物具有DNA结合活性，优选结合在中心位置处重叠的5bp半位点，即CAA(A/T)ATTG，如在酵母单杂交试验中检测到的那样(Meijer等(2000)MolGenGenet263:12-21)。在稻细胞悬浮液的瞬时测定中，与GUS报告基因共同轰击I类HDZiphox5多肽导致染色斑点数目增加，这些斑点颜色也更深(Meijer等，同前)。此测定可用于证明I类HDZiphox5多肽或其同源物的激活因子功能。可用于本发明方法的NRT多肽及其同源物和编码它们的核酸如本文所定义的术语"NRT或其同源物"是指这样的多肽，其包含(i)MFS—1结构域(Pfam登录号PF076卯，InterPro登录号IPR011701)，接着的(ii)跨膜结构域。图6给出了一个实例。优选NRT蛋白或其同源物具有NRT活性如高亲和力硝酸盐转运，并且不含PTR2结构域(Pfam登录号PF00854,InterPro登录号IPR000109)。优选NRT蛋白或其同源物包含标签序列1(SEQIDNO:57):V)(E/Q/G)Y。还优选NRT蛋白或其同源物包含如下一项或多项标签序列2(SEQIDNO:58):LG(P/A)RYG(C/T)AF(L/S);标签序列3(SEQIDNO:59):STFAA(A/R)PL(V/I)(P/V)(I/L/V)IR(D/E)NL(腦)(L/P);标签序列4(SEQIDNO:60):VRF(L/M)IGF(S/C)LA;标签序列5(SEQIDNO:61):FVSC(Q/R)YW(M/T)S(T/V)(M/S)(F/M)。更优选NRT蛋白或其同源物包含如下一项或多项标签序列6(SEQIDNO:62):标签序列7(SEQIDNO:63):NG(L/T/C)A(A/G)GWG;标签序列8(SEIDNO:64):.优选NRT蛋白如SEQIDNO:53所示，跨膜结构域长约15至30个氨基酸，并且通常由形成a螺旋的疏水残基构成。它们通常是基于疏水性预测的(例如Klein等，Biochim.Biophys.Acta815，468，1985;或Sonnhammer等，InJ.Glasgow,T.Littlejohn，F.Major,R.Lathrop，D.Sankoff和C.Sensen编著，ProceedingsoftheSixthInternationalConferenceonIntelligentSystemsforMolecularBiology,第175-182页，MenloPark,CA，1998.AAAIPress)。可选地，NRT蛋白的同源物按照递增的优选顺序与SEQIDNO:53所示的氨基酸具有50%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、卯％、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的总体序列同一性。总体序列同一性利用全局比对算法进行确定例如GAP程序(GCGWisconsin软件包，Accelrys)中的NeedlemanWunsch算法，优选采用缺省参数。可以利用专业数据库来鉴定NRT蛋白的多种结构域，例如SMART(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95，5857-5864;Letunic等(2002)NucleicAcidsRes30，242-244;http:〃smart.embl-heidelber2.deA)、InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318;http:yVwww.ebi.ac.uk/interpro/)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，Ageneralizedprofilesyntaxforbiomolecularsequencesmotifsanditsfunctioninautomaticsequenceinterpretation.(In)ISMB-94;Proceedings2ndInternationalConferenceonIntelligentSystemsforMolecularBiology.AltmanR.，BrutlagD.，KarpP.,LathropR.，SearlsD编著，53-61页，AAAIPress,MenloPark;Hulo等，Nucl.Acids.Res.32:D134画D137，(2004)，http:〃www.exi)asv.org/i3rosite/)或Pfam(Bateman等,NucleicAcidsResearch30(l):276-280(2002),http:〃www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)。搜索和鉴定NRT同源物的方法完全落入本领域技术人员的能力范围之类。这类方法包括将计算机可读形式SEQIDNO:1或2所代表的序列与公共数据库中可用的序列进行比较，如MIPSQi加:〃miDs.gsf掘、GenBank(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.htmr)或EMBL核苷酸数据库(http:〃www.ebi.ac.uk/embl/index.html)，使用本领域公知的序列比对或比较算法，如GAP(Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48;443-453(1970))、BESTFIT(使用Smith和Waterman的局部同源性算法(AdvancesinAppliedMathematics2;482-489(1981)))、BLAST(Altschul，S.F.，Gish，W"Miller,W"Myers,E.W.&Lipman，D.J.，J.Mol.Biol.215:403-410(1990))、FASTA和TFASTA(W.R.Pearson和D.J.LipmanProc.Natl.Acad.Sci,USA85:2444-2448(1988))。执行BLAST分析的软件可从国家生物技术信息中心(NCBI)公开地获得。落入"NRT多肽或其同源物"定义的蛋白质的实例包括稻类蛋白质以及来自其他物种的蛋白质，如玉蜀黍、芦苹(iV^flg/m'tesfl"W/vi/is)、大麦(好on/ew附vn/gare)、小麦(7>妝11附flest/vw附)、欧洲油菜、蕃痴(I^coipei"sico11^c"/e"/"附)、烟草、胡萝卜(2""c"sc"r她)、欧洲山杨(jPo/;"/"",柳"/附)、Z^似s7V1/ww/cflf、杉匕(iV"wMS/7ersica)、大豆(G(v"Vie附ax)和拟南芥，等等。NRT蛋白实例的非限制性列表在本文实施例14的表I中给出。不过，考虑来自其他植物分类如藓类植物或蕨类植物的NRT蛋白可以等同地用于本发明的方法。例如，藓类植物小立碗藓(尸/13^0附,7^//;mfe附)拥有至少5种NRT蛋白(GenBank登录号BAD00097、BAD00098、BAD00099、BAD00100、BAD00101)。应当理解，术语"NRT多肽或其同源物"不局限于SEQIDNO:53所示的或表I中所给出的序列，而是任何满足如下标准的多肽包含功能性MFS一1结构域，和一个或多个SEQIDNO:57至64的保守标签序列，以及位于上文定义的MFS—1结构域C-末端的跨膜结构域；或者与SEQIDNO:53的序列具有至少50%的序列同一性，均适用于实施本发明的方法。为确定NRT的转运蛋白活性，采用Tong等(PlantJ.41，442-450，2005)所述的硝酸盐吸收测定。简言之，在爪蟾(A^m/;附)卵母细胞中表达目的NRT蛋白，并测量15N富集硝酸盐的吸收。如果需要，可以共表达w"r2基因，以增加硝酸盐转运。可选地，NRT蛋白或其同源物的活性可以通过在稻栽培种日本晴(O/jwsW/vflcultivarMpponbare)中表达处于GOS2启动子控制之下的NRT多肽或其同源物来进行测定，这将产生与相应的野生型植物相比具有增加的地上生物量和/或增加的种子产率的植物。这种种子产率的增加可以通过多种方式衡量，例如种子总重量、饱满种子数量或种子总数的增加，收获指数的增加或每个圆锥花序花朵的增加。NRT蛋白或其同源物由iV及71核l基因编码。因此如本文所定义的术语"7V及r核^/基因"是编码如上文定义的NRT蛋白或其同源物的任何核酸/基因。可用于本发明方法的YEP16多肽及其同源物和编码它们的核酸术语"YEP16多肽，，是指SEQIDNO:128的序列。YEP16多肽的同源物是指按照递增的优选顺序与SEQIDNO:128的氨基酸序列享有至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%序列同一性的任何氨基酸序列。因此本文述及的"YEP16多肽或其同源物编码核酸"是指编码如上文定义的YEP16多肽的任何核酸序列，或编码如上文定义的YEP16多肽同源物的任何核酸。可用于本发明方法的I型shaggy样激酶及其同源物和编码它们的核酸如本文所定义的术语"I型shaggy样激酶或其同源物"是指这样的多肽，其具有(i)与SEQIDNO:147所示的氨基酸序列至少77%的序列同一性；以及(ii)基序I:R/H/V/N/QE/GLKG/N和基序II:KQ/NCXXXG/A/S，其中X可以是任意氨基酸。满足前述要求的多肽能够使I型shaggy样激酶区别于其他型shaggy样激酶。可以利用本领域技术人员熟知的常规技术容易地鉴定落入上文定义的"I型shaggy样激酶或其同源物"。例如，通过序列比对可以容易地确定与SEQIDNO:147所示的氨基酸具有至少77%同一性的多肽。用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP利用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48;443-453,1970)的算法寻找可以使匹配数最大化并使空位数最小化的两完整序列的比对。BLAST算法计算序列同一性百分比，并统计分析两序列间的相似性。实施BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开地获得。例如，利用VNTIAlignX多重比对程序，基于改进的clustalW算法(InforMax，Bethesda,MD，http:〃www.informaxinc,com)，采用缺省设置，空位开放罚分为IO且空位延伸为0.05,通过将查询^j^酸序列与已知的I型shaggy样激酶序列进行比对(例如参见图14所示的比对)，可以容易地鉴定与SEQIDNO:147所示的氨基酸具有至少77%同一性的shaggy样激酶或其同源物。本领域技术人员也能够容易地鉴定这样的序列，其具有基序I:R/H/V/N/QE/GLKG/N和基序II:KQ/NCXXXG/A/S,其中X可以是任意氨基酸。这可以通过进行比对以及搜索同源区域来实现。下表l显示了SEQIDNO:147的序列中发现的基序I:R/H/V/N/QE/GLKG/N和基序II:KQ/NCXXXG/A/S(其中X可以是任意氨基酸)，以及同源序列中相应的基序。表1所示的总体同一性百分比系将SEQIDNO:147与表中所示的登录号进行比较(全长序列对全长序列)。表l:I型shaggy样激酶及其同源物中发现的保守基序<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>落入"shaggy样激酶或其同源物"定义的多肽的实例包括如下序列来自稻的shaggy样激酶ySEQIDNO:147(NCBI登录号AB059621);来自稻的shaggy样激酶SEQIDNO:149(NCBI登录号AK058276);来自稻的shaggy样激酶SEQIDNO:151(NCBI登录号AK099599);来自拟南芥的shaggy样激酶aSEQIDNO:153(NCBI登录号At5g26750);来自拟南芥的shaggy样激酶ySEQIDNO:155(NCBI登录号At3g05840);来自拟南芥的shaggy样激酶aSEQIDNO:157(NCBI登录号CAA48538.1);来自拟南芥的shaggy样激酶￡SEQIDNO:159(NCBI登录号At5gl4640);来自拟南芥的shaggy样激酶ySEQIDNO:161(NCBI登录号CAA73247.1);来自玉蜀黍的SEQIDNO:163(NCBI登录号AY103545);来自玉蜀黍的SEQIDNO:165(NCBI登录号AY108486.1);来自苜蓿的SEQIDNO:167(NCBI登录号CAA48472.1);来自苜蓿的SEQIDNO:169(NCBI登录号CAA48474.1);来自苜蓿的SEQIDNO:171(NCBI登录号CAA48473.1);来自烟草的SEQIDNO:173(NCBI登录号CAA54803.1);来自小麦的shaggy样激酶的蛋白质推测物SEQIDNO:175(NCBI登录号AAM77397.1);来自矮牵牛的SEQIDNO:177(NCBI登录号CAA58594.1)。术语"shaggy样激酶或其同源物"不局限于前述段落提及的SEQIDNO所示的序列，而是任何满足如下标准的多肽其具有(i)与SEQIDNO:147所示的氨基醋列至少77%的序列同一性；以及(ii)基序I:R/H/V/N/QE/GLKG/N和基序II:KQ/NCXXXG/A/S，其中X可以是任意氨基酸，均适用于实施本发明的方法。Shaggy样激酶正如其名字所暗示的那样，具有激酶活性。《生物化学》杂志(TheBiochemicalJournal,巻303(Pt3)，1994年11月1日，701-704页(Stambolic和Woodgett))报道了有关其动物同源物糖原合酶激酶-3(GSK-3)的测定。可用于本发明方法的序列不局限于前述I类同源域亮氨酸拉链(HDZip)hox5核酸和多肽；或前述NRT多肽及其编码核酸；或前述YEP16多肽及其编码核酸；或前述I型Shaggy样激酶及其编码多肽。根据本发明的方法也可以利用I类同源域亮氨酸拉链(HDZip)hox5多肽或其同源物编码核酸的变体；或利用NRT多肽或其同源物编码核酸的变体；或利用YEP16多肽或及同源物编码核酸的变体；或利用I型Shaggy样激酶及其同源物编码核酸的变体来实施。这类变体的实例包括"部分"、杂交序列、等位基因变体、剪接变体以及通过基因改组获得的变体。例如，可以通过对核酸进行一处或多处缺失来制备"部分"。"部分"可以以分离的形式使用，或者可以与其他编码(或非编码)序列融合，以便例如，生产组合了若干活性的蛋白质。当与其他编码序列融合时，经翻译后所产生的多肽可能比预测的"部分"要大。在用于本发明方法的序列为I类HDZiphox5的情况下，"部分"编码的多肽从N-末端到C末端包含(i)酸性盒；和(ii)I类同源域；和(iii)具有5个以上七肽的亮氨酸拉链。优选"部分"为表A所示核酸之一的部分。最优选"部分"为SEQIDNO:1所示核酸的部分。在用于本发明方法的序列为NRT编码核酸的情况下，"部分"是指编码这样的多肽的DNA片段，所述多肽包含MFS一1结构域和位于所述MFS_1结构域C-末端的跨膜结构域。优选"部分"包含上文定义的一个或多个标签序列。优选"部分"为表I所示核酸之一的部分。最优选"部分"为SEQIDNO:52所示核酸的部分。在用于本发明方法的序列为YEP16编码核酸的情况下，"部分"是指编码YEP16多肽或其同源物的DNA片段，按照递增的优选顺序，具有SEQIDNO:127或SEQIDNO:129所示核酸序列的至少100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575个连续核苷酸，或者其中"部分"按照递增的优选顺序，具有YEP16多肽或其同源物编码核酸序列的至少100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575个连续核苷酸。优选"部分"为SEQIDNO:127或SEQIDNO:129所示核酸的部分。在用于本发明方法的序列为I型Shaggy样激酶的情况下，"部分"是指编码Shaggy样激酶的长度至少为1,200个核苷酸的DNA片段，且所述"部分，，编码的多肽具有(i)与SEQIDNO:147所示的氨基酸序列至少77%的序列同一性；以及(ii)基序I:R/H/V/N/QE/GLKG/N和基序II:KQ/NCXXXG/A/S，其中X可以是任意氨基酸。优选"部分"为SEQIDNO:146、SEQIDNO:148、SEQIDNO:150、SEQIDNO:152、SEQIDNO:154、SEQIDNO:156、SEQIDNO:158、SEQIDNO:160、SEQIDNO:162、SEQIDNO:164、SEQIDNO:166、SEQIDNO:168、SEQIDNO:170、SEQIDNO:172、SEQIDNO:174和SEQIDNO:176中任一所示核酸的部分。本发明因此提供了改良植物生长特性的方法，包括调节植物中编码I类同源域亮氨酸拉链(HDZip)hox5多肽或其同源物的核酸的部分的表达；或包括调节植物中编码NRT多肽或其同源物的核酸的部分的表达；或包括调节植物中编码YEP16多肽或其同源物的核酸的部分的表达；或包括调节植物中编码I型shaggy样激酶或其同源物的核酸的部分的表达。另一类核酸变体为这样的核酸，其能够在降低的严格条件、优选在严格条件下与I类HDZiphox5核^/基因或其同源物编码核酸；或与NRT多肽或其同源物编码核酸；或与YEP16多肽或其同源物编码核酸；或与I型shaggy样激酶或其同源物编码核酸杂交。本文定义的术语"杂交"指其中基本同源互补的核苷酸序列彼此退火的过程。杂交过程能够完全在溶液中发生，即互补的核酸都在溶液中。杂交过程也可以如此进行，即互补核酸之一固定于基质上，如磁珠、琼脂糖珠或任何其它树脂上。此外，杂交过程也可以如此进行，即其中互补核酸之一固定在固相支持物如硝酸纤维素或尼龙膜上，或者例如用照相平板印刷固定在例如硅质玻璃支持物上(后者称为核酸阵列或微阵列，或称为核酸芯片)。为了使杂交发生，通常使核酸分子热变性或化学变性，以使双链解链成两条单链，和/或除去单链核酸中的发夹结构或其它二级结构。杂交的严格性受诸如温度、盐浓度、离子强度和杂交緩冲液组成等条件的影响。在核酸杂交实验，如DNA和RNA杂交(Southern和Northern杂交)的情况下，"严格杂交条件"和"严格杂交洗涤条件"取决于序列，并且在不同的环境参数下不同。熟练的技术人员知晓可以在杂交和洗涤过程中改变的多种参数，从而保持或者改变严格条件。Tm是在确定的离子强度和pH值下，50%的耙序列与完全匹配的探针杂交的温度。Tm取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在较高温度下特异性杂交。在低于L值16'C到32。C获得最大杂交率。在杂交溶液中存在一价阳离子会减少两核酸链之间的静电排斥作用，从而促进杂合体形成；当钠浓度高达0.4M时，这一作用明显。每个百分点的甲酰胺可使DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度降低0.6到0.7"C，加入50%甲酰胺能够使杂交在30到45"C完成，不过这将降低杂交率。碱基对错配降低杂交率和双链体的热稳定性。平均而言，对于大的探针，每个百分点碱基错配使L值下降约1'C。TU值可以用取决于杂合体类型的下列方程式计算1.DNA-DNA杂合体(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138:267-284，1984):Tm-81.5X:+16.6xlogK)NaT+0.41xO/oG/Cb-500xlLC"画0.61xo/0甲酰胺2.DNA-RNA或RNA-RNA杂合体Tm=79.8+18.5(log10Na+a)+0.58(%G/Cb)+11.8(%G/Cb)2-820/Lc3.寡DNA或寡RNAd杂合体<20个核苷酸Tm=2(/n)20-35个核苷酸Tm=22+1.46(/n)a或对于其它一价阳离子，但是仅在0.01-0.4M范围精确。b仅对于范围30%到75。/。的。/oGC精确。eL-双链体的碱基对长度。d寡，寡核苷酸；ln，引物的有效长度-2x(G/C数)+(A/T数)。S舉对于每1%曱酰胺，4值降低约0.6到0.7°C，而6M尿素的存在可使T^值降低约30°C。杂交特异性通常是杂交后洗涤的函数。为了除去非特异杂交产生的背景，用稀释的盐溶液洗涤样品。这类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度盐浓度越低、洗涤温度越高，洗涤的严格性就越高。洗涤条件通常在等于或低于杂交严格性条件下进行。一般地，如上设置适用于核酸杂交测定或基因扩增检测操作的严格条件。也可以选择更高或更低的严格性条件。通常，对于在确定的离子强度和pH值下的特定序列，选择比热解链温度(Tm)低约50。C的低严格条件。中等严格条件是温度比Tm低2o。c，高严格条件是温度比Tm低iox:。例如，严格条件是至少像例如条件A-L—样严格；降低的严格条件是至少像例如条件M-R—样严格。可以通过许多已知技术中的任一来控制非特异性结合，所述技术诸如，例如用含蛋白质的溶液封闭膜，在杂交緩冲液中添加异源RNA、DNA和SDS，以及用RNA酶处理。下表2列出了杂交和洗涤条件的实例。表2:杂交和洗涤条件的实例<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>t"杂合体长度"是杂交核酸的预期长度。当已知序列的核酸杂交时，可以通过比对序列及鉴别本文所述的保守区域来确定杂合体长度。t在杂交和洗涤緩冲液中，可以用SSPE(1xSSPE是0.15MNaCl，10mMNaH2P04和1.25mMEDTA，pH7.4)代替SSC(1xSSC是0,15MNaCl和15mM柠檬酸钠)；杂交完成后洗涤15分钟。杂交和洗涤可以另外地包括5xDenhardt's试剂、0.5-1.0%SDS、100|ng/ml变性的片段化的鲑精DNA、0.5%焦磷酸钠、和高达50%的甲酰胺。*Tb-Tr:对于预期长度小于50个碱基对的杂合体，杂交温度应该比杂合体的解链温度Tm低5-10。C;根据上述方程式确定Tm。*本发明还包括以PNA或修饰的核酸来取代任一或多个DNA或RNA杂交配偶体。为了定义严格性水平，可以参考Sambrook等(2001)《分子克隆实验室手册》第3版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约，或者CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989)。在用于本发明方法的序列为I类HDZiphox5的情况下，杂交序列编码的多肽从N-末端到C-末端包含(i)酸性盒；和(ii)I类同源域；和(iii)具有5个以上七肽的亮氨酸拉链。优选杂交序列能够在降低的严格条件、优选在严格条件下与表A所示的核酸之一或如上文所定义的其部分杂交。最优选所述部分为SEQIDNO:1所示的核酸的部分。在用于本发明方法的序列为NRT多肽或其同源物编码核酸的情况下，杂交序列为能够在降低的严格条件、优选在严格条件下与NRT核^/基因杂交的核^/基因，所述NRT核^/基因编码的多肽包含MFS一1结构域和位于所述MFS—1结构域C-末端的跨膜结构域，且优选还包含上文定义的一个或多个标签序列。优选杂交序列能够与实施例14表I所示核酸或与表I所示任一核酸的部分杂交，其中"部分"如上文所定义。最优选杂交序列能够与SEQIDNO:52杂交。在用于本发明方法的序列为YEP16多肽或其同源物编码核酸的情况下，杂交序列为这样的核酸序列，其能够在降低的严格条件、优选在严格条件下与编码YEP16多肽或其同源物的核酸序列杂交。优选杂交序列能够在降低的严格条件下与SEQIDNO:127或SEQIDNO:129所示的核酸杂交。在用于本发明方法的核酸为I型shaggy样激酶编码核酸的情况下，杂交序列为这样的核酸，其能够在降低的严格条件、优选在严格条件下与上文定义的I型shaggy样激酶编码核^/基因杂交，所述杂交序列编码的多肽具有(i)与SEQIDNO:147所示的氨基酸序列至少77%的序列同一性；以及(ii)基序I:R/H/V/N/QE/GLKG/N和基序II:KQ/NCXXXG/A/S，其中X可以是任意氨基酸。杂交序列长度至少为1，200个核苷酸。优选杂交序列能够与SEQIDNO:146、SEQIDNO:148、SEQIDNO:150、SEQIDNO:152、SEQIDNO:154、SEQIDNO:156、SEQIDNO:158、SEQIDNO:160、SEQIDNO:162、SEQIDNO:164、SEQIDNO:166、SEQIDNO:168、SEQIDNO:170、SEQIDNO:172、SEQIDNO:174和SEQIDNO:176中任一所示的核酸杂交。本发明因此提供了改良植物生长特性的方法，包括调节植物中能够在降低的严格条件、优选在严格条件下与I类同源域亮氨酸拉链(HDZip)hox5多肽或其同源物编码核酸杂交的核酸的表达；或包括调节植物中能够在降低的严格条件、优选在严格条件下与NRT多肽或其同源物编码核酸杂交的核酸的表达；或包括调节植物中能够在降低的严格条件、优选在严格条件下与YEP16多肽或其同源物编码核酸杂交的核酸的表达；或包括调节植物中能够在降低的严格条件、优选在严格条件下与I型shaggy样激酶或其同源物编码核酸杂交的核酸的表达。核酸或其变体可以来自任何天然或人工的来源。核1基因或其变体可以分离自微生物来源如酵母或真菌，或分离自植物、藻类或动物(包括人类)的天然形式。优选植物来源的核酸，无论来源于同一植物物种(例如对于其待引入的物种而言)或来源于不同植物物种。可以从单子叶物种，优选从禾本科(/Vmce"e)，更优选从稻属，最优选从稻中分离所述核酸。可以从双子叶物种，优选从十字花科(丑m^Zcacefle)，更优选从拟南芥分离所述核酸。可以通过引入遗传修饰(优选在所讨论的基因座)来调节核酸的表达。本文所定义的基因座意指基因组区，其包括目的基因和编码区上游或下游的10kb。例如，可以通过如下任何一种(或多种)方法引入遗传修饰T-DNA激活、TILLING、定点诱变、定向进化和同源重组，或通过在植物中引入和表达I类HDZiphox5多肽或其同源物编码核酸；或通过在植物中引入和表达NRT或其同源物编码核酸；或通过在植物中引入和表达YEP16或其同源物编码核酸；或通过在植物中引入和表达I型shaggy样激酶或其同源物编码核酸。引入遗传修饰之后的步骤是选择表达经调节的核酸，所述表达调节使植物具有改良的植物生长特性，特别是增加的产率。T-DNA激活标记(Hayashi等Science(1992)1350-1353)包括将通常含有启动子(也可以是翻译增强子或内含子)的T-DNA插入在目的基因的基因组区或基因编码区上游或下游10kb,从而在构型上使启动子能够指导耙向基因的表达。通常天然启动子对靶向基因表达的调控被破坏，基因受新引入的启动子控制。启动子一般包含于T-DNA中。此T-DNA随机插入植物基因组，例如，通过农杆菌04g/Y^flCteW"/M)感染插入，并导致在插入T-DNA附近的基因it^达。得到的转基因植物由于引入的启动子附近基因过表达而表现出显性表型。待引入的启动子可以是任意能够在期望生物体内[在本案中是植物l指导基因表达的启动子。例如，组成型的、组织偏好型的、细胞类型偏好型的和诱导型的启动子都适用于T-DNA激活。也可以通过TILLING(靶向诱导的基因组局部突变)技术将遗传修饰引入所讨论的基因座。这是一种诱变技术，用于产生和/或鉴定并分离诱变的变体。TILLING还允许选择携带此类突变变体的植物。这些突变变体甚至可能表现出比天然形式的基因所表现的更高的活性。TILLING将高密度诱变和高通量筛选方法结合在一起。TILLING—般遵循的步骤是(a)EMSi秀变(RedeiGP和KonczC(1992)/"Methodsin爿m^V/o/w/sResearch,KonczC，ChuaNH，SchellJ编著Singapore,WorldScientificPublishingCo，16-82页；Feldmann等(1994)/"MeyerowitzEM，SomervilleCR编著，JniA/^psis.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,137-172页；LightnerJ和CasparT(1998)JMartinez國Zapater，JSalinas编著,MethodsonMolecularBiology,巻82HumanaPress,Totowa，NJ，91-104页)；(b)DNA制备和个体合并；(c)目的区域的PCR扩增；(d)变性和退火以形成杂双链体；(e)DHPLC，其中库中存在的杂双链体会在色镨图上检测到额外的峰；(f)突变个体的鉴定；和(g)突变PCR产物的测序。TILLING的方法是本领域众所周知的(McCallum等(2000)NatBiotechnol18:455-7，由Stemple综述(2004)NatRevGenet5(2):145-50)。定点诱变可用于产生变体核酸。多种方法可用来实现定点诱变，最常用的是基于PCR的方法(CurrentProtocolsinMolecularBiology.Wiley编著，www.4ulr.com/products/currentprotocols/iiidex.html)。定向进化或者说基因改组也可以用来产生核酸变体。这包括DNA改组的重复，随后是适当的筛选和/或选择，以产生具有修饰的生物活性的变体(Castle等，(2004)Science304(5674):1151-4;美国专利5，811，238和6,395,547)。TDNA激活、TILLING、定点诱变和定向进化是能够产生新的等位基因和变体的技术的实例。同源重组能够向基因组中的指定选择位置引入所选的核酸。同源重组是生物科学中常规使用的标准技术,其用于低等生物体如酵母或小立碗藓。在植物中实施同源重组的方法已经不仅在模式植物中描述(Offringa等(19卯)EMBOJ.9(10):3077-84)，而且也在作物植物如稻中描述(Terada等(2002)NatBiotech20(10):1030-4;Iida和Terada(2004)CurrOpinBiotech15(2):132-8)。所耙向的核酸无需靶向所讨论的基因座，而是可以引入到例如高表达区域。所靶向的核酸可以是改良的等位基因，其用于替换内源基因或除内源基因之外再额外引入。引入遗传修饰的优选方法是在植物中引入和表达I类HDZiphox5多肽或其同源物编码核酸；或在植物中引入和表达NRT或其同源物编码核酸；或在植物中引入和表达YEP16或其同源物编码核酸；或在植物中引入和表达I型shaggy样激酶或其同源物编码核酸。引入植物的核酸可以是全长的核酸或者是上文定义的"部分"或杂交序列。在用于本发明方法的序列是YEP16多肽或其同源物的情况下，优选靶向质体；这样将蛋白质靶向质体的方法是本领域众所周知的，就如同使用转运肽进行此类乾向那样。下表3显示了适于将任何YEP16多肽或其同源物耙向质体、优选叶绿体的转运肽的实例。优选〗吏用对于SEQIDNO:128的YEP16多肽序列而言天然的转运肽，其天然转运肽如SEQIDNO:131所示。SEQIDNO:130代表YEP16多肽连同其用于靶向叶绿体的天然转运肽(SEQIDNO:129代表编码SEQIDNO:130的氨基酸序列的核*列)。最优选使用SEQIDNO:131所示的天然转运肽来靼向SEQIDNO:128所示的YEP16多肽，不过任何转运肽都可与YEP16多肽或其同源物一起使用。表3:用于将氨基酸靶向质体的转运肽序列的实例<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>蛋白质的"同源物"包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，其相对于所讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入，并且与其衍生自的未修饰蛋白质具有相似的生物活性和功能活性。为产生这样的同源物，蛋白质的氨基酸可以由具有相似特性(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或打破oc螺旋结构或P片层结构的倾向)的其它氨基酸所替换。保守取代表是本领域众所周知的(例如见Creighton(1984)Proteins.W.H.FreemanandCompany和下表4)。用于根据本发明方法的同源物优选为这样的多文表A和I所示的序歹'J具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的序列同一性或相似性(功能同一性)。术语"同源物"也包括两种特殊形式的同源物，这包括直系同源序列和旁系同源序列，其涵盖用于描述基因祖先关系的进化概念。术语"旁系同源物"与产生旁系同源基因的物种基因组内的基因复制有关。术语"直系同源物"与不同生物体中源于物种形成的同源基因有关。例如，可以通过进行所谓的交互blast搜索容易地找到单子叶植物物种中的直系同源物。以寻找I类HDZiphox5核酸或I类HDZiphox5多肽的直系同源物和旁系同源物为例，这可以通过一次BLAST而实现，包括使用所讨论的序列(例如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2)针对任何序列数据库如可^>共获得的见于http:〃www.ncbi.iilm.iiih.20v的NCBI数据库进行BLAST。当从核苷酸序列开始时，可使用BLASTN或TBLASTX，利用标准缺省值，而当从蛋白质序列开始时，可使用BLASTP或TBLASTN，利用标准缺省值。BLAST结果可以任选地过滤。接着使用过滤的结果或反向BLAST(二次BLAST)。然后比较一次BLAST和二次BLAST的结果。如果二次BLAST的结果将I类HDZiphox5核酸或I类HDZiphox5多肽作为最高相似性的命中事件，则找到了旁系同源物，如果其与一次BLAST中所用的序列来自相同生物的话。在其来自不同于一次BLAST中所用序列的生物，则找到了直系同源物。在大家族的情况下可以使用ClustalW，接着建立邻近连接树，来辅助聚类可视化。和旁系同源物；寻找YEP16编码核酸及YEP16多肽的直系同源物和旁系同源物；以及寻找I型shaggy样激酶编码核酸及I型shaggy样激酶多肽的直系同源物和旁系同源物。同源物可以是蛋白质"取代变体"的形式，即在氨基瞎列中至少有一个残基被除去，并在其位置上插入不同的残基。氨基酸取代通常是单个残基的取代，但是视施加于多肽的功能性限制而定也可以是成簇取代；插入通常在大约1到10个氨基酸残基的数量级。优选氨基酸取代包括保守的氨基酸取代。保守取代表是本领域众容易获得的。下表给出了保守氨基酸取代的实例。表4:保守氨基酸取代的实例<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>同源物也可以是蛋白质的"插入变体"的形式，即在蛋白质的预定位置引入一个或多个氨基酸残基。插入可以包括N-末端和/或C-末端的融合，以及单个或多个氨基酸的内部序列插入。通常，氨基*列内部的插入将小于N-或C-末端的融合，数量级为约1到10个残基。N-或C-末端融合蛋白质或肽的实例包括在酵母双杂交系统中应用的转录激活因子的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白质、(组氨酸)6标签、谷胱甘肽S-转移酶标签、蛋白质A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag*100表位、c-myc表位、FLAG⑥表位、lacZ、CMP(4丐调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白质C表位和VSV表位。蛋白质"缺失变体，，形式的同源物特征在于从蛋白质中除去一个或多个氨基酸。可通过本领域众所周知的肽合成技术，如固相肽合成法等，或通过重组DNA操作容易地得到蛋白质的氨基酸变体。用于产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的DNA序列操作方法是本领域众所周知的。例如，本领域技术人员熟知在DNA预定位置产生取代突变的技术，其包括M13诱变、T7國Gen体外诱变(USB，Cleveland,OH)、QuickChange定点诱变(Stratagene，SanDiego，CA)、PCR介导的定点裔变或其它定点诱变方法。I类HDZiphox5多肽或其同源物；硝酸盐转运蛋白(NRT)或其同源物编码核酸；YEP16多肽编码核酸；以及I型shaggy样激酶或其同源物编码核酸可以是衍生物。"衍生物"包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，与天然产生形式蛋白质的氨基酸序列相比，其可以包括取代、缺失或添加的天然的和非天然产生的氨基酸残基。与天然产生形式多肽的氨基酸序列相比，衍生物可以包括天然存在的改变的、糖基化的、酰基化的、异戊烯化的或非天然产生的氨基酸残基。衍生物还可以包括相对于其源自的氨基酸序列的一个或多个非氨基酸取代，例如共价或非共价地结合于氨基酸序列的报告分子或其它配体，例如与之结合有利于衍生物检测的报告分子，以及相对于天然产生蛋白质的氨基酸序列而言非天然产生的氨基酸残基。I类HDZiphox5多肽或其同源物可以由选择性剪接变体编码；NRT多肽或其同源物可以由选择性剪接变体编码；YEP16多肽或其同源物可以由选择性剪接变体编码；且I型shaggy样激酶或其同源物可以由选择性剪接变体编码。在用于本发明方法的序列是I类HDZiphox5多肽或其同源物编码核酸的情况下，剪接变体编码的多肽从N-末端到C-末端包含(i)酸性盒；和(ii)I类同源域；和(iii)具有5个以上七肽的亮氨酸拉链。另外，I类HDZiphox5多肽或其同源物可以包含如下之一或两者兼而有之(a)Trp尾巴；和(b)RPFF氨基酸基序，其中R为Arg，P为Pro,而F为Phe。在此基序中允许进行任意位置上的一个或多个保守改变，和/或任意位置上的一个或两个非保守改变。当从N-末端到C-末端研究蛋白质时，(b)中的基序位于酸性盒之前。还优选表A所示核酸序列的剪接变体。最优选SEQIDNO:1所示核酸序列的剪接变体。在用于本发明方法的序列为NRT多肽或其同源物或其编码核酸的情况下，剪接变体编码的多肽包含MFS一1结构域和位于所述MFSj结构域C-末端的跨膜结构域，且优选还包含上文定义的一个或多个SEQIDNO:57至64的保守标签序列。还优选表I所示任一核酸的剪接变体。最优选SEQIDNO:52的核酸的剪接变体。在用于本发明方法的序列为YEP16编码核酸的情况下，剪接变体为SEQIDNO:127或SEQIDNO:129所示核酸序列的剪接变体。在用于本发明方法的序列为I型shaggy样激酶或其同源物编码核酸的情况下，选择性剪接变体为SEQIDNO:146、SEQIDNO:148、SEQIDNO:150、SEQIDNO:152、SEQIDNO:154、SEQIDNO:156、SEQIDNO:158、SEQIDNO:160、SEQIDNO:162、SEQIDNO:164、SEQIDNO:166、SEQIDNO:168、SEQIDNO:170、SEQIDNO:172、SEQIDNO:174和SEQIDNO:176中任一所示的核酸的剪接变体还优选剪接变体编码的多肽具有(i)与SEQIDNO:147所示的氨基酸序列至少77%的序列同一性；以及(ii)基序I:R/H/V/N/QE/GLKG/N和基序II:KQ/NCXXXG/A/S，其中X可以是任意氨基酸。本发明因此提供了改良植物生长特性的方法，包括调节植物中I类同源域亮氨酸拉链(HDZip)hox5多肽或其同源物编码核酸的选择性剪接变体的表达；或包括调节植物中NRT多肽或其同源物编码核酸的选择性剪接变体的表达；或包括调节植物中YEP16多肽或其同源物编码核酸的选择性剪接变体的表达；或包括调节植物中I型糖原合酶激酶(I型shaggy样激酶)或其同源物编码核酸的选择性剪接变体的表达。本文所用的术语"选择性剪接变体"包括这样核酸序列变体，其中选择的内含子和/或外显子已被切除、替换或添加、或其中内含子已被缩短或加长。这样的变体将是保留蛋白质生物活性的变体，这可以通过选择性地保留蛋白质的功能性片段来实现。这样的剪接变体可以是天然的或人工的。产生这类剪接变体的方法是本领域众所周知的。同源物可以由I类HDZiphox5多肽或其同源物编码核酸的等位基因变体编码；或由硝酸盐转运蛋白(NRT)或其同源物编码核酸的等位基因变体编码；或由YEP16多肽编码核酸的等位基因变体编码；或由I型shaggy样激酶或其同源物编码核酸的等位基因变体编码。在用于本发明方法的序列是I类HDZiphox5多肽或其同源物编码核酸的情况下，等位基因变体编码的多肽从N-末端到C-末端包含(i)酸性盒；和(ii)I类同源域；和(Hi)具有5个以上七肽的亮氨酸拉链。另外，I类HDZiphox5多肽或其同源物可以包含如下之一或两者兼而有之(a)Trp尾巴；和(b)RPFF氨基酸基序，其中R为Arg，P为Pro,而F为Phe。在此基序中允许进行任意位置上的一个或多个保守改变，和/或任意位置上的一个或两个非保守改变。当从N-末端到C-末端研究蛋白质时，(b)中的基序位于酸性盒之前。还优选表A所示核酸序列的等位基因变体。最优选SEQIDNO:1所示核酸序列的等位基因变体。在用于本发明方法的序列为NRT多肽或其同源物或其编码核酸的情况下，等位基因变体编码的多肽包含MFS—1结构域和位于所述MFS—1结构域C-末端的跨膜结构域，且优选还包含上文定义的一个或多个SEQIDNO:57至64的保守标签序列。还优选表I所示任一核酸的等位基因变体。最优选SEQIDNO:52的核酸的等位基因变体。在用于本发明方法的序列为YEP16编码核酸的情况下，等位基因变体为SEQIDNO:127或SEQIDNO:129所示核酸序列的等位基因变体。在用于本发明方法的序列为I型shaggy样激酶或其同源物编码核酸的情况下，等位基因变体为SEQIDNO:146SEQIDNO:14&SEQIDNO:150、SEQIDNO:152、SEQIDNO:154、SEQIDNO:156、SEQIDNO:158、SEQIDNO:160、SEQIDNO:162、SEQIDNO:164、SEQIDNO:166、SEQIDNO:168、SEQIDNO:170、SEQIDNO:172、SEQIDNO:174和SEQIDNO:176中任一所示的核酸的等位基因变^还优选等位基因变体编码的多肽具有(i)与SEQIDNO:147所示的氨基,列至少77%的序列同一性；以及(ii)基序I:R/H/V/N/QE/GLKG/N和基序II:KQ/NCXXXG/A/S，其中X可以是任意氨基酸。本发明因此提供了改良植物生长特性的方法，包括调节植物中I类同源域亮氨酸拉链(HDZip)hox5多肽或其同源物编码核酸的等位基因变体的表达；或包括调节植物中NRT多肽或其同源物编码核酸的等位基因变体的表达;或包括调节植物中YEP16多肽或其同源物编码核酸的等位基因变体的表达；或包括调节植物中I型糖原合酶激酶(I型shaggy样激酶)或其同源物编码核酸的等位基因变体的表达。等位基因变体天然存在，并且包括在本发明方法中的有这些天然等位基因的用途。等位基因变体包括单核苷酸多态性(SNP)以及小型插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。在大多数生物天然存在的多态性品系中SNP和INDEL形成了最大的一类序列变体。根据本发明，考虑调节核酸或其变体的表达。调节基因或基因产物表达的方法在本领域有详细的记载，并且包括例如用适当的启动子驱动的过表达、转录增强子或翻译增强子的使用。可以将作用为启动子或增强子元件的分离的核酸引入至非异源形式多核苷酸的适当位置上(一般为上游)，从而上调核酸或其变体的表达。例如，可以通过突变、缺失和/或取代来体内改变内源启动子(参见Kmiec,美国专利5，565，350号；Zarling等，PCT/US93/03868)，或者可以将分离的启动子与本发明的基因以适当的方向和距离引入植物细胞中，从而控制基因的表达。降低基因或基因产物表达的方法在本领域有详细的记载。如果期望多肽表达，通常要在多核苷酸编码区的3，端纳入多聚腺苷酸化区域。多聚腺普酸化区域可以源自天然基因、多种其他植物基因或T-DNA。例如，加入的3，端序列可以源自胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因、或可选地源自其他植物基因、或源自任何其他真核基因。也可以在5，非翻译区或部分编码序列的编码序列中加入内含子序列，以增加在细胞溶质中累积的成熟信使的量。已表明纳入植物和动物表达构建体转录单位中的可剪接内含子均可以在mRNA和蛋白质水平使基因表达提高达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cellbiol.8:4395-4405;Callis等(1987)GenesDev.1:1183-1200)。通常这类内含子放置在转录单位5'端附近时，其提高基因表达的作用最大。玉米内含子Adhl-S内含子l、2和6以及Bronze-l内含子的使用是本领域公知的。通常见TheMaizeHandbook,116章，Freeling和Walbot编著，Springer,N.Y.(1994)。本发明还提供遗传构建体和载体，以促进用于本发明方法的核苷*列的引入和/或表达。因此，提供的基因构建体含有(i)I类HDZiphox5核酸或其变体；或NRT编码核酸或其变体；或YEP16编码核酸或其变体；或I型shaggy样激酶编码核酸或其变体；(ii)一个或多个能够驱动(i)中核酸序列表达的控制序列；和任选的(iii)转录终止序列。可以使用本领域^L术人员熟知的重组DNA技术构建用于本发明方法的构建体。可以将基因构建体插入可商购的、适合于转化进入植物并适于在转化的细胞中表达目的基因的载体中。本发明因此提供了如上文所定义的基因构建体在本发明方法中的用途。用含有目的序列的载体转化植物。将目的序列有效连接于一个或多个控制序列(至少连接于启动子)。术语"调控元件"、"控制序列"和"启动子"在本文都可互换使用，从广义上是指能够影响与之相连的序列表达的调控核酸序列。上述术语包括源自典型真核生物基因组基因的转录调控序列(包括具有或没有CCAAT盒序列的TATA盒，其对于精确的转录起始是必需的)，以及其他的调控元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)，其通过应答发育刺激和/或外部刺激或以组织特异的方式改变基因表达。该术语还包括经典原核生物基因的转录调控序列，在此情况下可以包括-35盒序列和/或-10盒转录调控序列。术语"调控元件"也包括合成的融合分子或衍生物，其赋予、激活或增强细胞、组织或器官中核酸分子的表达。本文所用的术语"有效连接"指启动子序列和目的基因之间的功能性连接，从而启动子序列能够起始目的基因的转录。有利地，可以使用任何类型的启动子驱动核酸序列的表达。启动子可以是组成型启动子，即应答发育、化学、环境或物理刺激而具有诱导的或增加的转录起始。诱导型启动子的实例是胁迫诱导型启动子，即当植物接触多种胁迫条件时激活的启动子。另外或可选的，启动子可以是组织偏好型的启动子，即能够在某些组织，如在叶、根、种子等组织中优先起始转录的启动子。能够仅在某些组织中起始转录的启动子在本文称为"组织特异性"启动子。优选I类HDZiphox5核酸或其变体；NRT编码核酸或其变体；YEP16编码核酸或其变体；I型shaggy样激酶编码核酸或其变体有效连接于组成型启动子。组成型启动子在大多数但无需所有生长和发育阶段转录激活，并且是基本上普遍表达的。组成型启动子优选为GOS2启动子，更优选组成型启动子为稻GOS2启动子，还优选组成型启动子如基本上类似于SEQIDNO:33或SEQIDNO:178的核酸序列所示，最优选组成型启动子如SEQIDNO:33或SEQIDNO:178所示。应该明确本发明的应用并不局限于由GOS2启动子驱动的I类HDZiphox5核酸或其变体；NRT编码核酸或其变体；或I型shaggy样激酶编码核酸或其变体。其它也可用于实施本发明方法的组成型启动子的实例显示于下表5。表5:组成型启动子的实例<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>为了鉴定功能等同的启动子，可以通过例如将启动子有效连接于净艮告基因并在多种植物组织中测定才艮告基因的表达水平和模式，来分析候选启动子的启动子长度和/或表达模式。适宜的众所周知的报告基因包括例如p-葡萄糖醛酸酶或p-半乳糖苷酶。通过测量p-葡萄糖醛酸酶或p-半乳糖苦酶的酶促活性来测定启动子活性。然后可以将启动子长度和/或表，式与参照启动子(例如本发明方法中所用的启动子)进行比较。可选地，可以通过定量mRNA水平或通过将本发明方法中所用核酸的mRNA水平与持家基因如18SrRNA的mRNA水平相比较来测定启动子长度，利用本领域公知的方法，如Northern印迹联合放射自显影图像的光密度分析、实时定量PCR或RT-PCR(Heid等，1996GenomeMethods6:986-994)。"弱启动子"通常指以低水平驱动编码序列表达的启动子。"低水平，，指每个细胞中约1/10,000的转录物到约1/100,000的转录物，到约1/500,0000的转录物。相反，"强启动子"以高水平驱动编码序列表达，或每个细胞中约1/10的转录物到约1/100的转录物到约1/1,000的转录物。任选地，还可以在引入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。术语"终止子"包括控制序列，其为位于转录单位末端的DNA序列，传递初级转录物的3'加工和多聚腺苷酸化信号以及转录终止信号。另外的调控元件可以包括转录及翻译增强子。本领域技术人员将知道适用于实施本发明的终止子和增强子的序列。这类序列为本领域技术人员所公知或者可以容易地获得。本发明的遗传构建体还可以包括在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制起点序列。一个实例是需要将遗传构建体作为附加型遗传元件(如质粒或粘粒分子)在细菌细胞中维持的情况。优选的复制起点包括但不限于fl-ori和colEl。遗传构建体可任选地含有可选择标记基因。如本文所用，术语"可选择标记基因"包括赋予细胞表型的任何基因，该基因在细胞中表达，有利于鉴定和/或选择经本发明的核酸构建体转染或转化的细胞。为检测本发明方法所用核酸序列的成功转移，和/或选择含有这些核酸的转基因植物，最好使用标记基因(或报告基因)。因此遗传构建体可任选地含有可选捧标记基因。如本文所用，术语"可选择标记"、"可选择标记基因"或"报告基因"包括赋予细胞表型的任何基因，该基因在细胞中表达，有利于鉴定和/或选择经本发明的核酸构建体转染或转化的细胞。这些标记基因能够通过一系列不同的原理鉴定核酸分子的成功转移。适当的标记可以选自赋予抗生素或除草剂抗性的标记，其引入新的代谢性状或允许可视选择。可选择标记基因的实例包括赋予抗生素抗性的基因(例如磷酸化新霉素和卡那霉素的或磷酸化潮霉素的A冉、或者赋予对例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(G418)、壮观霉素或杀稻瘟菌素的抗性的基因)，赋予除草剂抗性的基因(例如提供Basta抗性的提供草甘膦抗性的或g似、或者赋予对例如咪唑啉酮、膦丝菌素或磺胺脲的抗性的基因)，或者提供代谢性状的基因(例如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的附""^，或木糖利用的木糖异构酶，或抗营养标记如对2-脱氧葡萄糖的抗性)。可视标记基因的表达导致形成颜色(例如P-葡萄糖醛酸酶GUS或p-半乳糖苷酶及其着色底物，例如X-Gal)、发光(例如荧光素/荧光素酶系统)或荧光(缘色荧光蛋白GFP及其衍生物)。此清单仅仅代表一小部分可能的标记。技术人员对这类标记极为熟悉。优选根据不同生物体和选择方法来使用不同的标记。已知核酸稳定或瞬时整合进植物细胞，仅少数细胞摄入外来DNA，并整合进其基因组，这取决于所用的表达载体和所用的转染技术。为鉴定并选择这些整合体，通常将编码可选择标记(如上文所述的那些)的基因与目的基因一起引入宿主细胞中。这些标记可在突变体中使用，所述突变体中原有的这些基因没有功能，例如通过常规方法而缺失。此外，编码可选择标记的核酸分子与编码本发明或本发明方法所用多肽的序列可以在同一个载体中引入宿主细胞，或者在单独的载体中。由所引入的核酸稳定转染的细胞可以例如通过选择(例如，整合有可选择标记的细胞存活而其他细胞死去)予以鉴定。一旦成功引入核酸，将不再需要或不期望转基因宿主细胞中存在标记基因，特别是抗生素和除草剂抗性基因，所以根据本发明引入核酸的方法有利地采用能够除去或切除这些标记基因的技术。一种这样的方法是称为共转化的方法。共转化法采用两个载体同时进行转化，一个载体携带根据本发明的核酸，而第二个携带一个或多个标记基因。较大比例的转化体接收或者对于植物而言含有(高达40%或以上的转化体)两个载体。对于农杆菌转化，转化体通常只接收载体的一部分，即为T-DNA所侧接的序列，其通常指表达盒。随后可通过杂交从转化植物中除去标记基因。在另一种方法中，利用整合进转座子的标记基因与期望的核酸一起进行转化(称为Ac/Ds^支术)。转化体可与转座酶来源杂交，或者用赋予转座酶表达的核酸构建体瞬时或稳定转化转化体。在有些情况下(约10%),—旦成功进行了转化，转座子跳出宿主细胞基因组并丟失。在其他一些情况下，转座子跳至不同的位置。在这些情况下，必须通过杂交消除标记基因。在^:生物学领域，研发了有可能或便于检测此类事件的技术。另一有利的方法有赖于称为重组系统的方法，其优势在于可以免除杂交消除步骤。最著名的这类系统称为Cre/lox系统。Crel为重组酶，其切除位于loxP序列之间的序歹'J。如果标记基因整合在loxP序列之间，一旦成功进行了转化，由于该重组酶的表达，其得以切除。其他重组系统有HIN/HIX、FLP/FRT及REP/STB系统(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，2000:22255-22267;Velmurugan等，J.CellBiol.，149，2000:553-566)。根据本发明的核酸序列有可能位点特异性地整合进植物基因组。这些方法自然也可以应用于微生物如酵母、真菌或细菌。在优选的实施方案中，提供的基因构建体含有(i)I类HDZiphox5核酸或其变体；或NRT编码核酸或其变体；或I型shaggy样激酶编码核酸或其变体；(ii)能够驱动(i)中核酸序列表达的组成型启动子；和任选的(iii)转录终止序列。组成型启动子优选为GOS2启动子，更优选组成型启动子为稻GOS2启动子，还优选组成型启动子如基本上类似于SEQIDNO:33或SEQIDNO:178的核酸序列所示，最优选组成型启动子如SEQIDNO:33或SEQIDNO:178所示。本发明还提供了如上文所定义的构建体在本发明方法中的用途。在另一优选的实施方案中，提供的基因构建体含有(i)YEP16编;马核酸或其变体；(ii)能够驱动(i)中核酸序列表达的种子特异性启动子；和任选的(iii)转录终止序列。本发明还包括可由本发明方法获得的植物。本发明因此提供可由本发明方法获得的植物、植物部分(包括植物细胞)，所述植物或部分(包括细胞)I类HDZiphox5核酸或其变体转基因；或NRT编码核酸或其变体转基欧或YEP16编码核酸或其变体转基因；或I型shaggy样激酶编码核酸或其变体转基因。本发明还提供相对于相应的野生型或其他对照植物生产具有改良的生长特性、特别是增加的产率的转基因植物的方法，包括在植物中引入和表达本文所述的用于本发明方法的任何核酸。出于本发明的目的，"转基因的"、"转基因"或"重组"是指，例如，核酸序列、含有所述核酸序列的表达盒、基因构建体或载体、或用所述核酸序列、才艮据本发明的表达盒或载体转化的生物体，通过重组方法产生的所有那些构建体，其中a)编码用于本发明方法的蛋白质的核酸序列，或b)有效连接于根据本发明核酸序列的遗传控制序列，例如启动子，或c)a)和b)不存在于其天然遗传环境中，或者已通过重组方法^爹饰，有可能修饰采取的形式为例如一个或多个核苷酸残基的取代、添加、缺失、倒位或插入。天然遗传环境应理解为原始植物中的天然基因组或染色体座位或者存在于基因组文库之中。在基因组文库的情况下，优选维持核g列的天然遗传环境，至少是部分地维持。至少在核酸序列一側侧接的环境序列长度至少为50bp、优选至少500bp、特别优选至少1000bp、最优选至少5000bp。当天然存在的表达盒——例如核酸序列的启动子与编码如上文定义的用于本发明方法的蛋白质的相应核酸序列之间天然存在着的组合一一经非天然的合成("人工")方法如诱变处理修饰时，此表达盒变成转基因表达盒。例如，合适的方法描述在US5，565，350或WO00/15815中。更具体地，本发明提供生产具有改良的生长特性(特别是增加的产率)的转基因植物的方法，所述方法包括(i)向植物、植物部分或植物细胞中引入和表达I类HDZiphox5核酸或其变体；NRT编码核酸或其变体；YEP16编码核酸或其变体；I型shaggy样激酶编码核酸或其变体；和(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。可以将核酸直接引入植物细胞或植物本身(包括引入组织、器官或植物的任何其它部分)。根据本发明的优选方面，优选通过转化将核酸引入植物。本文所提及的术语"转化"包括将外源多核苷酸转移进宿主细胞，不考虑转移所用的方法。能够通过器官发生或者胚胎发生随即克隆增殖的植物组织都可以用本发明的遗传构建体转化，并从其再生整个植物。具体的组织选择将因可提供和最适于转化的具体物种的克隆增殖系统而变。示例性的靼组织包括叶盘、花粉、胚、子叶、胚轴、雌配子、愈伤组织、既有的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)，以及诱导的分生组织(例如子叶分生组织和胚轴分生组织)。可以将多核苷酸瞬时地或稳定地引入宿主细胞，并且可以，例如作为质粒保持非整合的状态。可选地，其可以整合进入宿主基因组。得到的转化植物细胞可以接着以本领域技术人员公知的方式再生为转化的植物。植物物种的转化目前是一种相当常规的技术。有利地，可以使用多种转化方法的任一向适当的祖先细胞引入目的基因。转化方法包括用脂质体、电穿孔、增强游离DNA摄取的化学物质、直接向植物注射DNA、粒子枪轰击、用病毒或花粉转化以及显微注射。方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens,F.A.等(1882)Nature296，72-74;NegrutiuI.等(1987)PlantMol.Biol.8:363-373);原生质体的电穿孔法(ShillitoR.D.等(1985)Bio/Technol3，1099-1102);植物材料的显微注射(CrosswayA.等(1986)Mol.GenGenet202:179-185);DNA或RNA包被的粒子轰击(KleinT.M.等(1987)Nature327:70);(非整合的)病毒感染，等等。优选使用任何熟知的稻转化方法，通过农杆菌介导的转化，产生表达基因的转基因稻植物，例如在以下任一文献中描述的方法公开的欧洲专利申请EP1198985Al，Aldemita和Hodges(Planta，199:612-617，1996);Chan等(PlantMol.Biol.22(3)491-506,1993)，Hiei等(PlantJ.6(2):271-282，1994),其^^开的内容如同充分阐述的那样并入本文作为参考。至于谷物转化，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol.14(6):745-50，1996)或Frame等(PlantPhysiol.129(1):13-22，2002)中所述，其公开的内容如同充分阐述的那样并入本文作为参考。通常在转化后，选出存在一个或多个标记的植物细胞或细胞群，所述标记由与目的基因共转移的植物可表达基因编码，其后将转化的材料再生成完整植物。在DNA转移和再生之后，可评估推定转化的植物，例如用Southern分析评价目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造。可选的或额外地，可用Northern和/或Western分析(蛋白质印迹)或定量PCR监测新引入DNA的表达水平，所有技术都是本领域普通技术人员所熟知的。产生的转化植物可以通过多种方式繁殖，如通过克隆繁殖或经典的育种技术。例如，第一代(或Tl)转化的植物可自交以得到纯合的第二代(或T2)转化体，而T2植物可进一步通过经典育种技术繁殖。产生的转化生物体可以有多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆的转化体(例如经过转化包含表达盒的所有细胞)；转化和非转化组织的嫁接体(例如在植物中，转化的根茎嫁接到非转化的接穗上)。本发明显然延及由本文所述任何方法产生的任何植物细胞或植物，以及所有的植物部分和其繁殖体。本发明还延及涵盖由任意上述方法产生的初级转化或转染的细胞、组织、器官或整个植物的后代，所述后代的唯一要求是与本发明方法中亲本呈现相同的基因型和/或表型特性。本发明也包括含有分离的I类HDZiphox5核酸或其变体的宿主细胞；含有分离的NRT编码核酸或其变体的宿主细胞；含有分离的YEP16编码核酸或其变体的宿主细胞；含有分离的I型shaggy样激酶编码核酸或其变体的宿主细胞。优选的宿主细胞是植物细胞。本发明也延及植物可收获的部分，例如但不限于种子、叶、果实、花、茎、根茎、块茎和球茎。本发明还涉及由这样的植物的可收获部分直接衍生的产品，如干丸或干粉、油类、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。本发明还包括I类HDZiphox5核酸或其变体的用途以及I类HDZiphox5多肽或其同源物的用途；NRT编码核酸或其变体的用途以及NRT多肽或其同源物的用途；YEP16编码核酸或其变体的用途以及YEP16多肽或其同源物的用途；I型shaggy样激酶编码核酸或其变体的用途以及I型shaggy样激酶多肽或其同源物的用途。这样的用途涉及改良如上文所定义的任何植物生长特性。可以在育种程序中^f吏用I类HDZiphox5核酸或其变体、或者I类HDZiphox5多肽或其同源物；NRT编码核酸或其变体、或者NRT多肽或其同源物；YEP16编码核酸或其变体、或者YEP16多肽或其同源物；I型shaggy样激酶编码核酸或其变体、或者I型shaggy样激酶多肽或其同源物，其中鉴定可以遗传地连接于前述基因或其变体之一的DNA标记。可以使用所述核酸或变体或者多肽或其同源物界定分子标记。然后可以在育种程序中使用此DNA或蛋白质标记，以选择具有改良的生长特性(如增加的产率)的植物。所述核酸或变体如上文所定义。I类HDZiphox5核1基因；NRT编码核^/基因；YEP16编码核^/基因；I型shaggy样激酶编码核^/基因的等位基因变体也可以用于标记辅助的育种程序。这类育种程序有时需要使用例如EMS诱变，通过植物诱变处理引入等位基因变体；可选地，此程序可以以收集无意产生的所谓"天然，，起源的等位基因变体开始。然后通过例如PCR鉴定等位基因变体。随后是选择步骤，用以选择所讨论序列的较好等位基因变体，所述等位基因变体提供改良的生长特性，如增加的产率。一般通过监测含有所研究序列不同等位基因变体的植物的生长行为来进行选择，例如任何本文所述的用于本发明方法的核^/基因的不同等位基因变体。可以在温室或田地中监测生长行为。更多任选的步骤包括将经鉴定含有较好等位基因变体的植物与其他植物杂交。例如，可使用这种方法产生目的表型特征的组合。前述核酸及变体还可以作为探针，用于对为那些基因的一部分并作为其连锁性状标记的基因进行遗传和物理作图。这样的信息可以在植物育种中使用，以得到具有期望表型的品系。所述核酸或变体的这类应用仅需要长至少15个核苷酸的核酸序列。所述核酸或变体可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。可用所述核酸或变体探测限制酶切消化的植物基因组DNA的Southern印迹(SambrookJ，FritschEF和ManiatisT(1989)《分子克隆实验室手册》)。随后使用计算机程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics1:174-181)对产生的带型进行遗传分析，以构建遗传图谱。此外，可以4吏用核酸探测含有一组个体的限制性内切酶处理的基因组DNA的Southern印迹，所述一组个体为代表明确的遗传杂交(geneticcross)的亲本和子代的一组个体。记录DNA多态性的分离，并用于计算在先前用此群体获得的遗传图镨中所示核酸或变体的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32:314-331)。在遗传作图中使用的植物基因衍生探针的产生和用途描述于Bematzky和Tanksley(1986)PlantMol.Biol.Reporter4:37-41中。众多出版物中描述过用上述方法或其变通形式对特定cDNA克隆进行遗传作图。例如，可以使用F2杂交群体、回交群体、随机交配群体、近亲同基因系及其它个体组作图。这类方法是本领域技术人员众所周知的。核酸探针也可以用于物理作图(即在物理图语上安置序列；见Hoheisel等，/"Non-mammalianGenomicAnalysis:APracticalGuide,Academicpress1996，319-346页，及其中引用的参考文献)。在另一实施方案中，核酸探针可用于直接荧光原位杂交(FISH)作图(Trask(1991)TrendsGenet.7:149-154)。尽管目前FISH作图的方法倾向施用大的克隆(几个kb到几百个kb;见Laan等(1995)GenomeRes.5:13-20)，但是灵敏性的提高允许在FISH作图中应用较短的探针。用于遗传和物理作图的多种基于核酸扩增的方法可以使用所述核酸进行。实例包括等位基因特异性扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med11:95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS;Sheffield等(1993)Genomics16:325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等(1988)Science241:1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)NucleicAcidRes.18:3671)、放射杂交作图(Walter等(1997)Nat.Genet.7:22-28)和Happy作图(Dear和Cook(1989)NucleicAcidRes.17:6795-6807)。为实施这些方法，使用核酸序列设计和产生用于扩增反应或引物延伸反应的引物对。这类引物的设计是本领域技术人员众所周知的。使用基于PCR的遗传作图的方法，可能需要鉴定跨越相应于本发明核酸序列区域作图的亲本之间的DNA序列差异。然而，这对作图方法通常不是必要的。才艮据本发明的方法得到如前所述具有改良的生长特性的植物。这些改良的生长特性还可以组合其它经济上有利的性状，如其他增产性状、对其他生物和非生物胁迫的耐受性、改良多种构造特征和/或生物化学和/或生理学特征的性状。现参考以下附图描述本发明，其中图l显示了不同植物来源的I类HDZip同源域的多重比对，使用的是VNTIAlignX多重比对程序，基于改进的ClustalW算法(InforMax,Bethesda,MD,http:〃www.infonnaxinc.com)，采用缺省i殳置，空位开方文罚分为IO，空位延伸罚分为0.05。同源域不变氨基酸Lw、W48、F49、Nsi和Rs3纵向加框表示。I类HDZip偏好氨基酸A"和Ws6同样纵向加框表示。DNA结合所必需的3个螺旋在比对上方以黑框标注。6个七肽以垂直线隔开。每个七肽内的7个位置命名为a、b、c、d、e、f和g位。Leu位于每个七肽的d位，且纵向加框表示。图2显示了多个植物I类HDZiphox5多肽的多重比对，使用的是VNTIAlignX多重比对程序，基于改进的ClustalW算法(InforMax，Bethesda,MD,http:〃www.informaxinc.com)，采用缺省i殳置，空位开放罚分为10,空位延伸罚分为0.05。从N-末端到C-末端方向表征的3个主要结构域重度加框表示，并鉴定为酸性盒、I类同源域和6个七肽亮氨酸拉链。另外，Trp尾巴和RPFF氨基酸基序轻度加框表示。图3显示了双元载体，用于在稻中表达处于GOS2启动子控制之下的稻I类HDZiphox5。图4详述了用于实施本发明方法的I类同源域亮氨酸拉链(HDZip)hox5序列的实例。多个序列来自于公共EST拼接(见表A)，测序质量较低。因此预期可能存在少数核酸取代的情况。核酸序列以起始(ATG)和终止密码子界定。图5显示了用于本发明方法的NRT蛋白的典型结构域结构，此处以SEQIDNO:53作为示范。SEQIDNO:53的蛋白质包含始于S69止于F432的以粗体显示的MFS—1结构域。此MFS—1结构域C末端存在推定的跨膜结构域(T441至P463，以下划线标出)。图6显示了(a)系统发生树，其中SEQIDNO:126表示稻NRT1蛋白序列，含PTR2结构域；和(b)实施例14表I所示序列的多重比对。多重比对中的星号表示氨基酸在所比对的序列中相同，分号表示保守取代，而点表示次保守取代。图7显示了双元载体，用于在稻中表达处于GOS2启动子控制之下的稻NRT蛋白编码核酸。图8详述了用于(除SEQIDNO:125和SEQIDNO:126之夕卜)实施本发明方法的NRT序列的实例。SEQIDNO:125和SEQIDNO:126序列很可能不是全长序列。图9显示了双元载体，用于在稻中表达处于油质蛋白启动子控制之下的拟南芥YEP16编码核酸。图IO显示了用于本发明方法的YEP16序列。图11摘自Planta(2003)218:1-14(Wang等)，显示了植物对非生物胁迫的应答。初级胁迫如干旱、盐度、冷、热和化学污染通常互相联系，并引起细胞损害和次级胁迫，如渗透和氧化胁迫。初始的胁迫信号(如渗透和离子效应、或温度、膜流动性变化)触发下游信号传导过程和转录控制，从而激发胁迫应答机制以重建稳态，并保护和修复受损的蛋白质和膜。信号传导和基因激活过程中一个和多个步骤应答不足，可能会最终引起细胞稳态不可逆的变化，并引起功能和结构蛋白以及膜的破坏，导致细胞死亡。图12摘自TRENDSinplantScienceVol.7，No.10，2002年10月(ClaudiaJonak和HeribertHirt),显示了植物中可能的shaggy样激酶路径。爿&SK1为高盐应答的正调控因子。WIG(创伤诱导型GSK)牵涉到创伤信号传导。^^SKll和J6ia2参与正确的开花才莫式。遗传和生物化学分析表明了BIN2(油菜素辑醇非敏感型-l)介导的油菜素甾醇(BR)信号传导，这控制着BES1(BRll-EMS-阻遏物l)和BRZ1(brassinazole-抗性因子l)的核累积。图13摘自TRENDSinplantScienceVol.7，No.10，2002年10月(ClaudiaJonak和HeribertHirt),显示了(a)10种拟南芥糖原合酶激酶3/SHAGGY样蛋白质激酶(GSK)的系统发生分析。拟南芥GSK可以归为4个亚型。(b)从多次BLAST搜索获得的不同植物物种的全长GSKcDNA的系统发生树。欧洲油菜BSK0(Y12674);紫花苜蓿MSK1(X68411>MSK2(X68410)、MSK3(X68409)、MSK4(AF432225)、WIG(AJ295939);烟草NSK6(Y08607)、NSK59(AJ002315)、NSK91(AJ224163)、NSK111(AJ002314)、NTK-1(X77763);稻OSKy(AB59612)、OSKt](Y13437);矮牵牛PSK4(X83619)、PSK6(AJ224164)、PSK7(AJ224165)、SPK6(X83620)。比对利用ClustalX通过邻近连接法以拟南芥MPKl(Q39021)作为外类群(out-group)进行；系统发生树以TreeView程序设计。图14显示了植物I型shaggy样激酶的CLUSTAL多重比对。基序I和基序II加框表示。图15显示了双元载体，用于在稻中表达处于GOS2启动子控制之下的稻I型shaggy4羊激酶。图16详述了用于实施本发明方法的I型shaggy样激酶序列的实例。实施例现参考以下实施例描述本发明，所述实施例仅意在举例说明，而非旨在彻底地限定或以其他方式限制本发明的范围。除非另外说明，重组DNA技术根据描述于(Sambrook(2001)《分子克It:实验室手册》，第三版，冷泉港实验室出亂冷泉恭纽约)或者Ausubd等(1994)，CurrentProtocolsinMolecularBiology,CurrentProtocols第一巻和第二巻的标准方法执行。植物分子工作的标准材料和方法由R.D.D.Croy描述于PlantMolecularBiologyLabfax(1993)，BIOSScientificPublicationsLtd(UK)和BlackwellScientificPublications(UK)出版。辦/类及"Z^》狄5,應及竊竭淨/y,滋辨/.7VO:2和S五2/D7Va'2时姿定利用数据库序列搜索工具如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410;和Altschul等(1997)NucleicAcidsRes.25:3389-3402)在美国国家生物技术信息中心(NCBI)Entrez核苷酸数据库维护的序列中鉴定序列(全长cDNA、EST或基因组)。通常BLAST程序通过将核酸或多肽序列与序列数据库进行比较，以及通过计算匹配的统计学显著性，用于寻找序列之间具有局部相似性的区域。例如，对核酸SEQIDNO:l所编码的多肽运用TBLASTN算法，使用缺省设置，开启过滤器，以忽略低复杂度序列。分析的输出视窗为两两比较，并根据概率分值(E值)排序，其中分值反映特定比对偶然发生的概率(E值越低，命中事件的显著性越高)。除了E值之外，还对比较进行同一性百分比记分。同一性百分比是指两比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度上的相同核苷酸(或氨基酸)数。在有些情况下，可以调整缺省参数以更文搜索的严格度。例如，可以增加E值以显示低严格度的匹配事件。通过这种方式可以鉴定短的几乎精确匹配的事件。下表A提供了与SEQIDNO:1的核酸序列相关的核酸序列列表。表A:与SEQIDNO:1的核酸序列相关的序列的实例<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>*由多个EST登录号(显示了主要的EST)拼接的重叠群；EST测序质量通常较低，预期可能会有少数核酸取代。**来自胡萝卜和大豆的序列，与其登录号相比进行了订正。^滋辨2:/类/)Z&A狄5使用来自VectorNTI(英骏公司，Invitrogen)的AlignX，其基于流行的渐进式比对Clustal算法(Thompson等(1997)NucleicAcidsRes25:4876-4882;Chenna等(2003)NucleicAcidsRes31:3497-3500)。可利用邻近连接聚类算法构建系统发生树。缺省值为空位开放罚分IO，空位延伸罚分O，l,且选择的权重矩阵为Blosum62(如果比对多肽的话)。所述多重序列比对的结果示于图2。从N-末端到C-末端方向表征的3个主要结构域重度加框表示，并鉴定为酸性盒、I类同源域和6个七肽亮氨酸拉链。"保守结构域"包含这3个结构域。另外，Trp尾巴和RPFF氨基酸基序轻度加框表示。/类#Z>Z*A狄5^农^/y之/^^局/^一^全长I类HDZiphox5多肽序列之间的全局相似性和同一性百分比利用矩阵全局比对工具(MatGAT)软件(BMCBioinformatics.20034:29.MatGAT:anapplicationthatgeneratessimilarity/identitymatricesusingproteinorDNAsequences.CampanellaJJ，BitinckaL,SmalleyJ;由LedionBitincka托管的软件)来确定。MatGAT软件无需对数据进行预比对，即可产生DNA或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵。该程序利用Myers和Miller全局比对算法(空位开放罚分为12，而空位延伸罚分为2)进行一系列的两两比对，利用例如Blosum62(对于多肽而言)计算相似性和同一性，然后将结果排列成距离矩阵。序列相似性示于对角线下半部，而序列同一性示于对角线上半部。比较所用的参数有i己分矩阵Blosum62首个空位12延伸空位2多肽序列全长范围(将部分多肽序列排除在外)的全局相似性和同一性的软件分析结果示于表B1。对角线上方给出同一性百分比，而对角线下方给出相似性百分比。与SEQIDNO:2比较，多肽序列之间的同一性百分比显示可低至29%。表B1:多肽序列全长范围的全局相似性和同一性的MatGAT结果<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>如上文所定义的那样，I类HDZiphox5多肽序列的"保守结构域"从N-末端到C-末端包含酸性盒、I类同源域和6个七肽亮氨酸拉链(见图2)。当对保守结构域而不是全长多肽序列进行同一性百分比分析时，观察到同一性百分比升高，如表B2所示。与SEQIDNO:2比较，现在最低值高于50%氨基酸同一性。表B2:多肽序列"保守结构域"的全局相似性和同一性MatGAT结果<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>/类HDZf;p/^c5/农淨^/逸舍的潜游械时蒌;C蛋白质家族、结构域和位点整合资源(IntegratedResourceofProteinFamilies,DomainsandSites(InterPro))数据库是进行基于文本以及序列的搜索常用的标签数据库的整合界面。InterPro数据库将这些数据库结合起息，以获得蛋白质标签。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAMs。Interpro由位于英国的欧洲生物信息学研究所(EuropeanBioinformaticsInstitute)托管。SEQIDNO:2所示多肽序列的InterPro扫描结果示于表C。表C:SEQIDNO:2所示多肽序列的InterPro扫描结果<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>用以确定多肽结构域是否富含特定氨基酸(例如酸性盒)的一级氨基酸组成(以％计)可以利用来自ExPASy服务器的软件程序，特别是ProtParam工具(GasteigerE等(2003)ExPASy:theproteomicsserverforin画depthproteinknowledgeandanalysis.NucleicAcidsRes31:3784誦3788)进行计算。然后可以将目的多肽序列的组成与Swiss-Prot蛋白质序列数据库中的平均氨基酸组成(以％计)进行比较。下表(表D)对SEQIDNO:2的酸性盒中的％Asp(D)、％Glu(E)及其组合含量与Swiss-Prot蛋白质序列数据库中的平均值进行了比较。表D<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>酸性盒可以是转录激活结构域中的一部分。已根据真核转录激活结构域的氨基酸含量对其进行了分类，且主要的类别包括酸性、谷氨酰胺富含和脯氨酸富含激活结构域(Rutherford等(2005)PlantJ.43(5):769-88，及其中的参考文献)。基因本体论(GO)联合会是多种生物学数据库科学家之间的国际性合作，其编辑部建在欧洲生物信息学研究所。GO的目标在于为描述基因产物的分子功能、生物过程和细胞组分提供可控的词汇表。当进行上文所述的InterPro扫描时，我们也对GO数据库进行了搜索。I类HDZiphox5多肽序列具有的分子功能为转录因子活性和序列特异性DNA结合活性，并位于植物细胞的细胞核中(见下表(表E))。表E<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>同源盒相关的细胞组分细胞核(GO:0005634)利用专业软件如2ZIP进行亮氨酸拉链预测和七肽鉴定，该软件将标准巻曲螺旋预测算法和特征性亮氨酸重复单位的模拟搜索结合在一起(Bornberg曙Bauer等(1998)ComputationalApproachestoIdentifyLeucineZippers,NucleicAcidsRes.,26(11):2740-2746，由4立于德国Golm的马克斯普朗克研究所(MaxPlanckInstitut)托管)。利用此软件可以鉴定潜在的亮氨酸拉链、亮氨酸重复单位和巻曲螺旋。I类HDZiphox5多肽序列含亮氨酸拉链预测，具有至少5个、优选6个七肽。当对SEQIDNO:2的多肽运行此算法时，发现潜在的亮氨酸来联位于第143-178位，如下文输出所示(数字表示氨基酸位置，C表示巻曲螺旋区域，而L表示七肽内部的亮氨酸)i---------n--------21--------31--------41--------51--------mdpgrvvfdsgvarracpggaqmllfggggsansggffrgvpaavlgmdesrssssaaga61--------71--------81--------91--------101-------111-------gakrpffttheelleeeyydeqapekkrrltaeqvqmlersfeeenkleperktelarrl121-------131-------141-------151-------161-------171-------gmaprqvavwfqnrrarwktkqlehdfdrlkaaydalaadhhallsdndrlraqvislteccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccl------l------l------l------l------llzlzlzlzlzlzlzlzlzlzlzlzlzlzlzlzlzlz181-------191-------201-------211-------221-------231-------klqdketspssatittaaqevdqpdehteaasttgfatvdgalaapppghqqpp服ddlvcccccccc241-------251-------261-------271-------281-------291-------ssggtnddgdggaavvvfdvteg緒drlscesayfadaaeayerdcaghyalsseeedgg301-------311-------321-------331-------341------AVSDEGCSFDLPDAAAAAAAMFGAAGWHHDAADDEEAQLGSWTAWFWS其滋辦6:/类HZ)^pA欣5/农y^/i/时浙;tI类HDZiphox5多肽或其同源物具有DNA结合活性，优选结合在中心位置处重叠的5bp半位点，即CAA(A/T)ATTG，如在酵母单杂交试验中检测到的那样(Meijer等(2000)MolGenGenet263:12-21)。在稻细胞悬浮液的瞬时测定中，与GUS报告基因共同轰击I类HDZiphox5多肽据报道导致染色斑点数目增加，这些斑点颜色也更深(Meijer等，同前)。此测定可用于证明I类HDZiphox5多肽或其同源物的激活因子功能。,滋辦7:潜J类fi7)Z(pA狄5核凝/^^^^發使用稻幼苗cDNA文库(英骏公司，佩斯利，英国)作为模板，通过PCR扩增稻I类HDZiphox5核酸序列。从幼苗提取的RNA经反转录后，将cDNA克隆进pCMVSport6.0中。该库平均插入物大小为1.6kb，并且原始克隆数的数量级为1.67x107cfu。在6x10lftcfu/ml的第一次扩增之后，确定原始滴度为3.34x106cfu/ml。提取质粒之后，将200ng模板用于50plPCR混合物中。PCR扩增所用引物为prm06000(SEQIDNO:34;有义，起始密码子为粗体，AttBl位点为斜体CG3，)和prm06001(SEQIDNO:35;反向互补，AttB2位点为斜体G3，)，它们包括进行Gateway重组的AttB位点。在标准条件下使用HifiTaqDNA聚合酶进行PCR。同样用标准方法扩增和纯化1116bp的PCR片段(包括attB位点；从开始到终止为1050bp)。接着进行Gateway操作的第一步，即BP反应，在此期间将PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生(根据Gateway术语)"ii/v克隆"。作为Gateway⑧技术一部分的质粒pDONR201购自英骏公司。随后使用含所述核酸序列的进入克隆和用于稻转化的指定载体一起进行LR反应。此载体在T-DNA边界内包含这样的功能元件植物可选择的标记；可筛选的标记表达盒；旨在与已克隆到进入克隆中的目的序列进行LR体内重组的Gateway表达盒。用于组成型表达的稻GOS2启动子(SEQIDNO:33或SEQIDNO:178)位于此Gateway盒的上游。LR重组步骤之后，按照本领域众所周知的方法将所产生的表达载体(图3)转化进入农杆菌菌林LBA4044。其磁辦9:控參脊化裙转^用含表达载体的农杆菌转化稻植物。将梗稻栽培种日本晴的成熟干种子脱壳。通过在70%乙醇中孵育1分钟，接着在0.2。/。HgCl2中30分钟，继之用蒸馏水洗6次，每次15分钟进行消毒。然后4吏无菌的种子在含有2，4-D(愈伤组织诱导培养基)的培养基上萌发。在黑暗中孵育四周之后，切下胚胎发生的盾片衍生的愈伤组织并在相同的培养基中增殖。两周之后，通过在相同培养基中继代培养另外2周增殖或者说繁殖愈伤组织。在共培养之前3天，在新鲜培养基上传代培养胚胎发生愈伤组织块(为了促进细胞分裂活性)。将含有所述表达载体的农杆菌菌抹LBA4404用于共培养。农杆菌接种于含有合适的抗生素的AB培养基中并在28C培养3天。接着收集细菌并悬浮在液体共培养培养基中至约1的光密度(OD600)。接着将悬浮液转移至培^jol，并将愈伤组织浸于悬浮液15分钟。随后将愈伤组织在滤纸上沾干，转移至固体共培养基，并在黑暗中于25'C孵育3天。在选择剂的存在下，共培养的愈伤组织在含有2，4-D的培养基中于28。C暗培养四周。在此期间，发育出快速生长的抗性愈伤组织岛(resistantcallusislands)。将该物质转移至再生培养基之后在光照下孵育，显示出胚胎发生潜力并在接下来的四至五周发育出芽。将芽从愈伤组织切下并在含有生长素的培养基中孵育2到3周，将其从培养基转移至土壤。变硬的芽在高湿度和短白昼条件下在温室中培养。由一个构建体产生约35个独立的TO稻转化体。将初级转化体从组织培养室转移到温室。在定量PCR分析验证T-DNA插入物的拷贝数后，只保留对选择剂表现出耐受性的单拷贝转基因植物用以收获Tl种子。在移植三至五个月后收获种子。该方法提供单基因座转化体的比率超过50%(Aldemita和Hodges1996;Chan等，1993;Hiei等，1994)。4型^估才法10.1评估设置产生了大约35个独立的TO稻转化体。初级转化体由组织培养室转移到温室生长并收获T1种子。7个事件得以保留，其中T1代发生转基因存在/缺乏的3:l分离。通过监测可视标记的表达，在这些事件中各选出大约10个含转基因(杂合子和纯合子)的Tl幼苗，以及大约10个缺少转基因(无效合子)的Tl幼苗。转基因植物和相应的无效合子在随机位置上并排生长。温室条件为短白昼(12小时光照)，日间28。C，夜间22。C,相对湿度70%。按照Tl代相同的评估方法对所有Tl事件的T2代进行进一步的评估。从播种期到成熟期，植物多次通过数码成像箱。在每个时间点上对每林植物从至少6个不同的角度获取数码图像(2048xl536像素，1千6百万色)。盐胁迫筛选在由椰子纤维和argex(3比1的比例)制成的基质上培养来自4个事件(T2种子)的植物。在将幼苗移植至温室后的前两周使用正常的营养液。前两周过后，向营养液中添加25mM的盐(NaCl)，直到收获植物为止。干旱筛选在正常条件下在花盆土中培养来自5个事件(T2种子)的植物，直到进入抽穗期。然后将其转移到"干燥"区域，停止灌溉。向随机选择的花盆中插入湿度探测仪，以监测土壤水含量(swc)。当swc低于一定的阈值时，自动向植物持续补水，直到再次达到正常水平。然后将植物再次重新转移到正常条件下。其余的栽培(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培养的植物相同。用在正常条件下培养的植物收获的T2种子重复筛选进行一轮验证，而不用从首次干旱筛选的植物收获的T2种子。降低的营养(氮)利用度筛选在除营养液以外正常的条件下在花盆土中培养稻植物。从植物移植到成熟一直用特定的营养液对花盆浇水，所述营养液的氮(N)含量降低，通常低7到8倍。其余的栽培(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培养的植物相同。然后测量种子相关参数。10.2统计分析F检验利用双因素ANOVA(方差分析)作为统计模型，对植物表型特征进行全面评估。对用本发明基因转化的所有植林的所有事件的所有测量参数进行F检验。进行F检验以检查基因对所有转化事件的效应，并检验基因的总体效应，亦称为"整体基因效应"。真实整体基因效应的显著性阈值设置为F检验的5。/。概率水平。如果显著性F检验值指向某基因效应，这意味着不仅仅是基因的存在或定位引起表型上的差异。10.3测量的参数10.3.1生物量相关参数的测量从播种期到成熟期，植物多次通过数码成像箱。在每个时间点上对每林植物从至少6个不同的角度获取数码图像(2048xl536像素，1千6百万色)。植物地上面积(或者说叶生物量)通过计数区别于背景的地上植物部分数码图像的像素总数而确定。此值取同一时间点从不同的角度拍摄的照片的平均值，并通过校准转换为以平方亳米表示的物理表面值(physicalsurfacevalue)。实验表明通过这种方法测量的地上植物面积与植物地上部分的生物量相关。地上面积在植物达到其最大叶生物量的时间点取值。早期活力表现为萌发后三周的植物(幼苗)地上面积。必要时还利用另一参数测量非生物胁迫耐受性干旱后的绿度指数，其提供植物衰老的指标。绿度指数为干旱后首次成像时黄色象素的比例(表达为％)。为测量根相关参数，在特别设计的具有透明盆底的花盆中培养植物以便能够对根进行观察。在植物生长期间用数码相机透过盆底拍摄照片。利用适当的软件由照片推断根的特征，如总投影面积(这与根总体积有关)、平均直径以及超过一定粗度阔值的根的长度(一个或多个粗根的长度)。根生物量的增加表达为根总生物量(测量为植物生命周期中观察到的最大根生物量)的增加；或者表达为根/冠比(root/shootindex)(测量为根和芽活跃生长期时根质量与芽质量的比率)的增加。10.3.2种子相关参数的测量收获成熟的初级圆锥花序、计数、装袋、贴上条形码标记，然后在烤箱中于37'C干燥三天。随后将圆锥花序脱粒，收集并计数所有的种子。使用鼓风装置将饱满谷壳和空壳分开。弃去空壳，再次计数剩下的部分。在分析天平上称重饱满的谷壳。通过计数在分离步骤之后剩下的饱满谷壳数确定饱满种子的数目。通过称量所有从植物中收获的饱满谷壳来测量种子总产率。通过计数从植物收获的谷壳的数目测量每林植物的种子总数。从计数的饱满种子数目和它们的总重推断得出千粒重(TKW)。收获指数在本发明中定义为种子总产率和地上面积(mm"之间的比值，再乘以因子106。每个圆锥花序的花总数在本发明中定义为种子总数与成熟初级圆锥花序数之间的比率。种子饱满率在本发明中定义为饱满种子数占种子总数的比例(以％表示)。,磁斧/77;4i常^长奈斧T4这/类iy"Zi》A狄5裙凝^橫差^裙控參时潜果在正常生长条件下表达I类HDZiphox5核酸的转基因稻植物的评估结果示于表F。显示了转基因植物与相应无效合子之间的差异百分比，其中F检验的P值低于0.05。表F:在正常生长条件下表达I类HDZiphox5核酸的转基因稻植物的评估结果<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>-滋辨"在JL^i^i长#斧7T^这^f共滋本Jt'劳方法^#财^^脊差西裙控錄的^"果在盐胁迫生长条件下表达I类HDZiphox5多肽序列编码核酸的转基因稻植物的评估结果示于表G。显示了转基因植物与相应无效合子之间的差异百分比，其中F检验的P值低于0.05。表G:在盐胁迫生长条件下表达I类HDZiphox5核酸的转基因稻植物的评估结果<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>多滋辦/丄'4于"f崖^^长奈伴7"4这/类好"Z!;p/^:5裙磁的#差厉裙控參W潜采在干旱胁迫生长条件下表达用于实施本发明方法的核酸序列的转基因稻植物的评估结果示于表H。显示了转基因植物与相应无效合子之间的差异百分比，其中F检验的P值低于0.05。表H:在千旱胁迫生长条件下表达用于实施本发明方法的核酸序列的转基因稻植物的评估结果<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>其磁辨7v及r,农及^竭裙趁利用数据库序列搜索工具如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410;和Altschul等(1997)NucleicAcidsRes.25:3389-3402)，在美国国家生物技术信息中心(NCBI)Entrez核苷酸数据库维护的序列中鉴定与SEQIDNO:52相关的序列(全长cDNA、EST或基因组)和/或与SEQIDNO:53相关的蛋白质序列。通常BLAST程序通过将核酸或多肽序列与序列数据库进行比较，以及通过计算匹配的统计学显著性，用于寻找序列之间具有局部相似性的区域。例如，对核酸SEQIDNO:52所编码的多肽运用TBLASTN算法，使用缺省设置，开启过滤器，以忽略低复杂度序列。分析的输出视窗为两两比较，并根据概率分值(E值)排序，其中分值反映特定比对偶然发生的概率(E值越低，命中事件的显著性越高)。除了E值之外，还对比较进行同一性百分比记分。同一性百分比是指两比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度上的相同核苷酸(或氨基酸)数。在有些情况下，可以调整缺省参数以更改搜索的严格度。除了可由NCBI获得的公共核酸序列之外，我们还按照上文所述的相同方法对私有序列数据库进行了搜索。下表I提供了与SEQIDNO:52所示的核酸序列以及SEQIDNO:53所示的蛋白质序列相关的核酸和蛋白质序列列表。表I:与用于实施本发明方法的核酸序列(SEQIDNO:52)相关的核酸序列以及相应的推断多肽<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>使用来自VectorNTI(英骏公司，Invitrogen)的AlignX，其基于流行的渐进式比对Clustal算法(Thompson等(1997)NucleicAcidsRes25:4876-4882;Chenna等(2003)NucleicAcidsRes31:3497-3500)。可利用邻近连接聚类算法构建系统发生树。缺省值为空位开放罚分IO，空位延伸罚分O，l，且选择的权重矩阵为Blosum62(如果比对多肽的话)。鉴定用于实施本发明方法的多肽的相关多肽的多重序列比对的结果示于图6。多重比对显示了多种物种之间的NRT蛋白序列高度保守。含PTR2结构域的蛋白质(以SEQIDNO:126为例)显然并不属于本文所定义的NRT蛋白质类型。,應辦/6:A^r,應y^/i/之/《全肩周一'胜F为V6的7^^用于实施本发明方法的全长多肽序列之间的全局相似性和同一性百分比利用MatGAT(矩阵全局比对工具)软件(BMCBioinformatics.20034:29.MatGAT:anapplicationthatgeneratessimilarity/identitymatricesusingproteinorDNAsequences.CampanellaJJ，BitinckaL，SmalleyJ;由LedionBitincka托管的软件)来确定。MatGAT软件无需对数据进行预比对，即可产生DNA或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵。该程序利用Myers和Miller全局比对算法(空位开放罚分为12,而空位延伸罚分为2)进行一系列的两两比对，利用例如Blosum62(对于多肽而言)计算相似性和同一性，然后将结果排列成距离矩阵。序列相似性示于对角线下半部，而序列同一性示于对角线上半部。比较所用的参数有i己分矩阵Blosum62首个空位12延伸空位2多肽序列全长范围(将部分多肽序列排除在外)的全局相似性和同一性的软件分析结果示于表I。对角线上方给出同一性百分比，而对角线下方给出相似性百分比。与SEQIDNO:53比较，用于实施本发明方法的多肽序列之间的同一性百分比显示通常超过60%氨基酸同一性(不过可能存在例外情况)；而含PTR2结构域的蛋白质(如SEQIDNO:126所示的稻硝酸盐转运蛋白，下表第31行)与NRT蛋白仅表现出极其有限的序列同一性(17%或更低)。<table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>实施例17用于实施本发明方法的多肽序列所包含的结构域的鉴定蛋白质家族、结构域和位点整合资源(InterPro)数据库是进行基于文本以及序列的搜索常用的标签数据库的整合界面。InterPro数据库将这些数据库结合起来，它们利用不同的方法学和关于充分表征蛋白质的多样化角度生物信息，以获得蛋白质标签。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITRTrEMBLPRINTSProDom和Pfam、Smart和TIGRFAMs。Interpro由位于英国的欧洲生物信息学研究所托管。SEQIDNO:53所示多肽序列的InterPro扫描结果示于表K。表K:SEQIDNO:53所示多肽序列的InterPro扫描结果<table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table>利用TargetP1.1预测真核蛋白质的亚细胞定位。定位比对基于任一N-末端前序列预测的存在进行叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌通路信号肽(SP)。以之为基础进行预测的分值并非真正的概率，且加起来并不必然为1。不过，得分最高的定位最可能符合TargetP,且分值(可靠性级别)之间的关系可作为所述预测多么可靠的指标。可靠性级别(RC)范围从l到5，其中l表示最强的预测。TargetP由丹麦技术大学生物序列分析中心(CenterforBiologicalSequenceAnalysis,TechnicalUniversityofDenmark)的服务器维护。对于经预测含有N-末端前序列的序列，还可以预测潜在的切割位点。选择了多种参数，例如生物体类型(非植物或植物)、截断值设置(无、预先规定的截断值设置或者用户指定的截断值设置)以及切割位点的预测计算(是或否)。SEQIDNO:53所示多肽序列的TargetP1.1分析结果示于表L。选择的是"植物"生物体类型，未规定截断值，并要求转运肽的预测长度。未能预测到亚细胞定位。表L:SEQIDNO:53所示多肽序列的TargetP1.1分析<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>可以利用许多其他的算法进行这样的分析，包括ChloroPl.l,由丹麦技术大学服务器托管；參蛋白质寻觅亚细月包定位预测软件(ProteinProwlerSubcellularLocalisationPredictor),1.2版，由澳大利亚布里斯班昆士兰大学分子生物科学研究所(InstituteforMolecularBioscience,UniversityofQueensland,Brisbane,Australia)的服务器托管；PENCEProteomeAnalystPA-GOSUB2.5,由加拿大大阿尔贝塔埃德蒙顿阿尔贝塔大学(UniversityofAlberta,Edmonton,Alberta,Canada)的服务器托管；利用TMHMM程序(丹麦技术大学生物序列分析中心)预测的跨膜螺旋数为11，见下文表M。表M:<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>跨膜螺旋中预期的氨基酸数预测至少为242个(如果大于18，则蛋白质极有可能为跨膜蛋白质)。此外，不太可能存在分泌信号，因为在头60个氨基酸内没有预测的跨膜螺旋，也没有N-末端信号序列(预期数，头60个氨基酸0.00085)。为确定NRT的转运蛋白活性，采用Tong等(PlantJ.41，442-450，2005)所述的硝酸盐吸收测定。简言之，由构建体制备mRNA，在所述构建体中，目的NRT蛋白编码ORF之前为爪蟾P-球蛋白基因的5，-UTR，之后为所述爪蟾p-球蛋白基因的3'-UTR。将此mRNA注射到卵母细胞V期和VI期中，之后表达目的NRT蛋白。在151\03-溶液中于18'C孵育卵母细胞3到12小时。然后洗涤卵母细胞并于60X:干燥。用质"i瞽仪通过测量"N/"N之比来测量15N富集硝酸盐的吸收。测量N03吸收的其他适宜的测定法为本领域技术人员所熟知，例如参见Filleur等("N(Vuptakeinroots,FEBSLetters489，220-224，2001)或Zhou等(measurementofanion-elicitedcurrentswiththetwo-electrodevoltage-dampmethod,J.Biol.Chem.275,39894-39899，2000)。如果需要，可以共表达mw2基因，以增加硝酸盐转运。可选地，NRT蛋白或其同源物的活性可以通过在稻栽培种日本晴中表达处于GOS2启动子控制之下的NRT蛋白或其同源物来进行测定，这将产生与相应的野生型植物相比具有增加的地上生物量和/或增加的种子产率的植物。这种种子产率的增加可以通过多种方式衡量，例如种子总重量、饱满种子数量或种子总数的增加，收获指数的增加或每个圆锥花序花朵的增力口。5^g/DJVa'52摩示核酸^/i/的^磬使用稻幼苗cDNA文库(英骏公司，佩斯利，英国)作为模板，通过PCR扩增稻7V及r基因。从幼苗提取的RNA经反转录后，将cDNA克隆进pCMVSport6.0中。该库平均插入物大小为1.5kb,并且原始克隆数的数量级为1.59x107cfu。在6xio11cfu/ml的第一次扩增之后，确定原始滴度为9.6x105cfu/ml。提取质粒之后，将200ng模板用于50piPCR混合物中。PCR扩增所用引物为prm07061(SEQIDNO:54;有义，起始密码子为粗体，AttBl位点为斜体5，曙ggggacaag放g/acaaa^(3gcagg"c加aacaatggactcgtcgacggtg-3，)和prm07062(SEQIDNO:55;反向互补，终止密码子为粗体，AttB24立点为斜体AttB2siteinitalic:5，画gggg^cca""g^"caagaaagcgggfctcggtcgcagaattgtttac画3，)，它4门包括进4于Gateway重组的AttB位点。在标准条件下使用HifiTaqDNA聚合酶进行PCR同样用标准方法扩增和纯化1683bp的PCR片段(包括attB位点)。接着进行Gateway操作的第一步，即BP反应，在此期间将PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生(根据Gateway术语)"进入克隆"。作为Gateway⑧4支术一部分的质粒pDONR201购自英骏公司。神^S五g/D7Va'52摩示时裙财^/种建《这戎琳随后使用进入克隆和用于稻转化的指定载体一起进行LR反应。此载体在T-DNA边界内包含这样的功能元件植物可选择的标记；可篩选的标记表达盒；旨在与已克隆到进入克隆中的目的序列进行LR体内重组的Gateway表达盒。用于组成型表达的稻GOS2启动子(SEQIDNO:56第1-2188位核苷酸，启动子-基因组合)位于此Gateway盒的上游。LR重组步骤之后，将所产生的7V及r表达载体(图7)转化进入农杆菌菌林LBA4044,随后转化进稻植物。裙脊^用含表达载体的农杆菌转化稻植物。将梗稻栽培种日本晴的成熟干种子脱壳。通过在70%乙醇中孵育1分钟，接着在0.2。/。HgCl2中30分钟，继之用蒸馏水洗6次，每次15分钟进行消毒。然后使无菌的种子在含有2，4-D(愈伤组织诱导培养基)的培养基上萌发。在黑暗中孵育四周之后，切下胚胎发生的盾片衍生的愈伤组织并在相同的培养基中增殖。两周之后，通过在相同培养基中继代培养另外2周增殖或者说繁殖愈伤组织。在共培养之前3天，在新鲜培养基上传代培养胚胎发生愈伤组织块(为了促进细胞分裂活性)。将含有所述表达载体的农杆菌菌抹LBA4404用于共培养。农杆菌接种于含有合适的抗生素的AB培养基中并在28t:培养3天。接着收集细菌并悬浮在液体共培养培养基中至约1的光密度(OD600)。接着将悬浮液转移至培^jil，并将愈伤组织浸于悬浮液15分钟。随后将愈伤组织在滤纸上沾干，转移至固体共培养基，并在黑暗中于25。C孵育3天。在选择剂的存在下，共培养的愈伤组织在含有2，4-D的培养基中于28。C暗培养四周。在此期间，发育出快速生长的抗性愈伤组织岛。将该物质转移至再生培养基之后在光照下孵育，显示出胚胎发生潜力并在接下来的四至五周发育出芽。将芽从愈伤组织切下并在含有生长素的培养基中孵育2到3周，将其从培养基转移至土壤。变硬的芽在高湿度和短白昼条件下在温室中培养。由一个构建体产生约35个独立的TO稻转化体。将初级转化体从组织培养室转移到温室。在定量PCR分析验证T-DNA插入物的拷贝数后，只保留对选择剂表现出耐受性的单拷贝转基因植物用以收获Tl种子。在移植三至五个月后收获种子。该方法提供单基因座转化体的比率超过50%(Aldemita和Hodges1996;Chan等，1993;Hiei等，1994)。《滋辨2.'^型^估才法23.1评估设置产生了大约35个独立的T0稻转化体。初级转化体由组织培养室转移到温室生长并收获T1种子。5个事件得以保留，其中T1代发生转基因存在/缺乏的3:l分离。通过监测可视标记的表达，在这些事件中各选出大约10个含转基因(杂合子和纯合子)的Tl幼苗，以及大约10个缺少转基因(无效合子)的Tl幼苗。转基因植物和相应的无效合子在随机位置上并排生长，环境设置如下光周期=11.5小时、日光强度-30,000勒克斯或更多、日间温度-28。C或更高、夜间温度-22。C、相对湿度=60-70%。按照Tl代相同的评估方法对4个Tl事件的T2代进行进一步的评估，但是每个事件使用更多的个体。从播种期到成熟期，植物多次通过数码成像箱。在每个时间点上对每林植物从至少6个不同的角度获取数码图像(2048乂1536#>素，l千6百万色)。23.2统计分析利用双因素ANOVA(方差分析)作为统计模型，对植物表型特征进行全面评估。对用本发明基因转化的所有植株的所有事件的所有测量参数进行F检验。进行F检验以检查基因对所有转化事件的效应，并检验基因的总体效应，亦称为"整体基因效应"。真实整体基因效应的显著性阈值设置为F检验的5。/。概率水平。如果显著性F检验值指向某基因效应，这意味着不仅仅是基因的存在或定位引起表型上的差异。为了检查基因在事件中的效应，即品系特异性效应，在每一事件中使用来自转基因植物和相应无效植物的数据集进行t检验。"无效植物"或"无效分离子"或"无效合子"是与转基因植物以相同的方式处理、但是转基因已经从中分离的植物。也可以将无效植物描述为纯合的阴性转化植物。将t检验的显著性阈值设定为10%概率水平一些事件的结果可以高于此阈值或低于此阈值。这U于这样的假设，即基因可以仅在基因组中的某些位置中具有效应，且这种位置依赖性效应的发生不是罕见的。本文此类基因效应也称为"基因的品系效应(lineeffectofthegene)"。通过将t值与t分布比较得到p值，或者可选地通过将F值与F分布比较得到p值。p值则给出了无效假设(即不存在转基因效应)正确的概率。由于进行的两种实验具有重叠事件，因此进行组合分析。这可用于检查两种实验中效应的一致性，并且如果情况果真如此，其可用于从两种实验中收集证据从而增加结论的可信性。使用的方法是考虑到数据的多级结构(即实验-事件-分离子)的混合模型方法。通过比较卡方分布的似然比测试来获得p值。23.3测量的参数生物量相关参数的测量从播种期到成熟期，植物多次通过数码成像箱。在每个时间点上对每抹植物从至少6个不同的角度获取数码图像(2048xl536像素，1千6百万色)。植物地上面积(或者说叶生物量)通过计数区别于背景的地上植物部分数码图像的像素总数而确定。此值取同一时间点从不同的角度拍摄的照片的平均值，并通过校准转换为以平方毫米表示的物理表面值。实验表明通过这种方法测量的地上植物面积与植物地上部分的生物量相关。地上面积在植物达到其最大叶生物量的时间点取值。早期活力表现为萌发后三周的植物(幼苗)地上面积。种子相关参数的测量收获成熟的初级圆锥花序、计数、装袋、贴上条形码标记，然后在烤箱中于37。C干燥三天。随后将圆锥花序脱粒，收集并计数所有的种子。使用鼓风装置将饱满谷壳和空壳分开。弃去空壳，再次计数剩下的部分。在分析天平上称重饱满的谷壳。通过计数在分离步骤之后剩下的饱满谷壳数确定饱满种子的数目。通过称量所有从植物中收获的饱满谷壳来测量种子总产率。通过计数从植物收获的谷壳的数目测量每林植物的种子总数。从计数的饱满种子数目和它们的总重推断得出千粒重(TKW)。收获指数在本发明中定义为种子总产率和地上面积(mm、之间的比值，再乘以因子106。每个圆锥花序的花总数在本发明中定义为种子总数与成熟初级圆锥花序数之间的比率。种子饱满率在本发明中定义为饱满种子数占种子总数(或小花)的比例(以％表示)。每个圆锥花序的花数是估算植物上每个圆锥花序的平均小花数的参数，由种子总数除以一次圆锥花序(firstpanicles)数获得。当垂直成列观察时，最高的圆锥花序以及与最高的圆锥花序重叠的圆锥花序被视为一次圆锥花序，并进行人工计数。《滋辦"；脊差^控參种或^^估潜虞当如上所述对种子进行分析时，发明人发现用7V及r基因构建体转化的植物比缺乏7V及r转基因的植物具有更高的种子产率表达为饱满种子数(这可能至少部分地是饱满率增加的结果)、种子总重量(增加25%)和收获指数。Tl代植物中得到的结果总结在表N中。表N:<table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table>这些阳性结果在T2代中再次得到。表O的数据显示了由T2代独立品系的数据计算的饱满种子数、种子总重量和收获指数的总体增长百分比以及相应的p值。对这些T2数据在与Tl代结果的组合分析中进行再次评估，并且得到的p值表明观察到的效应是非常显著的。表O:<table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table>另外，转基因植物还表现出生物量的增加(面积最大(areamax):Tl代为+7%,而17代为+4%)，这种增加是显著的(组合分析的p值0.0001)。棼滋^y五i^6多庶及薦竭凝凝^滋辨25:拟^不I^"尸/6薦竭裙凝的差厉^i/^使用稻幼苗cDNA文库(英骏公司，佩斯利，英国)作为模板，通过PCR扩增拟南芥YEP16编码基因。从幼苗提取的RNA经反转录后，将cDNA克隆进pCMVSport6.0中。该库平均插入物大小为1.6kb，并且原始克隆数的数量级为1.67xl(Tcfu。在6x101。cfu/ml的第一次扩增之后，确定原始滴度为3.34x106cfu/ml。提取质粒之后，将200ng模板用于50jilPCR混合物中。PCR扩增所用引物为prm00735(SEQIDNO:144;有义，起始密；马子为津且体，AttBl位点为斜体5'-ggggacaag放gtoC(^a(3a"gcaggc"cacaatggatactctctcagcatcc画3，)和prm00736(SEQIDNO:145;反向互补，AttB2位点为斜体5'-ggggwccac/"gtocaagaaagr/gggrtgtatcatcaagaaacccaga-3，)，它寸门包才舌进4亍Gateway重组的AttB位点。在标准条件下使用ffifiTaqDNA聚合酶进行PCR。同样用标准方法扩增和纯化12173bp的PCR片段(包括attB位点；从开始到终止为1050bp)。接着进行Gateway操作的第一步，即BP反应，在此期间将PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生(根据Gateway术语)"进入克隆"。作为Gateway⑧技术一部分的质粒pDONR201购自英骏公司。随后使用进入克隆和用于稻转化的指定载体p00640—起进行LR反应。此载体在T-DNA边界内包含这样的功能元件植物可选择的标记；可筛选的标记表达盒；旨在与已克隆到进入克隆中的目的序列进行LR体内重组的Gateway表达盒。用于种子特异性表达的稻油质蛋白启动子(SEQIDNO:143)位于此Gateway盒的上游。LR重组步骤之后，将所产生的表达载体(图9)转化进入农杆菌菌林LBA4044，随后转化进稻植物。使转化的稻植物生长，然后对实施例27中所述的参数进行研究。其滋辨27;#i长#佯T#f潜油j蛋^启动f#辦之TW潜K尸76竊竭裙磁付^估和潜果产生了大约15到20个独立的T0稻转化体。初级转化体由组织培养室转移到温室生长并收获T1种子。7个事件得以保留，其中T1代发生转基因存在/缺乏的3:l分离。通过监测可视标记的表达，在这些事件中各选出大约10个含转基因(杂合子和纯合子)的Tl幼苗，以及大约10个缺少转基因(无效合子)的Tl幼苗。按照Tl代相同的评估方法对4个Tl事件的T2代进行进一步的评估，但是每个事件使用更多的个体。27.1统计分析F检验利用双因素ANOVA(方差分析)作为统计模型，对植物表型特征进行全面评估。对用本发明基因转化的所有植抹的所有事件的所有测量参数进行F测验。进行F检验以检查基因对所有转化事件的效应，并检验基因的总体效应，亦称为"整体基因效应"。真实整体基因效应的显著性阈值设置为F检验的5。/。概率水平。如果显著性F检验值指向某基因效应，这意味着不仅仅是基因的存在或定位引起表型上的差异。种子相关参数的测量收获成熟的初级圆锥花序、计数、装袋、贴上条形码标记，然后在烤箱中于37。C干燥三天。随后将圆锥花序脱粒，收集并计数所有的种子。使用鼓风装置将饱满谷壳和空壳分开。弃去空壳，再次计数剩下的部分。在分析天平上称重饱满的谷壳。通过计数在分离步骤之后剩下的饱满谷壳数确定饱满种子的数目。通过称量所有从植物中收获的饱满谷壳来测量种子总产率。通过计数从植物收获的谷壳的数目测量每林植物的种子总数。从计数的饱满种子数目和它们的总重推断得出千粒重(TKW)。收获指数在本发明中定义为种子总产率和地上面积(mm"之间的比值，再乘以因子106。每个圆锥花序的花总数在本发明中定义为种子总数与成熟初级圓锥花序数之间的比率。用YEP16编码核酸转化的转基因植物的饱满种子数、种子总产率(种子总重量)、种子饱满率(其为饱满种子数除以种子总数再乘以IOO)以及收获指数示于表P。与相应的对照植物相比，这些参数在T1代中显著增加。在T2代中也观察到相同参数的平均增加。表P:用YEP16编码核酸转化的转基因植物的Tl代饱满种子数、种子总重量、饱满率以及收获指数结果<table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table>使用拟南芥幼苗cDNA文库(英骏公司，佩斯利，英国)作为模板，通过PCR扩增稻I型shaggy样激酶编码基因。从幼苗提取的RNA经反转录后，将cDNA克隆进pCMVSport6.0中。该库平均插入物大小为1.5kb，并且原始克隆数的数量级为1.59x1(Tcfu。在6x1011cfu/ml的第一次扩增之后，确定原始滴度为9.6x105cfu/ml。提取质粒之后，将200ng模板用于50plPCR混合物中。PCR扩增所用引物为prm5797(SEQIDNO:179;有义，起始密码子为粗体，AttBl位点为斜体5，画gggg""caag^"gtorcaaa(3aagcaggc"aaa!caatgggttcagtaggggttg-3，)和prm5798(SEQIDNO:180;反向互补，终止密码子为粗体，AttB2位点为斜体5，画g怨g"cca虚gtocaagaaagr敏g^gaagctgtctcatactcctgc-3，),它们包括进行Gateway重组的AttB位点。在标准条件下使用HifiTaqDNA聚合酶进行PCR同样用标准方法扩增和纯化1328bp的PCR片段。接着进行Gateway操作的第一步，即BP反应，在此期间将PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生(才艮据Gateway术语)"进入克隆"。作为03!63丫@技术一部分的质粒pDONR201购自英骏公司。,滋辨29:戎体种建随后使用进入克隆和用于稻转化的指定载体一起进行LR反应。此载体在T-DNA边界内包含这样的功能元件植物可选择的标记；可篩选的标记表达盒；旨在与已克隆到进入克隆中的目的序列进行LR体内重组的Gateway表达盒。用于组成型表达的稻GOS2启动子位于此Gateway盒的上游(DePater等，PlantJ.1992Nov;2(6):837-44)。LR重组步骤之后，将所产生的表达载体(图15)转化进入农杆菌菌林LBA4044,随后如实施例30所述转化进稻植物。絲化将梗稻栽培种的成熟千种子脱壳。通过在70%乙醇中孵育1分钟，接着在0.2%HgCl2中30分钟，继之用蒸馏水洗6x15分钟进行消毒。然后使无菌的种子在含有2，4-D(愈伤组织诱导培养基)的培养基上萌发。在黑暗中孵育四周之后，切下胚胎发生的盾片衍生的愈伤组织并在相同的培养基中增殖。两周之后，通过在相同培养基中继代培养另外2周增殖或者说繁殖愈伤组织。在共培养之前3天，在新鲜培养基上传代培养胚胎发生愈伤组织块(为了促进细胞分裂活性)。利用含双元T-DNA载体的农杆菌菌林LBA4404进行共培养。农杆菌接种于含有合适的抗生素的AB培养基中并在28C培养3天。接着收集细菌并悬浮在液体共培养培养基中至约1的光密度(OD600)。接着将悬浮液转移至培养亚，并将愈伤组织浸于悬浮液15分钟。随后将愈伤组织在滤纸上沾干，转移至固体共培养基，并在黑暗中于25'C孵育3天。在选择剂的存在下，共培养的愈伤组织在含有2，4-D的培养基中于28。C暗培养四周。在此期间，发育出快速生长的抗性愈伤组织岛。将该物质转移至再生培养基之后在光照下孵育，显示出胚胎发生潜力并在接下来的四至五周发育出芽。将芽从愈伤组织切下并在含有生长素的培养基中孵育2到3周，将其从培养基转移至土壤。变硬的芽在高湿度和短白昼条件下在温室中培养。在移植三至五个月后收获种子。该方法提供单基因座转化体的比率超过50%(Aldemita和Hodges,Planta，199612-617，1996;Chan等，PlantMol.Biol.22(3)491-506，1993，Hiei等；PlantJ"6(2)271-282，1994)。播种种子，并通过监测可视标记的表达来选择幼苗。播种后10天，将幼苗移植到直径12cm的塑料盆中，盆里装满1:1的湿沙和蛭石混合物。移植前用清水浸透花盆。然后将幼苗由组织培养室移植到温室生长并收获Tl种子。移植后1天将花盆置于盐条件下。每天四次于8am、12pm、4pm和9pm用含25mMNaCl和下文所列组分的盐胁迫营养液对花盆进行浇灌NPK营养混合物20-20-20Petersprofessional(美国俄亥4我州玛丽斯维尔市斯科特(Scotts)公司)，浓度1kg/m3螯合镁ChelalMg(比利时柏南的BMS公司)，333.33ml/m3螯合离子Libfer(英国布拉德福CIBA公司)，21.67g/m3參NaCl1.425kg/m3以周为基础监测盐浓度，并在必要的时候进行盐添加。在这些条件下培养植物，直到谷粒开始充实。然后将其转移到温室中不同的区室，每日用清水浇灌，直到收获种子。如实施例32所详述的那样记录生长和产率参数。,滋斧/":^估和潜果产生了大约15到20个独立的T0稻转化体。初级转化体由组织培养室转移到温室生长并收获T1种子。至少5个事件得以保留，其中T1代发生转基因存在/缺乏的3:1分离。通过监测可视标记的表达，在这些事件中各选出大约10个含转基因(杂合子和纯合子)的Tl幼苗，以及大约10个缺少转基因(无效合子)的Tl幼苗。按照Tl代相同的评估方法对4个表现最佳的Tl事件的T2代进行进一步的评估，但是每个事件使用更多的个体。统计分一斤F检验利用双因素ANOVA(方差分析)作为统计模型，对植物表型特征进行全面评估。对用本发明基因转化的所有植林的所有事件的所有测量参数进行F测验。进行F检验以检查基因对所有转化事件的效应，并检验基因的总体效应，亦称为"整体基因效应"。真实整体基因效应的显著性阈值设置为F检验的5。/。概率水平。如果显著性F检验值指向某基因效应，这意味着不仅仅是基因的存在或定位引起表型上的差异。32.1种子相关参数的测量收获成熟的初级圆锥花序、装袋、贴上条形码标记，然后在烤箱中于37。C干燥三天。随后将圆锥花序脱粒，收集并计数所有的种子。使用鼓风装置将饱满谷壳和空壳分开。弃去空壳，再次计数剩下的部分。在分析天平上称重饱满的谷壳。通过称量所有从植物中收获的饱满谷壳来测量种子总产率。收获指数在本发明中定义为种子总产率和地上面积(mm"之间的比值，再乘以因子106。下文的结果表显示了Tl和T2评估的F检验的p值。还显示了转基因与相应无效合子(或不含转基因的植物)之间差异百分比。例如，对于T1代中的种子总重量，2个事件为种子总重量阳性(即在盐胁迫条件下，与相应无效合子植物的种子重量相比，显示为种子总重量增加(>54%，其中F检验的p值<0.1938))。在T2代中，1个事件为种子总重量阳性(即在盐胁迫条件下，与相应无效合子植物的种子重量相比，显示为种子总重量增加(65%,其中F检验的p值为0.0252))。表Q:盐胁迫条件下的Tl和T2代shaggy样激酶转基因植物和相应非转基因植物<table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table>用于本发明方法的序列对玉米、小麦、大豆、芸苔、苜蓿的转化工^絲用Ishida等(1996)NatureBiotech14(6):745-50所述方法的改良方案进行玉米(玉蜀黍)的转化。在玉米中转化是基因型依赖性的，并且只有特定的基因型才能转化和再生。近交系A188(明尼苏达大学(UniversityofMinnesota))或以A188为亲本的杂种是转化供体材料的优秀来源，但是也可以成功使用其它基因型。授粉后(DAP)约11天，当未成熟胚的长度是约1至1.2mm时，从玉米植物中收获穗。对未成熟胚与含表达载体的根癌农杆菌04g^^flcteWw附,"附e/"de"力进行共培养，并通过器官发生回收转基因植物。切下的胚先后在愈伤组织诱导培养基和含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可使用多种选择标记)的玉米再生培养基上培养。培养板于25。C在光照下孵育2-3周，或直到发育出芽。从每个胚中将绿芽转移到玉米生根培养基上并在25。C孵育2-3周，直到发育出根。将生根的芽移植到温室的土壤中。由对选择剂表现出耐受性的和含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。通过Ishida等(1996)NatureBiotech14(6):745-50所述的方法进行小麦的转化。转化常用栽培种Bobwhite(可从墨西哥CIMMYT公司获得)。对未成熟胚和含表达载体的根癌农杆菌进行共培养，并通过器官发生回收转基因植林。胚与农杆菌孵育后，先后在体外在愈伤组织诱导培养基和含有选择试剂(例如咪唑啉酮，但可使用多种选择标记)的再生培养基上培养。培养板于25。C在光照下孵育2-3周，或直到发育出芽。从每个胚中将绿芽转移到生根培养基上并在25"孵育2-3周，直到发育出根。将生根的芽移植到温室的土壤中。由对选择剂表现出耐受性的和含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。根据在德克萨斯农工大学(TexasA&M)的专利US5,164,310中所述方法的改良方案转化大豆。一些商业的大豆品种可以通过该方法转化。栽培种Jack(得自伊利诺斯种子公司(theIllinoisSeedfoundation))通常用于转化。对大豆种子进行消毒以用于体外播种。从七天龄幼苗切离下胚轴，胚根和一个子叶。进一步培养上胚轴和剩下的子叶以发育腋结。切下这些腋结并与含有表达载体的根癌农杆菌孵育。在共培养处理后，洗'涤外植体并转移到选择培养基中。切下再生的芽并置于芽伸长培养基中。将长度不超过lcm的芽置于生根培养基中直到发育出根。将生根的芽移植到温室的土壤中。由对选择剂表现出耐受性的和含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生Tl种子。磁胁吝r做利用5-6天龄幼苗的子叶柄和下胚轴作为外植体进行组织培养，并根据Babic等(1998，PlantCellRep17:183-188)进行转化。商业的栽培种(加拿大农业(AgricultureCanada))是用作转化的标准品种，但是也可以使用其它品种。对芸苔种子进行表面消毒用于体外播种。从体外幼苗中切离附着了子叶的子叶柄外植体，并通过将叶柄外植体的切割端浸入细菌悬液中来接种农杆菌(含有表达载体)。然后将外植体在含有3mg/lBAP、3%蔗糖、0.7。/。植物凝胶(Phytagar)的MSBAP-3培养基中于23。C、16小时光照培养2天。与农杆菌共培养2天后，将叶柄外植体转移到含有3mg/1BAP、头孢瘗將、羧节青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基中培养7天，然后在具有头孢噻肟、羧节青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养直到芽再生。当芽长5-10mm时，将其切下并转移到芽伸长培养基(MSBAP-0.5,含有0.5mg/1BAP)中。将约2cm长的芽转移到生根培养基(MSO)进行根诱导。将生根的芽移植到温室的土壤中。由对选择剂表现出耐受性的和含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生Tl种子。利用(McKersie等1999PlantPhysiol119:839-847)的方法转化苜蓿(紫花苜蓿)的再生克隆。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的，因此需要再生植株。获得再生植林的方法已有描述。例如，这些可以选自栽培种Rangelander(加拿大农业)或4壬4可其它的3口BrownDCW和AAtanassov(1985.PlantCellTissueOrganCulture4:111-112)所述的商业苜蓿品种。可选地，选择RA3品种(威斯康辛大学(UniversityofWisconsin))进行组织培养(Walker等，1978AmJBot65:654-659)。将叶柄外植体与含有表达载体的根癌农杆菌C58C1pMP90的过夜培养物(McKersie等，1999PlantPhysiol119:839—847)或LBA4404进行共培养。将外植体在含有288mg/LPro、53mg/L碗^代脯氨酸、4.35g/LK2S04和100jim乙酰丁香酮的SH诱导培养基上在黑暗中共培养3天。将外才直体在半强度Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog,1962)中洗涤，并置于相同的SH诱导培养基中，该培养基不含有乙酰丁香酮但含有合适的选择剂和合适的抗生素以抑制农杆菌生长。数周后，将体细胞胚转移到不含生长调节剂、不含抗生素、含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。随后使体细胞胚在半强度Murashige-Skoog培养基上萌发。将生根的幼苗移植到盆中并在温室中生长。由对选择剂表现出耐受性的和含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生Tl种子。权利要求1.相对于相应的野生型植物增加植物产率的方法，包括调节植物中I类同源域亮氨酸拉链(HDZip)hox5多肽或其同源物编码核酸的表达，和任选地选择具有增加的产率的植物，其中所述I类HDZiphox5多肽或其同源物从N-末端到C-末端包含(i)酸性盒；和(ii)I类同源域；和(iii)具有5个以上七肽的亮氨酸拉链。2.根据权利要求1的方法，其中所述I类HDZiphox5多肽或其同源物还包含如下之一或两者兼而有之(a)Trp尾巴；和(b)RPFF氨基酸基序，其中R为Arg，P为Pro，而F为Phe，且在此基序中允许进4亍任意位置上的一个或多个保守改变，和/或任意位置上的一个或两个非保守改变。3.根据权利要求1或2的方法，其中通过引入遗传修饰来实现所述调节的表达，优选在编码I类HDZiphox5多肽或其同源物的基因座引入遗传修饰。4.根据权利要求3的方法，其中通过T-DNA激活、TILLING、定点诱变或定向进化之一实现所述遗传修饰。5.相对于相应的野生型植物增加植物产率的方法，包括在植物中引入和表达I类HDZiphox5核酸或其变体。6.根据权利要求5的方法，其中所述变体为I类HDZiphox5核酸的部分，所述部分编码的多f土从N-末端到C-末端包含(i)酸性盒；和(ii)I类同源域；和(iii)具有5个以上七肽的亮氨酸拉链。7.根据权利要求5的方法，其中所述变体为能够与I类HDZiphox5核酸杂交的序列，所述杂交序列编码的多肽从N-末端到C-末端包含(i)酸性盒；和(ii)I类同源域；和(iii)具有5个以上七肽的亮氨酸拉链。8.根据权利要求5至7的方法，其中所述I类HDZiphox5核酸或其变体在植物中过表达。9.根据权利要求5至8中任一项的方法，其中所述I类HDZiphox5核酸或其变体是植物来源的，优选来自单子叶植物，还优选来自禾本科，更优选核酸来自稻属，最优选来自稻。10.根据权利要求5至9中任一项的方法，其中所述变体编码I类HDZiphox5蛋白SEQIDNO:2的直系同源物或旁系同源物。11.根据权利要求5至10中任一项的方法，其中所述I类HDZiphox5核酸或其变体有效连接于组成型启动子。12.根据权利要求ll的方法，其中组成型启动子为GOS2启动子，更优选组成型启动子为稻GOS2启动子，还优选组成型启动子如基本上类似于SEQIDNO:33或SEQIDNO:178的核酸序列所示，最优选组成型启动子如SEQIDNO:33或SEQIDNO:178所示。13.根据权利要求1至12中任一项的方法，其中所述增加的产率选自如下一个或多个方面增加的饱满种子数、增加的种子总产率、增加的每个圆锥花序的花数、增加的种子饱满率、增加的收获指数(HI)、增加的千粒重(TKW)、增加的根长度或增加的根直径，其中每一方面都相对于相应的野生型植物而言。14.根据权利要求1至13中任一项的方法，其中所述增加的产率在非生物胁迫条件下发生。15.根据权利要求14的方法，其中所述非生物胁迫为渗透胁迫，选自如下一种或多种水胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和离子胁迫，优选其中所述水胁迫是干旱胁迫。16.根据权利要求14或15的方法，其中对所述非生物胁迫的耐受性表现为选自如下一个或多个方面的增加的产率增加的饱满种子数、增加的种子总产率、增加的每个圆锥花序的花数、增加的种子饱满率、增加的HI、增加的TKW、增加的才艮长度或增加的才艮直径，其中每一方面都相对于相应的野生型植物而言。17.根据权利要求13至16的方法，其中所述增加的产率包括增加的绿度指数。18.可根据权利要求1至17中任一项的方法获得的植物、植物部分或才直物细月包。19.如下构建体在根据权利要求5至17中任一项的方法中的用途，所述构建体包含(i)I类HDZiphox5核酸或其变体；(ii)能够驱动(i)中核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选的(iii)转录终止序列。20.根据权利要求19的构建体，其中所述控制序列为组成型启动子。21.根据权利要求20的构建体，其中所述组成型启动子为GOS2启动子，优选为稻GOS2启动子，还优选组成型启动子如基本上类似于SEQIDNO:33或SEQIDNO:178的核酸序列所示，最优选组成型启动子如SEQIDNO:33或SEQIDNO:178所示。22.用构建体转化的植物、植物部分或植物细胞，所述构建体包含处于GOS2启动子控制之下的I类HDZiphox5核酸或其变体。23.产生相对于相应的野生型植物具有增加的产率的转基因植物的方法，所述方法包括(i)在植物或才直物细胞中引入和表达I类HDZiphox5核酸或其变体；(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。24.根据权利要求23的方法，其中所述增加的产率在增加的非生物胁迫条件下发生。25.相对于相应的野生型植物具有增加的产率的转基因植物，所述增加的产率通过向所述植物中引入I类HDZiphox5核酸或其变体而产生。26.根据权利要求18、22或25的转基因植物，其中所述植物是单子叶植物如甘蔗，或者其中所述植物是谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、燕麦或高粱。27.根据权利要求18、22、25或26中任一项的植物的可收获部分。28.根据权利要求27的植物可收获部分，其中所述可收获部分是种子。29.从根据权利要求26的植物、和/或从根据权利要求27或28的植物可收获部分直接衍生的产品。30.1类HDZiphox5核^/基因或其变体、或I类HDZiphox5多肽或其同源物在相对于相应的野生型植物增加植物产率中的用途。31.根据权利要求30的用途，其中所述增加的产率选自如下一个或多个方面增加的饱满种子数、增加的种子总产率、增加的每个圆锥花序的花数、增加的种子饱满率、增加的HI、增加的TKW、增加的根长度或增加的根直径，其中每一方面都相对于相应的野生型植物而言。32.根据权利要求30或31的用途，其中所述增加的产率在增加的非生物胁迫条件下发生。33.根据权利要求32的用途，其中所述增加的产率包括增加的绿度指数。34.1类HDZiphox5核^/基因或其变体、或I类HDZiphox5多肽或其同源物作为分子标记的用途。35.相对于相应的野生型植物改良植物生长特性的方法，包括调节植物中NRT多肽或其同源物编码核酸的表达，和任选地选择具有改良的生长特性的植物。36.根据权利要求35的方法，其中通过引入遗传修饰来实现所述调节的表达，优选在编码NRT多肽或其同源物的基因座引入遗传修饰。37.根据权利要求26的方法，其中通过T-DNA激活、TILLING、定点诱变、同源重组或定向进化之一实现所述遗传修饰。38.相对于相应的野生型植物改良植物生长特性的方法，包括在植物中引入和表达A7r核酸或其变体。39.根据权利要求38的方法，其中所述核酸编码NRT蛋白SEQIDNO:53的同源物，优选所述核酸编码NRT蛋白SEQIDNO:53的直系同源物或旁系同源物。40.根据权利要求38的方法，其中所述变体为TV及r核酸的部分或能够与7V及r核酸杂交的序列，所述部分或杂交序列编码的多肽包含(i)MFSJL结构域，(ii)位于所述MFS—1结构域C-末端的跨膜结构域，且优选也具有NRT活性。41.根据权利要求38至40中任一项的方法，其中所述7V及r核酸或其变体在植物中过表达。42.根据权利要求38至41中任一项的方法，其中所迷iV及r核酸或其变体是植物来源的，优选来自单子叶植物，更优选来自禾本科，最优选核酸来自稻。43.根据权利要求38至42中任一项的方法，其中所述7V及r核酸或其变体有效连接于组成型启动子。44.根据权利要求43的方法，其中所述组成型启动子为GOS2启动子。45.根据权利要求35至44中任一项的方法，其中所述改良的生长特性是增加的产率。46.根据权利要求45的方法，其中所述增加的产率是增加的种子产率。47.根据权利要求46的方法，其中所述增加的种子产率选自增加的种子总重量、增加的种子总数、增加的饱满种子数、增加的每个圆锥花序的花数或增加的收获指数。48.可根据权利要求35至47中任一项的方法获得的植物或植物细胞。49.构建体，其包含(i)7V及r核酸或其变体；(ii)能够驱动(i)中核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选的(m)转录终止序列。50.根据权利要求49的构建体，其中所述控制序列为组成型启动子。51.根据权利要求50的构建体，其中所述组成型启动子为GOS2启动子。52.根据权利要求51的构建体，其中所述GOS2启动子如SEQIDNO:56第1至2193位核苷酸所示。53.用根据权利要求49至52中任一项的构建体转化的植物或植物细胞。54.产生与相应的野生型植物相比具有增加的产率的转基因植物的方法，所述方法包括(i)在植物或植物细胞中引入和表达7V及r核酸或其变体；(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。55.具有改良的生长特性的转基因植物或植物细胞，其通过向所述植物中引入7v及r核酸或其变体产生。56.根据权利要求48、53或55的转基因植物或植物细胞，其中所述植物是单子叶植物如甘蔗，或者其中所述植物是谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、栗、黑麦、燕麦或高粱；或者其中所述转基因植物细胞来源于单子叶植物如甘蔗，或者其中所述植物是谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、燕麦或高粱。57.根据权利要求48、53、55或56中任一项的植物的可收获部分。58.根据权利要求57的植物可收获部分,其中所述可收获部分是种子。59.从根据权利要求56的植物、和/或从根据权利要求57或58的植物可收获部分直接衍生的产品。60.iV及r核酸/基因或其变体、或NRT多肽或其同源物在相对于相应的野生型植物改良植物生长特性、优选增加产率、尤其是种子产率中的用途。61.根据权利要求60的用途，其中所述种子产率为如下一个或多个方面增加的种子总重量、增加的种子总数、增加的饱满种子数、增加的每个圆锥花序的花数或增加的收获指数。62.iV及r核^/基因或其变体、或NRT多肽或其同源物作为分子标记的用途。63.相对于相应的野生型植物增加植物产率的方法，包括调节植物中YEP16多肽或其同源物编码核酸的表达，其中所述YEP16多肽或其同源物按照递增的优选顺序与SEQIDNO:128的氨基酸序列具有至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、卯％、95%的序列同一性。64.根据权利要求63的方法，其中所述调节的表达为增加的表达。65.根据权利要求63或64的方法，其中通过引入遗传^f务饰来实现所述调节的表达，优选在编码YEP16多肽或其同源物的基因座引入遗传修饰。66.根据权利要求65的方法，其中通过T-DNA激活、TILLING、定点诱变或定向进化之一实现所述遗传修饰。67.相对于相应的野生型植物增加植物产率的方法，包括在植物中引入和表达编码YEP16多肽或其同源物的核酸，其中所述YEP16多肽或其同源物按照递增的优选顺序与SEQIDNO:128的氨基酸序列具有至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、卯％、95%的序列同一性。68.根据权利要求63至67中任一项的方法，其中所述YEP16多肽或其同源物靶向质体。69.根据权利要求68的方法，其中所述质体是叶绿体。70.根据权利要求67至69中任一项的方法，其中所述编码YEP16多肽或其同源物的核酸能够在能够在降低的严格条件下与SEQIDNO:127或SEQIDNO:129所示的核酸杂交。71.根据权利要求67至70中任一项的方法，其中所述编码YEP16多肽或其同源物的核酸按照递增的优选顺序具有SEQIDNO:127或SEQIDNO:129所示核酸的至少100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575个连续核苷酸。72.根据权利要求67至71中任一项的方法，其中所述编码YEP16多肽或其同源物的核酸编码YEP16多肽SEQIDNO:128或SEQIDNO:130的直系同源物或旁系同源物。73.根据权利要求67至72的方法，其中所述编码YEP16多肽或其同源物的核酸在植物中过表达。74.根据权利要求67至73中任一项的方法，其中所述编码YEP16多肽或其同源物的核酸是植物来源的，优选来自双子叶植物物种，还优选来自十字花科，更优选来自拟南芥。75.根据权利要求67至74中任一项的方法，其中所述编码YEP16多肽或其同源物的核酸有效连接于种子特异性启动子。76.根据权利要求75的方法，其中所述种子特异性启动子为油质蛋白启动子，优选来自稻的油质蛋白启动子，还优选如SEQIDNO:143所示。77.根据权利要求63至76中任一项的方法，其中所述增加的产率是相对于相应的野生型植物增加的种子产率。78.根据权利要求77的方法，其中所述增加的种子产率选自如下任何一个或多个方面增加的种子重量、增加的饱满种子数、增加的种子饱满率和增加的收获指数。79.可根据权利要求63至78中任一项的方法获得的植物或植物细胞。80.构建体，其包含(i)编码YEP16多肽或其同源物的核酸，其中所述YEP16多肽或其同源物按照递增的优选顺序与SEQIDNO:128的氨基酸序列具有至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%的序列同一性;(ii)能够驱动(i)中核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选的(iii)转录终止序列。81.根据权利要求80的构建体，其中所述控制序列为种子特异性启动子。82.根据权利要求81的构建体，其中所述所述种子特异性启动子为油质蛋白启动子，优选来自稻的油质蛋白启动子。83.用根据权利要求80至82中任一项的构建体转化的植物、植物部分或植物细月包。84.产生相对于相应的野生型植物具有增加的产率的转基因植物的方法，所述方法包括(i)在植物或才直物细胞中引入和表达编码YEP16多肽或其同源物的核酸，其中所述YEP16多肽或其同源物按照递增的优选顺序与SEQIDNO:128的氨基酸序列具有至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%的序列同一性；(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。85.由于编码YEP16多肽或其同源物的核酸而相对于相应的野生型植物具有增加的产率的转基因植物，其中所述YEP16多肽或其同源物按照递增的优选顺序与SEQIDNO:128的氨基酸序列具有至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%的序列同一性。86.根据权利要求79、83或85的转基因植物，其中所述植物是单子叶植物如甘蔗，或者其中所述植物是谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、燕麦或高粱。87.根据权利要求79、83、85或86中任一项的植物的可收获部分。88.根据权利要求87的植物可收获部分，其中所述可收获部分是种子。89.从才艮据权利要求86的植物、和/或从根据权利要求87或88的植物可收获部分直接衍生的产品。90.编码YEP16多肽或其同源物的核酸在相对于相应的野生型植物增加植物产率中的用途，其中所述YEP16多肽或其同源物按照递增的优选顺序与SEQIDNO:128的氨基酸序列具有至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%的序列同一性。91.根据权利要求90的用途，其中所述增加的产率选自如下一个或多个或所有方面增加的种子总重量、增加的饱满种子数、增加的饱满率和增加的收获指数。92.编码YEP16多肽或其同源物的核酸作为分子标记的用途，其中所述YEP16多肽或其同源物按照递增的优选顺序与SEQIDNO:128的氨基醋列具有至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、卯％、95%的序列同一性。93.增加植物非生物胁迫耐受性的方法，包括增加植物中I型shaggy样激酶或其同源物的活性，所述I型shaggy样激酶具有(i)与SEQIDNO:147所示的M紗列至少77%的序列同一性；以及(ii)基序I:R/H/V/N/QE/GLKG/N和基序II:KQ/NCXXXG/A/S，其中X可以是任意氨基酸。94.根据权利要求93的方法，其中通过引入遗传修饰来实现所述增加的活性，优选在编码I型shaggy样激酶的基因座引入遗传修饰，所述基因座为包括目的基因以及编码区上游或下游10KB的基因组区。95.根据权利要求94的方法，其中通过如下任一方法实现所述遗传修饰定点^秀变、同源重组、TILLING、T-DNA激活以及通过在植物中引入和表达编码I型shaggy样激酶或其同源物的核酸。96.增加植物非生物胁迫耐受性的方法，包括在植物中引入和表达I型shaggy样激酶编码核酸/基因或其变体。97.根据权利要求96的方法，其中所述变体为I型shaggy样激酶编码核i^/基因的部分，和/或为能够与I型shaggy样激酶编码核i^/基因杂交的核酸，所述部分或杂交序列的长度至少为1,200个核苷酸，且所述部分或杂交序列编码的多肽具有(i)与SEQIDNO:147所示的氨基酸序列至少77%的序列同一性；以及(ii)基序I:R/H/V/N/QE/GLKG/N和基序II:KQ/NCXXXG/A/S，其中X可以是任意氨基酸。。98.根据权利要求96或97的方法，其中所述I型shaggy样激酶编码核^/基因或其变体在植物中过表达。99.才艮据权利要求96至98中任一项的方法，其中所述I型shaggy样激酶编码核^/基因或其变体是植物来源的，优选来自单子叶植物，还优选来自禾本科，更优选核酸来自稻属，最优选来自稻。100.根据权利要求96至99中任一项的方法，其中所述I型shaggy样激酶编码核^/基因或其变体有效连接于组成型启动子，优选GOS2启动子，如来自稻的GOS2启动子。101.根据权利要求93至100中任一项的方法，其中所述非生物胁迫为如下任意一种或多种水胁迫、无氧胁迫、盐胁迫、温度胁迫、化学毒性胁迫和氧4^胁迫。102.根据权利要求93至101中任一项的方法，其中所述非生物胁迫为渗透胁迫，选自盐胁迫、水胁迫、氧化胁迫、离子胁迫。103.可根据权利要求93至102中任一项的方法获得的植物或植物细胞，其中所述植物或植物细胞具有增加的I型shaggy样激酶活性，和/或增加的I型shaggy样激酶编码核酸的表达。104.构建体，其包含(i)I型shaggy样激酶编码核酸或其变体；(ii)能够驱动(i)中核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选的(iii)转录终止序列。105.根据权利要求104的构建体，其中所述控制序列包括组成型启动子，优选GOS2启动子，如来自稻的GOS2启动子。106.用根据^5L利要求104或105的构建体转化的植物或植物细胞。107.产生具有增加的非生物胁迫耐受性的转基因植物的方法，所述方法包括(i)在植物或植物细胞中引入和表达I型shaggy样激酶编码核酸或其变体；和(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。108.根据权利要求107的方法，其中所述非生物胁迫为渗透胁迫，选自盐胁迫、水胁迫、氧化胁迫、离子胁迫。109.相对于相应的野生型植物具有增加的非生物胁迫耐受性的转基因植物，所述转基因植物具有增加的I型shaggy样激酶活性，和/或增加的I型shaggy样、激酶编码核酸的表达。110.根据权利要求103、106和109中任一项的转基因植物，其中所述植物为作物植物如大豆、向日葵、芸苜、苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、马铃薯或烟草，还优选为单子叶植物如甘蔗，更优选为谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、高粱或燕麦。111.根据权利要求103、106、109至110中任一项的转基因植物的可收获部分，包括种子。112.1型shaggy样激酶编码核酸或其变体、或I型shaggy样激酶或其同源物在增加植物非生物胁迫耐受性中的用途。113.根据权利要求112的用途，其中所述非生物胁迫为渗透胁迫，选自盐胁迫、水胁迫、氧化胁迫、离子胁迫。114.1型shaggy样激酶编码核酸或其变体、或I型shaggy样激酶或其同源物作为分子标记的用途。全文摘要本发明一般地涉及分子生物学领域，并涉及相对于相应的野生型植物改良植物生长特性的方法。更具体地，本发明涉及改良植物生长特性的方法，包括调节植物中I类同源域亮氨酸拉链(HDZip)hox5多肽或其同源物编码核酸的表达；或包括调节植物中硝酸盐转运蛋白(NRT)或其同源物编码核酸的表达；或包括调节植物中命名为增产蛋白质16(称为YEP16)的多肽或其同源物编码核酸的表达；或包括调节植物中I型糖原合酶激酶(I型shaggy样激酶)或其同源物编码核酸的表达。本发明还涉及具有调节的I类同源域亮氨酸拉链(HDZip)hox5多肽或其同源物编码核酸表达的植物；或具有调节的硝酸盐转运蛋白(NRT)或其同源物编码核酸表达的植物；或具有调节的命名为增产蛋白质16(下文称为YEP16)的多肽编码核酸表达的植物；或具有调节的I型糖原合酶激酶(I型shaggy样激酶)或其同源物表达的植物；所述植物相对于相应的野生型植物具有改良的植物生长特性。本发明还提供在发明方法中有用的构建体。文档编号A01H5/10GK101351556SQ200680049144公开日2009年1月21日申请日期2006年11月7日优先权日2005年11月7日发明者A·I·桑兹莫林纳罗,C·勒佐,D·因泽,L·德维尔德,V·布多夫,V·米隆诺弗,Y·海茨费尔德申请人:克罗普迪塞恩股份有限公司