植物血红蛋白的制作方法

专利名称：植物血红蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及改变植物生长特性的方法，尤其是改变植物胁迫耐受性和产量的方 法。更特别地，本发明涉及通过改变植物血红蛋白基因表达和/或通过改变植物血红蛋白 的含量来改变植物对各种环境性胁迫的耐受性和提高种子产量。
背景技术：
由于数年来集中在选择适应特定环境的较高产量植物的育种活动，农业上可供利 用的作物的大多数品种目前已经获得。因此，虽然它们维持了高产量，但通常缺乏足够的遗 传变异性来适应其它环境。此外，在它们的生命周期中，植物暴露于各种环境条件下，这样 的环境条件会极大地影响发育，并且在不利时，还可能限制最终的产量。气候和其它环境条 件导致了不同季节中所获得的产物的总产量和质量会发生变化。因此，农业中主要的目的 是培育在数量和质量方面具有提高稳定性的品种。数量方面的生产稳定性对于计划是有利 的，且可以避免生产中的反常。在质量方面，稳定性有助于提高采收后的处理和农业产品的 工业加工。通常将产量定义为来自农作物的可测量产品经济价值。这可以就数量和/或质量 方面来定义。产量直接取决于各种因素，例如，器官的数量和大小、植物结构(例如，枝条的 数量)、种子产量等。根的发育、营养吸收和胁迫耐受性也是影响产量的重要因素。影响一个或多个上述因素并因此提高作物产量的能力，在如作物强化、植物播种、 观赏植物的生产、造林、园艺、林业、藻类或植物生产等领域中将具有许多应用(例如用作 生物反应器、用于生产物质如药物、抗体或疫苗，或用于有机废物的生物转化或在高产量藻 类和植物的情况中用作燃料)。数个参数确定着植物终产量，其中生长是主要因素。通常生长的提高和较高的产 量相关。尤其相关的是在不利条件下植物维持生长和继续其发育进程的能力。不利条件是 那些限制植物获得其可能的最大产量的条件。由于植物无法响应环境刺激而移动，植物会 暴露于各种限制其性能的胁迫。非生物胁迫条件，如太阳能、水和营养物的短缺或超量，极 端热和冷的温度、污染(如重金属污染)全部对植物生长具有主要的影响，并可以显著降低 植物产量和生长。植物对非生物胁迫如干旱、温度和渗透胁迫的反应是相互紧密联系的(Zhu等， Crit. Rev. Plant Sci. 16，253-277，1997)。通过一种类型的胁迫调控的许多基因也会对另 外两种胁迫产生响应。因此，赋予例如对渗透胁迫的耐受性的基因也会赋予对冷和干旱胁 迫的耐受性。此外，植物在其生命周期中可能暴露于多种胁迫下，例如干旱胁迫就经常伴 随高温胁迫。植物从其环境中受到的最常见种类的胁迫是温度胁迫。每个植物物种具有 其自己最佳的生长温度，很大程度上其地理分布是由其可以存活于其中的温度带决定。最 近，已有呼吁关注预测在不久的将来将发生的根本的全球温度改变对农业可能产生的严重
5影响。现正在努力寻找提高植物对非最佳温度条件的适应性的实践方法。已经应用分子 育种方法来解决这些问题。例如，通过超表达转录因子如SC0F-1或CBFl (Kim等，Plant J. 25，247-259，2001 Jaglo-Ottosen 等，Science 280，104-106，1998)；提高相容溶质的含 量(Alia等，Plant Cell Environm. 21, 232-239,1998)；改变膜脂质；和通过降低活性氧类 属的影响，已经在植物中获得了基因工程化耐冷性。通过工程化表达热休克蛋白、提高相容 溶质的产量和通过改变膜脂质，已经获得抵抗高温的能力。然而，迄今为止没有科学报道描 述植物2类非共生性血红蛋白基因响应于环境胁迫或植物血红蛋白基因通常响应温度胁 迫的情况。干旱、盐胁迫和高温或低温胁迫是农业中的主要问题，因为这些不利环境因素妨 碍了植物最大程度地利用它们的遗传潜能。这些胁迫实质上影响了植物生理和代谢的每个 方面。胁迫通常涉及适应性响应，如根或其它器官的形态改变，以及发育改变，如生长的抑 制。通常，植物的响应可以分为三类动态平衡的维持，其包括离子动态平衡和渗透动态平 衡或渗透调节；有害化合物的解毒，例如在胁迫过程中产生的活性氧类或受损害蛋白质的 解毒；和生长的恢复，即从生长抑制中和从胁迫过程中强加于细胞分裂和扩展的影响中缓 解过来。通过基因工程在实现胁迫耐受性中已经获得进展，这是通过操纵动态平衡，例如 通过提高渗压剂的浓度(Nuccio等，Curr. PlantBiol. 2，128-34，1999)，通过超表达Na+/H+ 逆向转运剂(antiporter)，(Apse 和 Blumwald，Curr. Opin. Biotechnol. 13，146-50,2002) 或通过超表达可能有助于维持膜或蛋白质稳定性的LEA蛋白质(Xu等，Plant Physio. 110， 49-257，1996)而实现的。对渗透信号途径中的组分进行加工也是获得渗透胁迫耐受性的一 种有前景的途径。然而，文献中没有报道过确定血红蛋白基因在提高渗透胁迫耐受性中的 关键作用。血红蛋白普遍发现存在于多种生物体内(Vinogradov等，Comp. Biochem. Physio. 106，1-26,1993 ；Bolognesi 等，Prog. Biophys. Mol. Biol, 68, 29-68，1997)。可能除 了大麦以外，所有检测的植物物种具有至少两个血红蛋白基因。已经报道这些基因含有3 个保守内含子，这是与动物血红蛋白相同的特征(Arredondo Peter等，Plant Physio. 118， 1121-1125,1998)。基于它们的结构，以前将植物血红蛋白分成两组。第一组是共生血红蛋 白(豆血红蛋白)，包括大量存在于豆科植物固氮性根瘤的感染细胞中的血红蛋白，但是也 可以在非豆科植物中发现。第二组包括非共生血红蛋白，其是共生型血红蛋白的祖先，并其 在植物界中分布更为广泛。在更近的分类中(Hunt等，Plant Mol. Biol. 47，677-692，2001)，根据它们的氨基 酸序列，将血红蛋白归为1类和2类。没有合适分类的血红蛋白分配给O类，后来重命名为 3类(Wittenberg等，J. Biol. Chem. 277 =871-874, 2002)。因为基于的是一级氨基酸序列来 描述不同的类别，共生血红蛋白和非共生血红蛋白可以存在于1类或2类中，3类包括截短 的血红蛋白。这三个类别中的成员不仅氨基酸序列不同，而且生化特性也不同。截短的血 红蛋白是携带能够结合氧的血红素基团的小蛋白。1类和2类血红蛋白可以根据序列中某 些氨基酸的保守性而相互区分开来(参见Hunt等，2001，详述1类和2类)。2类血红蛋白 在位置B3和G3具有保守的脯氨酸残基，它们的缺失可以导致1类血红蛋白中B和G螺旋的 不同取向。序列中某些位置处的额外取代和电荷改变会导致这些螺旋堆积的进一步改变。
共生血红蛋白主要发现于豆科植物的根瘤中以及与细菌共生的非豆科植物中。在 植物中，已知共生血红蛋白在氧运输中起作用，因此通过将氧提供给根瘤来刺激氮固定。这 可能是通过豆血红蛋白对氧的高亲和性以及对氧的快速解离常数而获得的(Appleby，Sci. Prog. 76，365-398，1992)。豆血红蛋白属于多基因家族，通常得到翻译后修饰。来自透明颤 菌(Vitreoscilla. sp.)的细菌血红蛋白在其对氧的结合特性方面类似于豆血红蛋白，由 于该特性，所述蛋白质已经用于促进植物和微生物生长(US5，049，493 ；US5, 959，187)。透 明颤菌血红蛋白的Kd为6000nM，而拟南芥(Arabidopsis) 2类血红蛋白的Kd为130nM，低45 倍多。该高Kd使得透明颤菌血红蛋白非常适于刺激氧运输和随后的植物生长。因此，透明颤 菌血红蛋白和植物非共生血红蛋白是十分截然不同的(Bulow等，Trends Biotechnol. 17， 21-24,1999)。在用于促进植物细胞培养基中氧转移和用于植物再生上，透明颤菌血红蛋 白的用途可以和牛血红蛋白的用途相比拟(Azhakanandam等，EnzymeMicrob. Technol. 21， 572-577，1997)。另一方面，在一级蛋白质结构上，非共生血红蛋白不同于豆血红蛋白 (Arredondo-Peter等，1998)。此外，非共生植物血红蛋白对氧具有非常高的亲和性，缔合常 数适中，而解离常数非常低(比共生血红蛋白对氧的解离常数低约40倍(Arredondo-Peter 等，1998 ;Bulow 等，1999 ;Watts 等，Proc. Natl. Acad. Sci USA 98，10119-10124))。因此， 氧被稳定地结合，在氧感知或氧运输中的作用是不太可能的(Arredondo-Peter等，1998)。 然而，关于非共生血红蛋白在植物中的功能知道得很少。它们的生化特性看来不包括在氧 扩散中的作用，但作为加氧酶的作用是有可能的(Hill, Can. J. Bot. 76，707-712，1998)。氧 的结合导致了可以影响相关联的配体分子的构象改变，由此引发特定的生理响应(Goodman 和 Hargrove，J.Biol.Chem. 276，6834-6839，2001)。通过缺氧、提高蔗糖浓度(Trevaskis等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94， 12230-12234,1997)或通过硝酸盐(Wang 等，Plant Cell 12，1491-1510，2000)可以诱导 1类血红蛋白。它们也在发芽的种子和成熟植物的根中(Hunt等，2001)以及分化细胞中 (Ross等，Protopalsma218,125-133, 2001)表达。1类非共生血红蛋白被低氧胁迫所诱导 (Hunt等，2001)。Arabidopsis血红蛋白1提高了拟南芥在缺氧胁迫下的存活，并促进了早 期芽和根生长(Hunt 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99，17197-17202，2002)。改变植物生长 特性的1类血红蛋白分子的用途主要集中在操纵植物中的氧含量。Tarczynski和Shen (US 6，372，961)提出使用玉米血红蛋白来改变植物细胞中的氧浓度和刺激植物种子萌芽和幼 苗生长。同样，大麦血红蛋白的超表达显示出可提高玉米细胞中的ATP含量并维持低氧胁 迫下的能量状态(Guy等，WO 00/00597)。2类血红蛋白的表达模式不同于1类血红蛋白的，因为它们是在胚形成和种子成 熟过程中表达的，在开口周围(例如，气孔的叶肉细胞内，花柱顶端的周围、蜜腺气孔的周 围)或在分枝点(例如，出芽系统(bolt system)，新兴侧根的周围，花药和细丝的连接处) (Hunt等，2001)。2类血红蛋白的成员也对细胞分裂素有响应(Hunt等，2001)。Harper等 (TO 02/16655)已经显示，在Arabidopsis中由冷、渗透和盐水胁迫会诱导血红蛋白2，以及 400多种其它的基因。然而，该2类血红蛋白和提高的胁迫耐受性不相关。迄今为止，只描 述了少数2类血红蛋白序列，其中包括来自拟南芥的GLB2以及从受胁迫幼苗中分离的来 自甜菜(Beta vulgaris)(基因库登录号BE590299)和来自叶子cDNA文库(基因库登录号BQ586966)的两个 EST。发明详述令人惊奇地，本发明者现在已经证明植物2类非共生血红蛋白可以用于提高植物 产量和用于提高非生物胁迫。因此，根据本发明的第一个实施方案，提供了改变植物特性的方法，该植物特性选 自以下的一个或多个提高的植物产量、提高的生物量或改变的植物细胞分裂，该方法包括 在植物中提高编码植物2类非共生血红蛋白的核酸序列的表达。优选地，该提高的产量包 括提高的种子产量。术语“提高的产量”和“提高的生物量”包括相对于对应野生型植物的生物量而言 植物中一个或多个部分的生物量的增加。该术语还包括种子产量的提高，其包括种子生物 量的提高(其可以表示为单个种子的重量或总的种子重量)和/或(饱满)种子数量的提 高和/或种子大小的提高和/或种子体积的提高，每一项均相对于相应的野生型植物而言。 种子大小和/或体积的提高还可以影响种子的组成。种子产量的提高可能是由于花数量和 /或大小的提高。产量的提高还可提高收获指数(harvest index)，其表示为总生物量和可 采收部分如种子产量的比例。植物采收的部分可能在作物与作物之间有所不同，例如可以 是种子(在种植用于收获种子的稻、高粱或玉米的情况中)；可以是地面上的生物量(在玉 米用作青贮饲料或甘蔗的情况中)，根(例如甜菜)，果实(例如，西红柿)，棉花纤维或植物 中具有经济价值的任何其他部分。例如，本发明的方法可以用于就全部地面上的生物量和 能量含量而言提高稻和玉米的种子产量或提高青贮饲料玉米的产量。产量的提高还包括植 物在非胁迫条件下或在胁迫条件下比野生型植物更好的性能。胁迫条件包括任何类型的环 境胁迫以及生物和非生物胁迫。术语“改变的细胞分裂”包括细胞分裂的提高或降低或者异常细胞分裂/胞质分 裂，改变的分裂面，改变的细胞极性，改变的细胞分化。改变的细胞分裂还可以引起改变的 细胞大小和细胞数量。植物中改变的细胞分裂可以进一步导致该植物改变的生长。在此所用的术语“改变的植物生长”包括但不限于在植物生命周期中一个或多个 阶段(包括萌芽)中植物一个或多个部分(包括种子)的生长速度加快，每一项均相对于 对应的野生型植物而言。在植物生命周期的早期阶段中提高的生长速度可以引起提高的优 势(和对应的野生型植物相比较)。根据本发明优选的特征，较快的生长速度发生在植物生 命周期的大部分阶段中。生长速度的提高还可以改变植物采收的时间，使得有可能提早采 收。如果生长速度充分提高，那么甚至有可能进一步播种相同植物物种的种子(例如，在一 个常规生长周期中播种和采收稻植物，并接着播种和采收进一步的稻植物)或不同植物品 种种子(例如播种和采收稻米植物，接着，例如播种和可选地采收大豆、土豆或任何其他合 适的植物)，因此可提高每英亩的年生物质产量(由于提高了生长和采收任何特定植物的 次数(一年内))。根据本发明的另一实施方案，提供了改变植物结构的方法，该方法包括在植物中 提高编码植物血红蛋白、优选非共生血红蛋白、更优选2类非共生血红蛋白的核酸序列的 表达。“改变的结构”可能是由于细胞分裂的改变所致。在此所用的术语“结构”包括植物 的外观或形态，包括任何一种或多种结构特征或结构特征的组合。这样的结构特征包括植物任何细胞、组织或器官或者细胞、组织或器官群(包括根、叶、芽、茎、叶柄、毛状体、花、花 序(对于单子叶植物和双子叶植物)、圆锥花序、花瓣、柱头、花柱、雄蕊、花粉、胚珠、种子、 胚、胚乳、种皮、糊粉、纤维、形成层、木质层、心材、薄壁组织、通气组织、筛管分子、韧皮部或 输导组织等等)的形状、大小、数量、位置、纹理、排列和模式。因此，改变的结构包括植物改 变的生长的所有方面。有时，植物响应特定条件如胁迫和病原体(例如，线虫)而改变它们 的结构。因此，在术语“结构”的范围内，包括在胁迫条件下(不管生物或非生物的胁迫条 件下)改变的结构。根据本发明的再一实施方案，提供了提高植物的胁迫耐受性优选非生物胁迫耐受 性的方法，该方法包括在植物中提高编码植物2类非共生血红蛋白的核酸序列的表达。如在此所用的“提高的胁迫耐受性”包括，对于任何给定的胁迫，提高植物对该特 定胁迫的耐受性，而不管那些植物是否已经具有一定程度的对该特定胁迫的耐受性，或者 是全新地对该植物提供对所述胁迫的耐受性。改变的胁迫耐受性优选是对各种非生物胁 迫的改变的耐受性。通过存在于环境中的要素可导致非生物胁迫，其可以包括、但不限于 渗透胁迫、干旱、盐、脱水、冷冻、热、冷、水涝、受伤、机械胁迫、氧化性胁迫、臭氧、强光、重金 属、营养缺失、有毒化学物质及其组合。这些胁迫中的一些还可以因病原体(如病毒、细菌、 真菌、昆虫或线虫)感染而发生。根据本发明的优选特征，提高的非生物胁迫耐受性是提高 的对渗透胁迫的耐受性。在非生物胁迫是高温胁迫的情况中，任何植物血红蛋白可以用于提高胁迫耐受 性。因此，提供了提高植物高温胁迫耐受性的方法，包括在植物中提高编码植物血红蛋白、 优选非共生血红蛋白、更优选2类非共生血红蛋白的核酸序列的表达。术语“高温胁迫”指的是由高于给定植物最佳生长温度的温度而引起的胁迫条件。 术语“提高的耐受性”包括植物比相应的野生型植物能更高程度地耐受任何给定胁迫的能 力。这可以通过植物相对于相应野生型植物而言有提高的生长或存活率来表现。该术语还 包括胁迫阶段后更快的生长和/或发育恢复。在某些应用中，降低植物对特定类型胁迫的 耐受性可能也是有利的。因此改变的胁迫耐受性还包括降低植物对任何给定胁迫的耐受 性，即，使植物对任何给定胁迫更敏感。例如，这对于特定代谢物的生产可能是有利的。根据本发明方法的性能有利地导致植物具有改变的生长特征，包括提高的产量和 /或改变的细胞分裂和/或改变的结构和/或提高的胁迫耐受性，尤其是提高的渗透胁迫耐 受性和/或高温胁迫耐受性。根据本发明的优选特征，可用于本发明方法中的血红蛋白是植物血红蛋白，优选 双子叶植物的非共生血红蛋白。进一步优选地，源自双子叶植物的非共生血红蛋白是非共 生2类血红蛋白。根据Hunt等(2001)将血红蛋白归为1类或2类。有利地，可以使用双子叶植物的2类非共生血红蛋白来实施根据本发明的用于改 变结构或用于提高产量、生物量和/或细胞分裂的方法。优选地，2类非共生血红蛋白来自 十字花科的成员，如拟南芥，最优选地，2类非共生血红蛋白是由与SEQ ID NO 1、3或5中 任一序列基本上相似的序列编码的，或者是与SEQ ID NO 2、4或6中任一序列基本上相似 的蛋白质，或者是与SEQ ID NO 2具有至少65%序列同一性的同源植物2类非共生血红蛋 白。有利地，当待改变的植物特性是胁迫耐受性时，血红蛋白可以是来自双子叶植物的任何2类非共生血红蛋白，但是优选该2类非共生血红蛋白是从十字花科分离出来的，更 优选来自甜菜，最优选该2类非共生血红蛋白是由与SEQ ID NO 1基本上相似的核酸序列 编码的，或是与SEQ ID NO 2基本上相似的蛋白质，或是与SEQ ID NO 2具有至少65%序列 同一性的同源植物2类非共生血红蛋白。编码来自甜菜的完整非共生血红蛋白的序列迄今仍是未知的。因此，根据本发明 的另一方面，提供了编码植物2类非共生血红蛋白的分离核酸序列，所述核酸序列选自(i)包含根据SEQ ID NO 1的序列或其互补序列的核酸序列；(ii)编码蛋白质的序列，该蛋白质具有与SEQ ID NO 2所示氨基酸序列至少(以 递增次序的优选)79 %、80 %、85 %、90 %、95 %、96 %、97 %、98 %或99 %相同的氨基酸序 列；(iii)编码包含SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的蛋白质的核酸；(iv)根据(i)至(iii)中任一项的、由于遗传密码简并性的结果而产生的核酸；(ν)作为(i)至(iv)中任一项的核酸的剪接变体的核酸；(vi)由于编码SEQ ID NO 2所示的蛋白质或(i)至(ν)中所定义的等位基因之间 的差并而有差别的核酸；和(vii)编码根据⑴至(vi)中任一 DNA序列所编码的蛋白质的免疫活性和/或功 能性片段的核酸序列；和(viii)优选在严格条件下和(i)至(vii)所定义序列相杂交的核酸序列，前提条件是(i)至(viii)中没有一个包括基因库登录号BE590299或BQ586966 所示的序列。SEQ ID NO 1所示的核酸序列(也称为克隆BvXero2)编码来自甜菜的2类血红 蛋白。有利地，还可以使用(i)至(viii)的核酸来实施本发明的方法。这些核酸包括编码 SEQ ID NO 1所示序列编码的蛋白质的同系物、衍生物和功能片段的核酸。该术语还包括 SEQ ID NO 1的至少一部分；SEQ ID NO 1所示序列的互补序列；对应于SEQ ID NOl所示序 列的RNA、DNA、cDNA或基因组DNA ；由于遗传密码的简并性而产生的SEQ ID NO 1的变体； 该基因或蛋白质的家族成员；SEQ ID NOl的等位变体；不同的剪接变体和由于一个或多个 插入序列而被中断的SEQ ID NO 1变体。如在此所用的术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“DNA序列”或 “核酸分子”指的是任何长度的聚合形式的核苷酸，可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或 两者的组合。这些术语进一步包括双链和单链DNA和RNA。这些术语还包括已知的核苷酸 修饰，如甲基化、环化和“加帽”以及用类似物如肌苷取代一个或多个天然核苷酸。该术语 还包括肽核酸(PNA)，这是其中主链是由N-(2-氨乙基)_甘氨酸单元而不是糖所组成的拟 肽的DNA类似物。PNA模拟了 DNA的行为，并结合互补核酸链。PNA的中性主链导致与通常 可获得的水平相比有更强的结合和更高的特异性。此外，已经利用了 PNA独特的化学、物理 和生物特性来生产强有力的生物分子工具、反义和反基因药剂(antigene agent)、分子探 针和生物传感器。“重组"DNA分子意思是通过连接不同来源的DNA片段而产生的杂合DNA。 “异源”核苷酸序列是指不与启动子序列一起天然出现的序列。虽然该核苷酸序列相对于启 动子序列而言是异源的，其相对于植物宿主而言可以是同源的，或天然的，或异源的，或外 源的。
“编码序列，，或“开放阅读框”或“0RF”指的是，当置于合适调控序列的控制下时， 即当编码序列或ORF以可表达形式存在时，可以转录成mRNA和/或翻译成多肽的核苷酸序 列。编码序列或ORF通过5’翻译起始密码子和3’翻译终止密码子来限定。编码序列或 ORF可以包括RNA、mRNA、cDNA、重组核苷酸序列、合成制得的核苷酸序列或基因组DNA。可 以通过插入核酸序列来打断编码序列或0RF。编码基本上相同、但从不同来源分离的蛋白质的基因和编码序列可以由实质上有 差别的核酸序列所组成。同样的，可以将有实质性差别的核酸序列设计成表达基本上相同 的蛋白质。这些核酸序列例如是所给基因的不同等位基因存在的结果，或者是遗传密码简 并性或密码子使用差别的结果。优选密码子用法的差异说明于http://WWW. kazusa. or. jp/ codon0等位变体进一步定义为包括单核苷酸多态性(SNP)以及小的插入/缺失多态性 (INDEL ；INDEL的大小通常小于IOObp)。SNP和INDEL形成大多数生物体中天然多态性株 系中的最大类型序列变体。另外地，或者可替换地，尤其是在常规育种方法中，如标记辅助 的育种中，有时实践通过诱变处理植物来将等位变化引入植物中。合适的诱变方法之一是 EMS诱变。然后通过例如PCR来鉴定等位变体。接着通过选择步骤来选择所述序列的优越 等位变体，其将引起改变的生长特性。通常通过监控含有所述序列(例如，SEQ IDNO 1)的 不同等位变体的植物的生长特性来进行选择。可以在温室或田地中进行生长性能的监控。 更多的可选步骤包括将其中鉴定出优等等位变体的植物和另一植物杂交。例如这可以用来 获得令人感兴趣的表型特征的组合。根据本发明的另一方面，在育种过程中可以利用能够改变编码血红蛋白的核酸表 达的核苷酸序列。例如，在这样的过程中，鉴定出和能够改变植物中血红蛋白活性的基因 (该基因可以是编码血红蛋白的基因或能够影响血红蛋白活性的另一基因)遗传连锁的 DNA标记。然后将该DNA标记用于育种过程中来选择具有改变的生长特性的植物。目前可 以获得许多鉴定SNP和/或INDEL的技术。“杂交”是其中基本上同源互补的核酸序列相互退火的过程。杂交过程可以全部在 溶液中发生，即，两种互补性的核酸都在溶液中。依赖该过程的分子生物学方法工具包括聚 合酶链式反应(PCR ；和所有基于此的方法)，扣除式杂交、随机引物延伸、核酸酶Sl作图、引 物延伸、逆转录、cDNA合成、RNA的差异展示和DNA序列测定。还可以将互补核酸之一固定 于基质如磁珠、琼脂糖珠或任何其他树脂上来进行杂交过程。依赖该过程的分子生物学方 法包括poly (A+)mRNA的分离。此外，可以将互补核酸之一固定于固体支持物如硝酸纤维素 膜上或者尼龙膜上或者例如通过光刻法固定于例如硅化玻璃支持物上(后者称为核酸阵 列或微阵列或核酸芯片)来进行杂交过程。依靠该过程的分子生物学方法包括RNA和DNA 凝胶印迹分析、克集落杂交、斑点杂交、原位杂交和微阵列杂交。为了使杂交发生，通常将核 酸分子热或化学变性，以便将双链融化成单链和/或从单链核酸中除去发夹结构或其他二 级结构。杂交的严格性受到如温度、盐浓度和杂交缓冲液组成这些条件的影响。杂交的高 严格性条件包括高温和/或低盐浓度(盐包括NaCl和Na3-柠檬酸盐)和/或在杂交缓冲 液中包含甲酰胺和/或降低杂交缓冲液中化合物如十二硫基磺酸钠(SDS)的浓度和/或在 杂交缓冲液中除去如硫酸葡聚糖或聚乙二醇(促进分子聚集)这样的化合物。常规杂交条 件描述于例如(Sambrook等，2001)，但是，本领域技术人员可意识到，可以相对于已知或期 望的核酸序列同源性和/或长度而设计各种不同的杂交条件。足够低的严格杂交条件尤其优选用于分离和上文定义的本发明的DNA序列异源的核酸。引起异源性的要素包括如上所 述的等位性、遗传密码的简并性优选密码子用法的不同。本发明还涉及在严格条件下和根据本发明的DNA序列杂交的DNA序列，前提条件 是杂交DNA序列不包括基因库中登录号BE590299或BQ586966所示的序列。还可以通过间插序列来打断DNA序列。“间插序列”意思是打断了含有本发明DNA 序列的编码序列或打断了含有本发明DNA序列的DNA序列可表达形式的任何核酸序列。除 去间插序列可恢复编码序列或可表达形式。间插序列的实例包括内含子、可移动DNA序列 如转座子和DNA标记物如T-DNA。“可移动DNA序列”意指由于重组事件的结果而可以移动 的任何DNA序列。术语“序列的片段”意指所述序列的截短形式。截短序列(核酸或蛋白质序列)的 长度可以大范围改变，其最大大小不是关键。通常，截短的氨基酸长度为约5至约60个氨 基酸。在“功能性片段”的情况中，最小大小是足以向该序列提供至少与该被截短的原始序 列相当的功能和/或活性的足够大小的序列。例如可通过质谱或通过O2结合的动力分析 而测定血红蛋白的功能性(Arredondo-Peter等，1997)。“免疫活性”指的是抗体所识别(即可结合)的分子或其特异性片段，如特异性表 位或半抗原。例如使用Geyden等，Chem Biol.，3 (8)，679-688，1996中所述的肽扫描技术 可以测定特异性表位。功能片段还可包括含有对本发明蛋白质特异的表位的那些片段。本发明还提供了分离的植物2类非共生血红蛋白，该蛋白包括选自以下之一的多 肽a. SEQ ID NO 2 所示的多肽；b.具有与SEQ ID NO 2所示氨基酸序列至少(以递增的次序优选)79 %、80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%相同的氨基酸序列的多肽；c.由前述定义的核酸序列编码的多肽；d. (a)至(C)中任一定义的蛋白质的同系物、衍生物、免疫活性和/或功能性片段。有利地，根据上述a至d任一项的蛋白质可以用于本发明的方法中。与本发明的 蛋白质基本上相似的蛋白质包括SEQ ID NO 2的至少部分，SEQ ID NO 2的功能性片段、同 系物、衍生物、取代变体、缺失变体和插入变体，以及SEQ ID NO 2自身所示的蛋白质。在此所用的术语“蛋白质”、“肽”、“多肽”或“寡肽”指的是任何长度的聚合形式的 氨基酸。这些术语还包括已知的氨基酸修饰，如二硫键形成、半胱氨酸化、氧化、谷胱甘肽 化、甲基化、乙酰化、法呢基化、生物素化、硬脂酰化、甲酰化、添加硫辛酸、磷酸化、硫酸化、 遍在蛋白化、肉豆蔻酰化、棕榈酰化、香叶基化(geranylgeranylation)、环化(例如，形成 焦谷氨酸)、氧化、脱酰胺、脱水、糖基化(例如，戊糖、氨基己糖、N-乙酰氨基己糖、脱氧己 糖、己糖、唾液酸等)、酰化和放射性标记(例如，使用125I、131I、35S、14C、32P、33P、3H)以及非天 然形式的氨基酸残基，L-氨基酸残基和D-氨基酸残基。本发明蛋白质的“同系物”是相对于称它们为同系物的蛋白质而言含有氨基酸取 代、缺失和/或添加，但没有改变其一个或多个功能特性，尤其是没有降低所得产物的活性 的那些肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶。例如，蛋白质的同系物将包括该蛋白质的生物活性氨基 酸序列变体。为了生产这样的同系物，存在于蛋白质中的氨基酸可以由其他具有相似特性、 例如疏水性、亲水性、疏水力矩(hyclrophobicmoment)、抗原性、形成或分裂α -螺旋结构
12或折叠片结构的倾向等等的氨基酸所取代。本发明蛋白质的取代变体是那些除去了蛋白质氨基酸序列中至少一个残基并在 该位置插入不同残基的变体。氨基酸取代通常是单残基取代，但是也可以成群，这依对多肽 的功能限制而定；插入通常约为1-10个氨基酸残基，缺失一般是约1-20个残基。优选地， 氨基酸取代包括保守氨基酸取代。本发明蛋白质的插入氨基酸序列变体是将一个或多个氨基酸引入蛋白质中预定 位点的那些变体。插入可以包括氨基端和/或羧基端融合以及单个或多个氨基酸的内部序 列插入。通常，氨基酸序列内部的插入比氨基或羧基末端融合要小，例如约1至10个残基的 数量级。氨基末端或羧基末端融合蛋白或肽的实例包括酵母双杂交系统中所用的转录激活 子的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)6_标记物、谷胱甘肽s-转移酶、 蛋白质α、麦芽糖结合蛋白质、二氢叶酸还原酶、标记·100表位(eetarfqpgyrs)、c-myc表位 (eqkliseedl) ,flag-表位(dykdddk)、IacZXMP (钙调蛋白结合肽)、ha 表位(ypydvpdya)、 蛋白质 c 表位(edqvdi^rlidgk)和 vsv 表位(ytdiemnrlgk)。本发明蛋白质的缺失变体的特征是从该蛋白质的氨基酸序列中除去了一个或多
个氨基酸。使用本领域公知的肽合成技术，如固相肽合成等等，或通过重组DNA操作，可以容 易地制得本发明蛋白质的氨基酸变体。产生表现为取代、插入或缺失变体的变体蛋白质 的DNA序列操作也是本领域公知的。例如，在具有已知序列的DNA的预定位置处制造取 代突变的技术是本领域技术人员公知的，如通过M13诱变，T7-Gen体外诱变试剂盒(USB， Cleveland, OH)，快速改变定点诱变试剂盒(Stratagene，San Diego, CA)、PCR介导的定点 诱变或其他定点诱变方案。操纵DNA序列来产生表现为取代、插入或缺失变体的变体蛋白 质的另一可替换方案，包括靶向体内基因修饰，其可以通过嵌合RNA/DNA寡核苷酸实现， 如(Palmgren，Trends Geneticsl3 (9)，348，1997 ；Yoon 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.， 93(5)2071-2076,1996)中所述的。本发明蛋白质的“衍生物”是包含多肽中的至少约五个毗邻氨基酸残基、但是仍保 留蛋白质的生物活性的那些肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶。与多肽的天然形式的氨基酸序列 相比较，“衍生物”可以进一步包含另外的天然的、改变的糖基化的、酰基化的或非天然的氨 基酸残基。可替换地或另外地，与该多肽的天然形式的氨基酸序列相比较，衍生物可以包括 一个或多个非氨基酸取代，例如报告分子或其他配体，其共价或非共价结合该氨基酸序列， 例如与其相结合以便于检测的报告分子。寻找和鉴定血红蛋白同系物的方法是本领域普通技术人员已知的。用于比较的 序列比对方法也是本领域公知的，这样的方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。 BLAST算法计算百分比序列同一性，并进行两个序列之间相似性的统计学分析。进行BLAST 分析的软件可通过生物技术信息国家中心公开获得。GAP使用Needleman和Wunsch (J. Mol. Biol. 48 =443-453,1970)的算法来寻求两个完整序列之间匹配数最大化、而缺口数最小化 的比对。当使用Needleman-Wunsch算法来测定两个蛋白质序列之间的百分比同一性时，全 长序列优选和BL0SUM62矩阵结合使用，缺口开口罚分为10或11，缺口延伸罚分为0. 5或 1。存在于克隆BvXero2中的质粒pYPGEXER02的cDNA插入片段含有860bp的cDNA(SEQ ID NO 1，命名为BvXER02)，其带有456dp的开放阅读框，编码152个氨基酸的、 具有16.72kD预定分子量的多肽(SEQID NO 2)。该命名为Xero2的多肽包含对所有植物 血红蛋白均保守的氨基酸残基。这些包括血红素结合所需的cdl苯丙氨酸、C2脯氨酸和F8 近端组氨酸残基，以及涉及多种类型血红蛋白中配体结合的E7远端组氨酸。该命名法依据 的是用于动物血红蛋白的三维结构命名系统(Dickerson和Gels，Hemoglobin Structure, function, Evolution 禾口 Pathology, Benjiamin-Cumimings, Menlo Park, USA),其中螺方宠 用大写字母表示，螺旋间结构域(interhelical domain)用两个小写字母来表示。数字指 的是从N-端开始沿着结构域的位置。BvXer02属于GLB2组，描述为非共生植物血红蛋白。 该组含有保守残基 His (E7)、His(F7)和 Phe (cdl 1) (Hunt 等，2001 和 Trevaskis 等，1997)。 ARAth GLB2启动子的表达分析表明表达位于根、叶和花序中，在幼苗中可以通过细胞分裂 素处理来诱导，但不能通过脱落酸、2，4_二氯苯氧基醋酸、赤霉烯酸(giberellic acid)、苯 并(1，2，3)噻二唑-7-硫代羟酸S-甲基酯或茉莉酸甲基酯来诱导(Hunt等，2001)。可以通过将如下所述的本发明的分离核酸分子或核酸构建体引入宿主细胞，在允 许多肽表达的条件下培养宿主细胞并从培养物中收集所产生的多肽来生产该多肽。更有利地，本发明的方法适用于除了植物以外的生物体，例如，本发明适用于酵母 和细菌。给酵母提供对各种胁迫的耐受性的能力对于焙烤工业、酿造工业和其他工业可能 具有许多经济利益。对热和渗透胁迫的耐受性特别具有经济利益。同样，给细菌提供对各 种胁迫的耐受性的能力也是有利的。例如，具有提高的渗透和热胁迫耐受性的细菌或酵母 尤其适于大规模发酵生产，因为它们允许使用更浓缩的营养培养基，更适应对抗该发酵中 由代谢过程产生的热。因此，本发明还提供了包含如上所述的核酸序列或核酸构建体的宿 主细胞，其中所述宿主细胞是细菌、酵母、真菌、植物或动物细胞。该分离的多肽还可以通过 化学合成来生产。有利地，可以通过化学方法来改变编码血红蛋白的核酸序列的表达和/或改变血 红蛋白自身的活性，即通过外源性地应用能够改变血红蛋白活性和/或能够改变血红蛋白 基因(其可以是内源基因或引入植物的转基因)表达的一种或多种化合物或元素来实现。 外源应用可以包括用基因产物或其同系物、衍生物或活性片段和/或针对该基因产物的抗 体来接触或给予细胞、组织、器官或生物体。这样的抗体可以包括“plantibody”、单链抗体、 IgG抗体和重链camel抗体及其片段。还可以因降低直接或间接激活或灭活血红蛋白的因 素的水平而改变编码血红蛋白的核酸序列的表达和/或改变血红蛋白自身的活性。另外地 或可替换地，将相互作用性蛋白质或基因产物的抑制剂或激活剂接触或给予细胞、组织、器 官或生物体提供了另一外源方式来改变编码血红蛋白的核酸序列(其可以是内源基因或 以转基因存在)的表达和/或改变由该核酸序列编码的血红蛋白的活性。因此，根据本发明的一个方面，提供了改变植物生长特性的方法，该方法包括外源 性地应用能够改变血红蛋白基因的表达和/或能够改变血红蛋白活性的一种或多种化合 物或要素。另外地或可替换地，根据本发明的优选实施方案，可以通过重组方法来改变编码 血红蛋白的核酸序列的表达和/或改变血红蛋白自身的活性。这样的重组方法可包括改变 核酸序列的表达和/或改变蛋白质活性的直接和/或间接方法。例如，间接方法可包括将能够改变所述蛋白质(血红蛋白)的活性和/或所述基因(编码血红蛋白的基因)的表达的核酸序列引入植物中。该血红蛋白基因或血红蛋白可 以是野生型的，即天然的或内源性的核酸或多肽。或者，它可以是源自同一或另一物种的核 酸，该基因作为转基因引入，例如通过转化引入。该转基因可以通过有意的人为操纵而从其 天然形式在组成和/或基因组环境上得到充分的修饰。改变血红蛋白的活性和/或血红蛋 白基因表达的间接方法还包括抑制或刺激驱动天然基因或转基因表达的调控基因。可以将 这样的调控序列引入植物中。另一方面，一种直接的优选方法包括将编码血红蛋白或其同系物、衍生物或活性 片段的核酸序列引入植物中。可例如通过转化将核酸序列引入植物中。核酸序列可以来自 (直接或间接地(如果随后修饰了))任何来源，条件是当该序列在植物中表达时，会导致血 红蛋白核酸/基因表达的改变或血红蛋白活性的改变。可以从微生物来源如细菌、酵母或 真菌，或从植物、藻类或动物(包括人)来源中分离该核酸序列。该核酸可以通过有意的人 为操纵而由其天然形式在组成和/或基因组环境上得到充分的修饰。核酸序列优选是同源 核酸序列，即从植物获得的核酸序列，不管来自相同还是不同的植物物种。本发明另一实施方案中提供了包含本发明如上所述的核酸序列的核酸构建体。该 核酸构建体可以是表达载体，其中所述核酸序列可操作地连接了一个或多个允许该序列在 原核生物和/或真核生物宿主细胞中表达的控制序列。因此，根据本发明，提供了核酸构建体，其中包含(i)如上定义的(i)至(Viii)中任一项的分离中核酸序列；和(ii) 一个或多个控制(i)中核酸序列表达的控制序列；和可选地(iii)转录终止序列。优选地，上述核酸构建体中的分离核酸序列(i)是SEQ ID NO 1所示的。为了在 细胞、组织或器官(优选植物来源的)中实现蛋白质的表达，可以将蛋白质直接引入细胞 中，如通过显微注射或弹道方式，或者，可以将编码该蛋白质的分离核酸分子以可表达形式 引入细胞、组织或器官中。优选地，本发明的DNA序列包含编码序列或开放阅读框(ORF)，其 编码如上所述的本发明多肽或其同系物或衍生物或其免疫活性片段。“载体”或“载体序列”意指可以通过转化而引入生物体中且可以稳定地保持于该 生物体中的DNA序列。在例如大肠杆菌、根癌土壤杆菌、啤酒酵母或粟酒裂殖酵母的培养物 中维持载体是可能的。其他载体如噬菌体和粘粒载体可以在细菌和/或病毒中维持和增 殖。载体序列通常包括一组由限制酶识别的独特位点，即多克隆位点(MCS)，其中可以插入 一个或多个插入片段。“插入片段”意指整合进载体中所包含的MCS中一个或多个位点内的 DNA序列。“表达载体”构成载体的亚群，其中包括能够表达由插入片段所编码的蛋白质的 调控序列。表达载体是本领域已知的，能够在生物体包括细菌(例如大肠杆菌)、真菌(例 如啤酒酵母、粟酒裂殖酵母、巴斯德毕赤酵母)、昆虫细胞(例如杆状病毒表达载体)、动物 细胞(例如，COS或CHO细胞)和植物细胞(例如基于马铃薯病毒X的表达载体，参见例如 Vance等1988-W098/44097)中表达蛋白质。本发明包括含有编码本发明如上所述的蛋白质 及其同系物、衍生物、功能和/或免疫活性片段的插入片段的任何载体或表达载体。“可表达形式”意思是分离核酸分子处于适于转录成mRNA和/或翻译成蛋白质 的形式，这种转录和/或翻译可以是组成性的或由胞内或胞外信号诱导的，如环境刺激 或胁迫(促细胞分裂剂、缺氧(anoxia)、低氧(hypoxia)、温度、盐、光、脱水等)或化合物如IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷)或如抗生素(四环素、氨苄青霉素、利福 平、卡那霉素)，激素(例如，赤霉素、植物生长素、细胞分裂素、糖皮质激素、芸苔类固醇 (brassinosteroid)、乙烯、脱落酸等)，激素类似物(碘乙酸(IAA)、2，4-D等)，金属(锌、 铜、铁等)，或地塞米松，等等。正如本领域技术人员所已知的，功能蛋白的表达可能还需要 一种或多种翻译后修饰，如糖基化、磷酸化、去磷酸化，或者一种或多种蛋白质-蛋白质相 互作用，等等。所有这样的处理均包括在术语“可表达形式”的范围内。“表达”意思是在细胞自身中或在无细胞系统中生产蛋白质或核苷酸序列。其包括 从编码该产物的DNA转录成RNA产物，转录后修饰和/或翻译成蛋白质产物或多肽，以及可 能的翻译后修饰。优选地，蛋白质在特定细胞、组织或器官中(优选植物来源的)的表达是 通过在细胞、组织或器官中引入编码该蛋白质的分离核酸分子并使其表达来实现的，所述 分离的核酸分子例如是cDNA分子、基因组基因、合成寡核苷酸分子、mRNA分子或开放阅读 框，其中将核酸分子放置于与合适的调控序列(包括启动子，优选植物可表达的启动子，和 可选地终止子序列)可操作的连接方式中。“调控序列”指的是控制DNA序列，其对于影响与其连接的编码序列的表达和由这 些编码序列形成的转录产物的稳定性是必需的。该控制序列的特性根据宿主生物体而不 同。在原核生物中，控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和终止子。在真核生物中， 控制序列通常包括启动子、终止子和增强子或沉默子。术语“控制序列”指的是最起码包 括表达所需要的所有组分，还可以包括另外的有利组分，其决定特定基因在什么时候、在哪 里、以多少量表达，以及影响转录物的稳定性。提及“启动子”对应取其最宽的范围，并包括 源自典型真核生物基因组基因的转录调控序列，包括TATA盒，其是准确的转录启动所需要 的，可以具有或不具有CCAAT盒序列和另外的调控序列(即上游激活序列、增强子和沉默 子)，其响应于发育和/或外部刺激或者以组织特异性方式改变基因表达。如在此所用的，术语“衍生自，，或“来源于”指的是起源于所指定物种的特定整体 或整体组，但是不必需是从该指定来源直接获得的。在此调控序列还指下述组中的任何类型启动子、增强子、沉默子、内含子序列、 3’ UTR和/或5’ UTR片段、蛋白质和/或RNA稳定元件。术语“启动子”还包括典型原核生 物基因的转录调控序列，在该情况中可以包括-35盒序列和/或-10盒转录调控序列。术 语“启动子”还用来描述合成或融合分子或衍生物，其能给予、激活或增强核酸分子在细胞、 组织或器官中的表达。启动子可以含有另外的一个或多个特定调控序列的拷贝，以进一步 增强和其可操作连接的核酸分子的表达和/或来改变其空间表达和/或时间表达。这样的 调控序列可以置于异源启动子序列邻近处，以驱动核酸分子响应于外部刺激而表达或使核 酸分子在特定细胞、组织或器官如分生组织、叶、根、胚、花、种子或果实中表达。在本发明的范围中，启动子优选是植物可表达的启动子序列。然而，在非植物细胞 如细菌、酵母细胞、昆虫细胞和动物细胞中也起作用或仅在其中起作用的启动子并不排除 于本发明之外，例如本发明的方法可用于改变酵母的胁迫耐受性。“植物可表达”意思是启 动子序列，包括其中添加的或其中含有的任何另外的调控序列，至少能够诱导、赋予、激活 或增强在植物细胞、组织或器官中的表达，优选在单子叶植物或双子叶植物细胞、组织或器 官中的表达。本发明范围内，“受调控的启动子”或“可调控的启动子序列”是能够在植物 特定细胞、组织或器官，或者细胞、组织或器官群中向结构基因提供表达的启动子，可选地是在特定条件下赋予表达，然而，其通常并不在所有条件下、在整个植物中均赋予表达。因 此，可调控的启动子序列可以是在植物内的特定位置，或者在一组特定条件下在整株植物 中，如经化合物或其它诱导剂(elicitor)诱导基因表达后，能够驱动与之可操作连接的基 因发生表达的启动子序列。可用于本发明实施中的可调控启动子赋予了植物内特定位置处和/或植物特定 发育阶段的表达，其可以是组成型地或诱导后。这样的启动子范围内包括细胞特异性启 动子序列、组织特异性启动子序列、器官特异性启动子序列、细胞周期特异性基因启动子序 列、可诱导启动子序列和已被修饰而能够任一时间在植物特定部分中提供表达的组成型启 动子序列，所述修饰例如是将组成型启动子整合入可转座遗传元件(Ac、DS、Spm、En或其它 转座子)中。本领域技术人员将意识到，“可诱导这样的启动子”是这样的启动子，其转录 活性响应于发育性、化学、环境或物理刺激而得到提高或被诱导。同样，本领域技术人员将 理解，“组成型启动子”是在生物体、尤其是植物的大部分生长和发育阶段，但不必在全部阶 段，具有转录活性的启动子。相反，术语“普遍存在的启动子”指的是在生物体、尤其是植物 的大多数部位，但不必在所有部位上，具有转录活性的启动子。术语“细胞特异性”指的是表达主要发生在特定细胞或细胞类型中(尤其是植物 来源的)，但不必仅仅在该细胞或细胞类型中。同样，术语“组织特异性”应理解为表达主要 发生在特定组织或组织类型中(尤其是植物来源的)，但不必仅仅在该组织或组织类型中。 同样，术语“器官特异性”指的是表达主要发生在特定器官，尤其是植物来源的特定器官，但 不必仅仅在该器官中。可以通过加入源自一个或多个组织特异性启动子或组织特异性可诱导启动子的 核苷酸序列来修饰可在整个植物中诱导表达的组成型启动子，以对其赋予组织特异性。例 如，可以通过加入玉米Adhl启动子序列来修饰CaMV 35S启动子，以对其赋予无氧调控 的根特异性表达模式(Ellis等，1987)。另一实例包括通过将CaMV35S启动子与玉米富 含甘氨酸的蛋白质GRP3基因的元件来赋予根特异性或根大量基因表达(Feix和Wulff 2000-W00015662)。本领域技术人员可以很容易地从公众可获得或容易获得的来源中选择 合适的启动子序列，用于调控上述多肽的表达。根据本发明的优选启动子是组成型启动子，例如G0S2或CaMV35S，或通过环境刺 激可诱导的启动子，或种子特异性启动子。将核酸分子置于启动子序列的调节控制下或与启动子序列可操作连接意思是核 酸分子的放置方式能使其表达受到启动子序列的控制。通常将启动子放置在它所调控的核 酸分子的上游，或在5’ -端，并在转录起始位点的2kb内，但并非必须如此。在异源启动子 /结构基因组合的构建中，通常优选将启动子放置于这样的位置其距离基因转录起始位 点的距离大致与该启动子和控制其天然环境下所控制的基因(从其衍生出启动子的基因) 之间的距离相同。正如本领域已知的，可以容许该距离有一些变化而不失去启动子的功能。 同样地，调控序列元件相对于待置于其控制下的异源基因的优选位置由该元件在其天然环 境(即从其衍生出所述基因)下的位置来确定。再者，正如本领域已知的，该距离也可以有 一些变化。“可操作连接”指的是并列排列方式，其中所述的组分处于使它们以其确定的方式 发挥功能的关系中。“可操作地连接”了编码序列的控制序列是以这样的方式连接的使得在该控制序列相容的条件下获得编码序列的表达。当控制序列是启动子时，对本领域技术 人员显而易见的是使用双链核酸。术语“终止子”指的是转录单位末端的DNA序列，其发出终止转录的信号。终止子 是含有聚腺苷酸化信号的3’ -非翻译DNA序列，其有助于将聚腺苷酸序列添加至一级转录 物的3’-端。源自病毒、酵母、霉菌、细菌、昆虫、鸟类、哺乳动物和植物的在细胞中有活性的 终止子是已知的并描述于文献中。它们可以从细菌、真菌、病毒、动物和/或植物中分离。特别适用于本发明基因构建体中的终止子实例包括根癌土壤杆菌胭脂碱合酶 (NOS)基因终止子、根癌土壤杆菌章鱼碱合酶(OCS)基因终止子序列、花椰菜花叶病毒 (CaMV) 35S基因终止子序列、Oryzasativa ADP-葡萄糖焦磷酸化酶终止子序列(t3’ Bt2)、 玉米玉米蛋白基因终止子序列、rbcs-lA基因终止子和rbcs-3A基因终止子序列，等等。本发明的核酸构建体可以进一步包括复制起点，当所述核酸构建体需要在细胞中 作为游离体基因元件(例如，质粒或粘粒分子)来维持时，它对于在特定细胞类型例如细菌 细胞中的维持和/或复制是必需的。优选的复制起点包括，但不限于，Π-ori和colE复制 起点。核酸构建体可以任选地包括选择标记基因。如在此所用的，术语“选择标记基因” 包括向其中发生表达的细胞提供表型的任何基因，它的表达可以有助于鉴定和/或选择出 被本发明的构建体或其衍生物转染或转化的细胞。合适的标记可以选自给予抗生素或除草 剂抗性的标记。因此，含有重组DNA的细胞能够在会杀灭未转化细胞的抗生素或除草剂的 浓度存在下存活。选择标记基因的实例包括bar基因，其提供了对除草剂Basta的抗性； nptll基因，其赋予对抗生素卡那霉素和新霉素的抗性；氨苄青霉素抗性(Ampr)、四环素抗 性基因(Tcr)，赋予潮霉素抗性的hpt基因，膦丝菌素抗性基因，氯霉素转乙酰酶(CAT)基 因，潮霉素抗性基因。可视标记，如绿荧光蛋白(GFP)，β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因和萤 光酶基因等等也可以用作选择标记。可以使用本领域技术人员公知的重组DNA技术来构建用于根据本发明方法中的 重组DNA构建体。可以将基因构建体插入载体中，所述载体可以是商业化的，适于转化进宿 主细胞，优选植物细胞，并适于在转化细胞中表达目的基因。根据本发明优选的特征，编码血红蛋白的核酸序列在植物中得到超表达。获得基 因或基因产物的增强或提高表达的方法是本领域公知的，包括例如通过强启动子驱动的超 表达，使用转录增强子或翻译增强子。另一方面，该核酸序列的下调也可以引起改变的植物生长特性。通过以有义或反 义方向表达编码血红蛋白的核酸序列，可以获得生长特性有所改变的植物。下调的技术是 本领域公知的。如在此所用的表达的“基因沉默”或“下调”指的是降低基因表达的水平和 /或活性基因产物的含量和/或基因产物活性的水平。可通过例如以有义方向(如果期望 获得共抑制)添加编码序列或其部分来获得这样的表达降低。旨在实现基因表达沉默的核酸构建体(基因构建体)可以含有编码血红蛋白的核 酸序列，例如SEQ ID NO 1自身所示序列(或其一个或多个部分)，其相对于启动子序列而 言处于有义和/或反义方向。在本发明的方法中可以采用处于同向或倒置重复形式的内源 基因至少一部分的有义或反义拷贝。还可以通过将SEQ ID NO 1所示核苷酸序列反义形式 的至少部分引入植物中来改变植物的特征。应该比较清楚的是部分核酸就可以获得所期望的结果。同源反义基因相比于异源反义基因而言更为优选，同源基因是植物基因，优选来 自相同植物品种的植物基因，而异源基因来自非植物物种。另一下调基因表达或基因沉默的方法包括使用核酶，例如Atkins等 (W094/00012)、Lenee 等 1995 (W095/03404)、Lutziger 等 2000 (W000/00619)、Prinsen 等 1997(W097/3865)和 Scott 等 1997 (W097/38116)中所述的。还可以通过插入诱变(例如，T-DNA插入或转座子插入)，或通过基因沉默策略，包 括RNA介导的沉默，来获得基因沉默，如Angell和Baulcombe 1998 (W098/36083)、Lowe等 1998(W098/53083)、Lederer 等 1999 (W099/15682)或 Wang 等 1999 (W099/53050)等等所述 的。如果在内源基因上存在突变，则还可以降低与SEQ ID NO 1、3或5基本上相似的内源 基因的表达，或降低所编码蛋白质的活性。此外，本发明还涉及生产转基因植物的方法，该转基因植物与野生型植物相比具 有改变的生长特性，该方法包括以下步骤(i)将本发明的编码血红蛋白的核酸序列引入植物或植物细胞中；和(ii)在促进再生和/或成熟植物生长的条件下培养该植物或植物细胞。术语“植物细胞”包括源自任何植物的任何细胞并以单个细胞、细胞群或愈伤组织 存在于培养物中。植物细胞还可以是培养物中或在自然状态下生长的发育中或成熟植物中 的任何细胞。有利地，本发明的方法适用于任何植物。“植物”包括所有属于Viridiplantae的 植物物种。本发明适用于任何植物，尤其是单子叶植物和双子叶植物，包括饲料(fodder or forage)作物、观赏植物、粮食作物、树或灌木，其选自以下组中金合欢属、槭属、猕猴 桃属、七叶树属、新西兰贝壳杉、合欢(Albizia amara)、三色桫椤(Alsophilatricolor)、 须芒草属、落花生属、槟榔、Astelia fragrans、鹰嘴紫云英(Astragalus cicer)、 Baikiaea pluri juga、桦属、芸苔属、木榄(Bruguiera gymnorrhiza) 、Burkea africana、 Butea frondosa、Cadaba farinosa、朱樱花(Calliandra spp. ) 茶树、美人蕉、辣椒、肉桂(Cassica spp. ) 、 Centroema pubescens、木瓜属、中国肉桂(Cinnamomum cassia)、小果、咖啡树、
Colophospermum mopane、 Coronillia、沙枸子(Cotoneaster serotina) 、
山楂、甜瓜、柏木、Cyathea dealbata、 (Cryptomeria japonica)、香茅
属、Cynthea dealbata> |m Dalbergia monetaria> DavalIiadivaricata> Desmodium spp.、Dicksonia squarosa> Diheteropogonamplectens> Dioclea spp.、Dolichos spp.、 Dorycnium rectum、Echinochloa pyramidal is > Ehrartia spp.、Eleusine coracana> Eragrestis、刺桐、按树、Euclea schimperi>Eulalia villosa、养麦、Feijoa sellowiana、 草莓、千斤拔、Freycinetia banksii、Geranium thunbergii、银杏、Glycine javanica、丁 香(Gliricidiaspp.)、陆地棉、银样(Grevillea spp.) >Guibourtia coleosperma、黄苗、牛 鞭草(Hemarthia altissima)、黄茅(Heteropogoncontortus)、大麦、红苟茅(Hyparrhenia rufa)、小 连 翅、Hypertheliadissoluta、Indigo incarnata、鸾 尾、Leptarrhena pyrolifolia、古月枝子(Lespediza spp.)、莴苣(Lettuca spp.)、银合欢、Loudetiasimplex、 Lotonus bainesii>(Lotus spp· )、Macrotylomaaxillare、H、L、胃 ε 、 水杉、大蕉、Nicotianum spp.、驴食草、Ornithopus spp.、禾S属、Peltophorum africanum、ifllS ^fL M > Persea gratissima> ^^^M^^riiM^ Phoenix canariensis> Phormium cookianum、石楠、白云杉、松属、豌豆、新西兰罗汉松(Podocarpus totara)、Pogonar thria fleckii> Pogonarthriasquarrosa> M> /R Bf ftW (Prosopis cineraria) > 花 Jft 丰公(Pseudotsuga menziesii) > Pterolobium stellatum、西 羊梨、f乐(Quercus spp. )、Rhaphiolepsis umbellata、Phopalostylis sapida、Rhus natalensis、Ribes grossularia> Ribes spp.、束Ij 槐、属、；S钩子、^JP、Schyzachyrium sanguineum、金丰公 (Sciadopitysverticillata)、；!匕美红杉(Sequoia sempervirens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、！梁、疲菜、Sporobolus fimbriatus>Stiburus alopecuroides>StyIosanthos humi 1 i s、葫芦茶、落羽杉、阿拉伯黄背草(Themeda triandra)、三叶草属、小麦属、异叶 ^k (Tsuga heterophylla) > Mto M> MsLM^ffatsoniapyramidata>ΞΕ
米、苋菜、朝鲜蓟、芦笋、椰菜、芽甘蓝、卷心菜、Canola、胡萝卜、花椰菜、芹菜、绿叶羽衣甘 蓝(Collardgreens)、亚麻、羽衣甘蓝、扁豆、油籽油菜、秋葵、洋葱、马铃薯、稻、大豆、草 (Straw)、甜菜、甘蔗、向日葵、西红柿、南瓜和茶等等，或者上述具体提及的任何植物的种子 或上述任一物种的组织、细胞或器官培养物。根据本发明优选的特征，所述植物是作物，包 括大豆、向日葵、Canola、苜蓿、油籽油菜或棉花。进一步优选地，根据本发明的植物是单子 叶植物，包括Poaceae的成员，如甘蔗，最优选植物是谷类，如稻、玉米、小麦、小米、大麦和 高粱、燕麦。本发明清楚地扩展至可通过在此所述的任一方法获得的任何植物细胞或植物，并 扩展至其所有植物部分和繁殖体。本发明包括具有上述改变特性的任何植物细胞、植物部 分或植物，所述改变的特性包括提高的产量、提高的生物量、提高的细胞分裂、提高的渗透 胁迫耐受性和/或改变的结构，所述植物细胞、植物部分或植物中编码植物2类非共生血红 蛋白的核酸序列的表达提高和/或植物2类非共生血红蛋白的活性改变。本发明还包括具 有提高的高温胁迫耐受性的任何植物细胞、植物部分或植物，所述任何植物细胞、植物部分 或植物中编码植物血红蛋白的核酸序列的表达提高。本发明还包括这类植物的转基因可 采收部分或繁殖体，其中所述可采收部分选自种子、叶、花、果实、茎培养物、根茎、块茎和鳞 茎。术语“植物”进一步包括悬浮培养物、胚、分生组织部分、愈伤组织、叶、种子、根、芽、配 子体、孢子体、花粉和小孢子。本发明进一步扩展至包括通过上述任一方法产生的转化或转染细胞、组织、器官 或整个植物的转基因祖先或后代，仅有的要求是后代呈现出与通过根据本发明方法产生的 那些亲本相同的基因型和/或表型特征。可使用任何已知方法将核酸分子或含有它的核酸构建体引入细胞来转染或转化 细胞。使用本领域已知的方法可以从单个转化或转染细胞再生出完整生物体。可以用本发 明的核酸构建体转化能够随后克隆繁殖(不管通过器官发生或是胚胎发生)、并从其再生 出整个植物的植物组织。特定组织的选择将根据可获得的并最适于待转化的特定物种的克 隆繁殖系统而改变。示范性组织目标物包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组 织、已有的分生组织(例如，顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如， 子叶分生组织和下胚轴分生组织)。优选通过转化将目的基因引入植物。在此涉及的术语“转化”包括将外源多核苷 酸转移至宿主细胞中，而不考虑所用的转移方法。可以将多核苷酸瞬时或稳定地引入宿主细胞中，并且可维持非整合状态，例如作为质粒，或者，可以整合入宿主基因组中。然后以本 领域技术人员公知的方式使用所得到的转化植物细胞来再生转化植物。植物物种的转化目 前是非常常规的技术。转化方法包括使用脂质体、电穿孔、提高游离DAN摄取的化学品、将DNA直接注 射进植物中、颗粒枪轰击、使用各种病毒或花粉转化以及显微注射。方法可以选自用于原 生质体的钙 / 聚乙二醇方法(Krens，F. A.等，1882，Nature 296,72-74 ；Negrutiu I 等， 1987，PlantMol. Biol. 8，363-373)；原生质体电穿孔(Shillito R. D.等，1985Bio/Technol 3,1099-1102)；显微注射进植物材料中(Crossway A.等，1986，Mol. Gen. Genet 202， 179-185)；包被了 DNA 或 RNA 的颗粒轰击(Klein Τ. Μ.等，1987，Nature 327，70)，用病毒 (非整合型)感染等等。根据本发明优选的方法是土壤杆菌介导的转化(An等，EMB0J.， 4,277-284,1985 ；Dodds, Plant genetic engineering,1985 ；Herrera-EstrelIa φ, EMBO J.，2，987-995，1983 ；Herrera-EstrelIa 等，Nature, 303, 209-213,1983)，包括“花浸染 (flower dip)” 转化方法(Bechtold 和 Pelletier，MethodsMol. Biol.，82，259-266，1998 ； Trieu 等，Plant J.，22 (6)，531-541，2000)。根据本领域公知的方法，可以从转化或转染细胞再生出整个植物。可以用本发明 的基因构建体转化能够随后克隆繁殖的植物组织(不管通过器官形成或胚胎形成)从其再 生整个植物。特定组织的选择根据可获得的并最适于待转化特定物种的克隆繁殖系统而改 变。示范性的组织目标物包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组织、已有的分 生组织(例如，顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如，子叶分生组 织和下胚轴分生组织)。在此所用的术语“器官形成”意思是芽和根从分生组织中心循序发 育的过程。在此所用的术语“胚胎形成”意思是芽和根以一致的方式(不是循序地)一起 发育的过程，无论是从体细胞还是从配子开始。通常在转化后，选择存在一个或多个由植物可表达基因编码的标记的植物细胞或 细胞群，所述植物可表达基因是和目的基因共转移的，接着将转化材料再生成整个植物。例 如使用DNA印迹分析来评价推定的转化植物中目的基因的存在，拷贝数和/或基因组组织。 可替换地或另外地，可以使用RNA印迹和/或蛋白质印迹来分析新引入的DNA的表达水平， 两种技术都是本领域普通技术人员公知的。可以通过各种方式来繁殖所产生的转化植物，如通过克隆繁殖或传统的育种技 术。例如，第一代(或Tl)转化植物可以自交而获得纯合的第二代(或T2)转化子，再通过 传统育种技术进一步繁殖T2植物。所产生的转化生物体可以是各种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞 的嵌合体；克隆转化子(例如，所有细胞均转化成含有表达盒)；转化和未转化组织的嫁接 体(例如，植物中，将转化过的根砧木嫁接至未转化接穗上)。本发明进一步涉及植物非共生血红蛋白或编码植物非共生血红蛋白的核酸序列 用于改变植物特性的用途。尤其是，本发明还涉及编码植物2类非共生血红蛋白的核酸序列用于提高植物产 量、生物量或细胞分裂中的一种或多种的用途。优选地，提高的产量至少包括提高的种子产量。本发明进一步涉及编码植物2类非共生血红蛋白的核酸序列用于变植物结构的用途。优选地，用于提高植物产量、生物量或细胞分裂中的一种或多种或者用于改变植 物结构的编码植物2类非共生血红蛋白的核酸序列是从双子叶植物分离的，优选来自十字 花科，更优选来自拟南芥，最优选该分离的核酸如SEQ ID NO 3所示。本发明还涉及编码植物2类非共生血红蛋白的核酸序列用于提高植物非生物胁 迫耐受性的用途。优选该非生物胁迫是渗透胁迫。本发明还涉及编码植物血红蛋白的核酸 序列用于提高植物高温耐受性的用途，优选所述植物血红蛋白是非共生血红蛋白，更优选 为2类非共生血红蛋白。优选地，用来提高渗透胁迫耐受性或用来提高高温胁迫耐受性的编码植物2类非 共生血红蛋白的核酸序列是从双子叶植物分离的，优选来自十字花科，更优选来自甜菜，最 优选该分离的核酸与SEQ ID NOl基本上相似。此外，本发明还涉及编码血红蛋白的核酸序列和血红蛋白自身用于改变细菌或酵 母的胁迫耐受性的用途。本发明进一步还扩展至编码根据本发明的血红蛋白及其同系物、 衍生物和活性片段的核酸序列以及血红蛋白自身及其同系物、衍生物和活性片段在治疗或 诊断组合物中的用途。本发明还扩展至编码本发明的植物2类非共生血红蛋白及其同系 物、衍生物和活性片段的核酸序列以及血红蛋白自身及其同系物、衍生物和活性片段在调 控O2或其他化合物如NO含量中的用途。在这方面，调控本发明的植物2类非共生血红蛋 白的含量还可以用来改变生物体中已有的信号转导途径。因此，本发明还提供了编码本发 明的植物2类非共生血红蛋白的核酸序列和/或血红蛋白自身在改变信号转导途径中的用 途。这些用途也包括于本发明中。此前所述的核酸序列(及其部分和能够与其杂交的序列)和此前所述的氨基酸序 列(及其同系物、衍生物和活性片段)可以用来改变植物的生长特性，如前所述。因此这些 序列可以用作生长调节剂，如除草剂或生长刺激剂。本发明还提供了含有上述任一氨基酸 序列所示的蛋白质或其同系物、衍生物或活性片段的组合物，其可用作生长调节剂。附图描述

图1 显示了来自拟南芥(at)、甘蓝型油菜(Brassica napus，bn)、糖甜菜(Beta vulgaris，bv)、陆地棉(Gossypium hirsutum，gh)、番爺(Lycopersicon esculentum，le)、 乌天麻(Casuarinaglauca，eg)的血红蛋白序列之间的同源性的累积和消除树状图。图2 :BvXero2基因赋予酵母对渗透胁迫和高温的耐受性。上排表示野生型酵母， 下排是用BvXero2转化的酵母菌株。从左至右YPD上的对照，37°C生长2和3天后，在1. 7M 山梨糖醇上生长4天后。图3 用BvXero2作为探针对基因组甜菜DNA进行Southern印迹。所用的酶是 BamHI、HindIII和EcoRI。右边所示的是Ikb标记。图4 用BvXero2作为探针的RNA印迹。用250mM NaCl处理甜菜植物后的不同时 间点(小时)。α 3-微管蛋白用作对照。图5 用BvXero2作为探针的RNA印迹。用100 μ M ABA处理甜菜植物后的不同时 间点(小时)。α 3-微管蛋白用作对照。图6 进入克隆(entry clone) p55的图示，在AttLl和AttL2位点内含有CDS2591， 用于在PD0NR201主链中Gateway 克隆。⑶S2591是拟南芥非共生血红蛋白Hb2的内部代码。该载体还含有细菌卡那霉素抗性盒和细菌复制起点。图7 用于在植物中在P35S和T-玉米蛋白-T_rbcS-δ GA双终止子序列控制下表 达⑶S2591的二元载体。⑶S2591是拟南芥非共生血红蛋白Hb2的内部代码。该载体含有 源自Ti质粒的T-DNA，其由左边界(LB重复，LB Ti C58)和右边界(RB重复，RB Ti C58) 所确定。从左边界至右边界，该T-DNA含有用于转化植物抗生素选择的可选择标记盒；用 于转化植物的视觉筛选的可筛选标记盒；“组成型启动子-⑶S2591-玉米蛋白和rbcs- δ GA 双终止子”。该载体还含有来自PBR322的用于细菌复制的复制起点以及可用壮观霉素和链 霉素进行细菌选择的选择标记(Spe/SmeR)。图8 花结(rosette)面积。转基因和对照非转基因植物的平均花结面积以任意 单位表示，在21至45dpi之间有4个时间点。显示了标准误差直方图。图9 从胁迫(150mM NaCl)中恢复5周后的转基因植物(左边2个植物)和非转 基因对照植物(右边2个植物)。在54dpi作图。图10 序列表。
实施例现在将参照以下实施例来描述本发明，这些实施例仅仅是为了说明。除非在实施例中另外指出，所有重组DNA技术根据如Sambrook等(1989)或 Ausubel等(2000)卷1和2所述的方案进行。用于植物分子操作的标准材料和方法描述于 R. D. D. Croy (1983)中。实施例1 通过盐胁迫诱导的甜菜cDNA文库的构建将甜菜种子(Beta vulgaris cv. Dita)播种于含有沙子和蛭石(1 Iw/ w)混合物的罐中。将植物在温室条件下生长(20°C 8h，25°C 16h，补充光照来模拟最 小12h的光周期)。定期用营养液灌溉植物，该营养液含有2. 4g/l Ca(NO3)2 ·4Η20， Ig/1KN03, lg/lMgS04 · 7H20, 0. 3g/l KH2PO4, 5. 6mg/l Fequelate (Kelantren, Bayer)， 1. lmg/lZnS04 · 7H20, 3. 3mg/l MnO4 · H2O, 0. 3mg/l CuSO4 · 5H20，3. 8mg/l H3BO3,0. 18mg/ 1 (NH4)6Mo7 · 4H20。为了构建cDNA文库，在采收前一天用200mMNaCl灌溉3周大的植物。用cDNA合成试剂盒(Stratagene)进行定向cDNA合成，其中使用从盐处理过 的甜菜植物的叶子制得的poly (A)+RNA。将cDNA连接进噬菌体APG15载体中，并使用 Gigapack III Gold Packaging Extract (Stratagene)包装。该噬菌体带有可切除的表 达质粒pYPGE15(URA3作为选择标记)，可以直接用于大肠杆菌和酵母互补(Brimelli和 Pall, Yeast，9，1309-1318，1993)。用 cre-lox 重组酶系统从 λ PG15 收集质粒 cDNA 文库 (Brunelli 和 Pall, Yeast,9,1309-1318，1993)。实施例2 渗透胁迫耐受性筛选试验的建立所用的酵母菌株是二倍体菌株W303/W303(canl_100，his 3-11、15，leu2_3、 112，trpl-1，ura3-l, GAL+)及其二倍体突变株，缺乏磷酸甘油脱氢酶(gpdl)，命名 为JM164，它是从两个单倍体gpdl突变菌株(YRA111(W303-1A gpd: :TRP1 mat a)和 YRAl 14(W303-lAgpdl::TRPl mat α))构建的。使用二倍体菌株，因为这样可以避免分离 出可能提供渗透胁迫耐受性的隐性染色体突变株。将菌株生长于YPD培养基上(2%葡萄 糖，2%蛋白胨和酵母提取物)或在SD培养基上(2%葡萄糖，0.7%无氨基酸的酵母氮
23碱(Difco)，50mM MES [2-(N-吗啉代)乙烷磺酸]，用Tris (Tris (羟甲基)氨基甲烷)调节 至pH5. 5，以及所需的氨基酸，嘌呤和嘧啶碱基)。第一步，在YPD和SD两种培养基上，比较gpdl突变菌株(JM164)和野生型二倍体 菌株对山梨糖醇的敏感度。为此，使酵母菌株在1. 3M至1. 8M不同山梨糖醇浓度的YPD或 SD培养基上28°C生长4天。山梨糖醇浓度为1. 7M时，观察到gpdl突变株和野生型之间有 明显的生长差异。gpdl突变株比野生型更敏感。第二步，测定用于转化的最佳条件，以优化在转化反应中所用的细胞量和文库质 粒量。在300ml的YPD中接种30 μ 1 JM164细胞的饱和预培养物。将该培养物生长过夜直 至获得OD66tl ^ 0. 8。将酵母细胞在2000rpm离心，用水洗涤，然后用AcLiTE溶液(0. IM乙 酸锂，IOmMTris-HCl pH7. 6和ImM EDTA (乙二胺四乙酸二钠盐))洗涤。将细胞沉淀重悬于 2ml AcLiTE溶液中，并在30°C振荡培养15分钟。培养后，加入200μ1 ssDNA(10mg/ml)。 然后将溶液分成IlOyl等份，将其放置于Eppendorf管中，加入200ng cDNA文库。接着 使用Gietz等描述的方法通过热休克转化。简短地说，将500 μ 1 PEG-AcLiTE溶液(含有 40% w/w PEG (聚乙二醇)4000的AcLiTE溶液)加入每个等份中。振荡后，将等份试样在 30°C培养30分钟，在42°C培养20分钟。然后收集细胞并重悬浮于200 μ 1的IM山梨糖醇 中。将两个等份试样涂布于含有SD的Hem。皮氏培养皿中，培养基中具有除色氨酸(用 于gdpl突变的标记)和尿嘧啶(用于质粒的标记)外的全部所需的补充剂。为了对转化 效率进行定量，从原始细胞沉淀中分离出四个55 μ 1等份，并用0、10、50和IOOng cDNA文 库接种。然后实施相同的转化方案，最后将细胞重悬浮于ΙΟΟμ 1山梨糖醇中并涂布于含有 相同SD溶液的7αιιΦ皮氏培养皿上。JM164菌株的平均转化效率为每ng cDNA文库约20 个转化子。实施例3 =Xero基因的分离转化三天后，已经形成了集落。在无菌水中收集集落，并通过对不同稀释度涂布平 板来定量细胞的数量。将收集后获得的细胞悬浮液浓缩约10倍，并涂布于含有1. 7M山梨 糖醇的YPD培养基或SD培养基上。将平板在28°C培养，并选择出四天后能生长的集落。在 选择培养基上再检测第一轮中分离出的集落的耐受性，丢弃那些没有提供显著耐受性的集 落。从保留的集落中，通过在基本培养基中选择来除去质粒。这可以通过获得每个菌株在 液体YPD培养基中稳定期的培养物来进行。将这些培养物涂布于YPD培养基中，两天后挑 选集落并在不含尿嘧啶和色氨酸的YPD和SD中重复；选择那些能在YPD中生长、但是不能 在SD-URA-TRP中生长的克隆，将它们的耐受性和原始的含有质粒的菌株相比较。最后确认 时，从能够通过上述控制的克隆中收集质粒，转化进JM164菌株中，并再次选择那些能提供 耐受性的克隆。获得的结果总结于表1中表 1 将再次证实的阳性克隆测序，它们编码三个不同的基因，命名为Xerol至Xero3。 Xero2编码2类血红蛋白。与其它植物2类血红蛋白的序列比对显示于图1中。实施例4 :Xero2在酵母中提供了对渗透胁迫以及对高温胁迫的耐受性将系列稀释的JM164 pYPGEXero2和JM164 pYPGE (对照)涂布于含有1. 7M山梨 糖醇的YPD培养基上，并在2和4天后测试渗透耐受性。具有Xero2的酵母克隆具有强烈的山梨糖醇耐受性表型，该表型是可再现的山 梨糖醇浓度为1. 7M时，对照酵母细胞根本不生长，而超表达Xero2的酵母细胞确实能生长 (图 2)。强烈表型的确定基于点滴测试实验。制得饱和培养物的数个稀释度(1 10、 1 IOOU 1000)，将它们生长于选择培养基(含有1.7M山梨糖醇的YPD)上。“强烈表 型”是在所有测试的稀释度中均能够良好生长的那些克隆。“非强烈表型”意思是没有在所 有稀释度中均生长的克隆。表达空质粒的对照细胞在选择培养基上根本不生长。用相同的方式，将JM164 pYPGEXER02和JM164 pYPGE涂布于YPD培养基上并在 37°C培养2和3天。JM164 pYPGEXER02克隆对升高的温度显示出的耐受性比野生型高(图 2)。还试验了对其它毒性化合物如锂、钠、过氧化氢、甲萘醌和叔_ 丁基过氧化氢 (tBOOH)的耐受性，但是没有任何显著结果。实施例5 =DNA印迹分析揭示了甜菜中有多个同工型为了证实BvXero2在甜菜基因组中的存在和估算该植物物种中编码血红蛋白 的基因的数量，进行了 DNA印迹分析。从3周大的甜菜叶子中制得基因组DNA(Rogers SO 禾口 Bendich AJ, Extraction of totalcellular DNA from plants, algae and fungi(Eds)Plant molecularbiology manual, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Netherlands, 1994)。用 EcoRI、HindIII 或 BamHI 消化 5 μ g DNA,在 0. 8%琼脂糖凝胶中 电泳，并印迹到尼龙滤膜(Hybond N+, AmershamLife Science)上。用32P-标记的探针杂 交该滤膜，所述探针对应于pYPGEhemo上的878bp的EcoRl-Xhol消化片段，其跨越整个 cDNA。在高严格条件下进行杂交和洗涤(650C ) (Church GM和Gilbert W.，PNAS USA 81 1991-1995，1984)。所有电泳道中均存在数个杂交片段，并且与用来消化基因组DNA的限制 性内切酶无关，这表明在甜菜中存在至少两种可与整个cDNA杂交的BvXero2同工型(图3)。该878bp探针可以进一步用来检测和分离BvXer02的其它同工型。实施例6 在甜菜中通过NaCl和ABA诱导BvXero2为了证实BvXero2参与甜菜植物对盐胁迫的响应，使用RNA印迹分析来分析因 暴露于NaCl不同时间产生响应而引起的BvXero2 mRNA累积。从对照中以及从250mM Na+或100 μ M ABA处理过的甜菜叶中分离总RNA,如Davis等所述的(Basic methods in MolecularBiology. Elsevier. Amsterdam pp. 143-1461986)。将 30 μ g 总 RNA 在含有 2. 2% 甲醛的琼脂糖凝胶上分离，并印迹到尼龙滤膜(HybondN，Amersham Life Science)上。 使用上述的探针进行杂交。BvXero2特异性探针显示了只有一个条带对应于BvXero2 cDNA的大小(0. 45kb)。 在65°C，用4XSSC缓冲液(0.6M NaCl, 0. 06M柠檬酸三钠，用HCl调节至pH = 7)和0.1% SDS将滤膜洗涤两次5分钟，并用0.4XSSC、0. SDS洗涤两次5分钟。用含有拟南芥 α 3-微管蛋白基因的 1. 9 EcoRI 片段(Ludwig 等，Characterization of the α -tubulin gene family of Arabidopsis thaliana PNAS USA84 :5833_5837 1987)再杂交该相同的 滤膜。如图4所示，BvXero2 mRNA随着NaCl处理的时间而累积，并在8小时时达到最大。 和对照植物相比提高约10倍。在NaCl诱导后至少直至24小时还维持该高含量。值得一 提的是也从经NaCl处理24小时后的植物中获得了用于寻找涉及胁迫耐受性的基因的甜菜 cDNA文库。还观察到了 ABA处理3小时后BvXero2的诱导(图5)。甚至在可能是由于时 间或光诱导引起的背景含量巨大改变的情况下还观察到了这种提高。对照泳道在三小时时 提高约2倍，但是6小时后BvXer02几乎消失，而经ABA处理过的泳道仍然显示出显著的信 号。实施例7 用AtHb2 (CDS2591)转化拟南芥CDS2591 的克隆使用拟南芥幼苗cDNA文库(Invitrogen，Paisley, UK)作为模板，通过PCR扩增 ⑶S2591的核酸。将从幼苗提取的RNA逆转录后，将cDNA克隆进pCMV Sport 6. O中。该 文库平均插入物的大小为1.5kb，克隆的原始数量为1.59X 107cfu。原始滴度被测定为 9. 6 X 105CfU/ml，第一次扩增后变为6 X 10ncfu/ml。利用质粒提取后，将200ng模板用于 50 μ 1 PCR混合物中。利用包括用于Gateway重组的AttB位点的引物prm6122 (SEQ ID NO 8)和prm5458(SEQ IN NO 7)进行PCR扩增。使用Hifi Taq DNA聚合酶在标准条件下进 行PCR。还使用标准方法扩增并纯化了 503bp的PCR片段。然后进行Gateway方法的第一 步，即BP反应，在该过程中PCR片段在体内和pDONR质粒重组，从而产生“进入克隆”(根据 Gateway术语)p55 (图6)。质粒pD0NR201从Invitrogen作为Ga t eway 技术的一部分购 得。用p35 S-CDS2591盒转化的载体构建随后将进入克隆p56与pl978(用于Arabidopsis转化的目标载体)一起用于LR 反应中。该载体在T-DNA边界中含有如下成分作为功能性元件植物选择基因；GFP表达盒； 和Gateway盒，旨在与已经克隆进进入克隆中的目的序列进行LR体内重组。用于组成型表 达的p35 S启动子定位于该Gateway盒的上游。LR重组步骤后，可将所得到的表达载体p56(图7)转化进土壤杆菌 (Agrobacterium)菌株 C58C1RIF PMP90 中，并随后转化进 Arabidopsis 植物中。
用p35 S-CDS2591 转化 Arabidopsis亲本棺物的播种和牛长对于亲本植物，将约12mg野生型拟南芥(生态型，哥伦比亚)种子悬浮于27. 5ml 0.2%琼脂溶液中。将种子在4°C培养2至3天，然后播种。在以下标准条件下使植物发芽 白天22°C，晚上18°C，65-70%相对湿度，12小时光周期，每2或3天用水灌溉15分钟。然 后将产生的幼苗转移至直径为5. 5cm的罐中，其中含有1比3比例的沙子和泥炭。然后在 上述相同的标准条件下使植物进一步生长。土壤杆菌的牛长条件和制备将带有辅助质粒pMP90的土壤杆菌菌株C58C1RIF在含有Iml无抗生素LB (Luria Broth)的50ml塑料管中培养，该质粒含有载体p56。将培养物在28°C振荡8_9h。此后，将 IOml无抗生素的LB加入塑料管中，然后在28°C振荡过夜。在约2. 0的光密度(0D_)时， 将40ml 10%蔗糖和0. 05% Silwet L-77 (聚环氧烷修饰的七甲基三硅氧烷(84% )和烯丙 氧基聚乙二醇甲基醚(16%)的混合物，OSI Specialties Inc)加入培养物中。用⑶7659 标记如此获得的土壤杆菌培养物，用于转化已生长的植物。当每个母本植物具有一个7-lOcm高的花序时，将花序倒置于土壤杆菌培养物中， 并柔和搅拌2-3秒中。每个转化使用2株植物。然后将植物恢复至如上所述的正常生长条 件。种子收集在将花浸入土壤杆菌培养物中5周后，停止浇灌植物。用20小时的光周期在25°C 培养植物。一周后，采收种子并放入种子干燥机中一周。然后清洁种子并收集于15ml塑料 管中。将种子存储于4°C直至进一步的处理。在盐胁迫下转基因拟南芥p35 S-⑶S2591植物的生长性能从首次转化的拟南芥植物中收集种子(在此称为TO种子)，用于评价在胁迫下的 生长性能。将转基因Tl植物与相同母本植物的分离非转基因零合植物(在此命名为对照植 物)相比较。掺入植物中的视觉标记用来鉴别转基因种子和对照种子。为此目的，在蓝光下 检测干种子，以确定转基因种子的存在。将80粒明亮荧光种子(表达了转基因)和相同量 的非荧光种子(没有表达转基因)在4°C浸入0.2%琼脂中，并使其在沙子和泥炭(1 3) 的土壤混合物中发芽。15个浸液后天数(days post imbibtion, dpi)时，选择一组14株 单独的转基因植物和12株对照植物，所有都处于相似的发育阶段，用于进一步分析，并转 栽至直径为6. 5cm罐中的土壤中。将植物生长于温室条件下(白天22°C，晚上18°C，60% 相对湿度，20小时光周期，用水地下灌溉)。在幼苗21dpi时，通过浇灌150mM NaCl，在1周 时间段内应用3次盐处理，然后使用自来水浇灌使植物恢复。使用数码相机从不同角度每 周拍摄植物，拍摄4周。分析图像(记录每张照片对应于植物组织的像素数量)，并使用合 适的软件来测量植物大小(植物面积和高度)。MM应用的盐胁迫影响了转基因植物和非转基因对照植物两者的生长。转基因植物显 示出更好地从胁迫下恢复生长，这可以从图8中看出。转基因植物显示出较高的生长速度， 因此，从胁迫处理中恢复四周后，转基因植物的花结比对照植物的大20% (图2)。然而，最 强烈的效果是在花序结构发育中观察到的。非转基因植物的花序结构差，分枝非常少，而转
27基因植物能够进一步发育它们的花序，产生更多分枝、更多花、更多长角果并且可能更多种 子(图9)。两个参数反映了花序的发育，1)花序高度，即花结水平向上至检测花序结构最 高部分2条水平线之间的距离，和2)花序面积，即数码图像中高于花结水平上的所有植物 结构的表面。从这两个参数获得的值反映出转基因植物中花序结构发育得更好，并揭示了 花序高度有超过于40%的差异，总花序面积有超过60%的差异(表2)。表2盐胁迫条件下转基因植物的生长性能以任意单位表示花结面积、花序高度和花序面积。以百分比表示的数值指的是转 基因植物(TR)相对于分离的非转基因(NT)植物之间的差异，将非转基因植物的值作为 100。在45dpi时进行测量。T-检验项显示了使用Student’ s t_检验获得的ρ-值。 实施例8 用植物非共生血红蛋白编码序列转化的稻植株的生长性能(i)血红蛋白基因的克隆有关拟南芥血红蛋白基因2(AtHB2，⑶S2591)和甜菜血红蛋白基因⑶S2767的分 离描述于之前的实施例中。对于CDS2767(Xero2)，将含有相应核酸序列的质粒(如前所述)用作PCR的底物。 扩增中使用针对每个血红蛋白基因的特异性引物，它们被详细列于表3中。除了特异性序 列，正向引物还含有gatewayAttBl位点，反向引物还含有Gateway重组系统的AttB2位点。表3引物列表 使用Hifi Taq DNA聚合酶在标准条件下进行PCR。使用标准方法分离和纯化对 应于⑶S的特异性PCR片段(表4)。然后进行Gateway方法的第一步，即BP反应，在该过 程中PCR片段在体内与PD0NR201质粒重组，产生“进入克隆”(该命名根据的是Gateway术 语)。所用的基因及其对应的进入克隆列于表4中。表4克隆进稻的血红蛋白基因列表 因此，每个进入克隆载体在AttLl和AttL2位点内含有相应的⑶S，用于在 PD0NR201主链内进行Gateway 克隆。载体还含有细菌卡那霉素抗性盒和细菌复制起点。(ii)用于稻转化的载体构建列于表4中的进入克隆随后与用于稻转化的目的载体(destination vector) (gateway命名法)一起用于LR反应中。该载体在T-DNA边界内含有如下成分作为功能性 元件植物选择标记；可筛选标记和旨在与已克隆到进入克隆内的目的序列进行LR体内重 组的Gateway盒。将植物启动子定位于该Gateway盒的上游。所用目的载体的描述列于表 5中。表5目的载体 LR重组步骤后，可将所得到的表达载体转化进土壤杆菌菌株LBA4404中，并随后 转化进稻植物中，因为表述载体是二元载体，可以用于在稻中在特定启动子控制下表达不 同的⑶S。这些载体含有源自Ti质粒的T-DNA，由左边界(LB重复，LB Ti C58)和右边界 (RB重复，RB Ti C58)所确定。从左边界至右边界，该T-DNA含有用于选择转化植物的选 择标记盒；用于可视化筛选转化植物的可筛选标记盒；感兴趣的特定植物启动子-CDS与玉米蛋白和rbcs-δ GA双终止子盒。该载体还含有来自pBR322的用于细菌复制的复制起点 以及用于使用壮观霉素和链霉素进行细菌选择的选择标记(Spe/SmeR)。所产生的表达载体 和相应的目的基因描述于表6中。将所有构建体(1至8)设计成用于超表达。表6植物转化载体 (iii)用植物转化载体转化稻将表6中所列的T-DNA转化进稻中。将水稻(oryza sativa)日本栽培品种Nipponbare的成熟干种子脱壳。将种子在 70%乙醇中孵育1分钟，接着在0. 2% HgCl2中孵育30分钟，并用无菌蒸馏水洗涤6次15 分钟，由此进行灭菌。然后将无菌种子在含有2，4-D的培养基(愈伤组织培养基)上发芽。 黑暗培养4周后，切下胚胎发生的源自盾盖的愈伤组织，并在相同培养基上繁殖。两周后， 在相同培养基上传代培养另外2周来增殖或繁殖愈伤组织。在共培养3天前，在新鲜培养 基上传代培养胚胎发生的愈伤组织片来促进细胞分裂活性。带有二元载体的土壤杆菌菌株 LBA4404(构建体1至8，表6)用于共培养。将土壤杆菌菌株在含有合适抗生素的AB培养 基上28°C培养3天。然后收集细菌并以0D_约为1悬浮于液体共培养基中。将悬浮液转 移至皮氏培养皿中，并将愈伤组织浸入悬浮液中15分钟。接着，将愈伤组织在滤纸上吸干， 转移至固体共培养基上，并在黑暗中25°C培养3天。此后，将共培养的愈伤组织在含有2， 4-D的培养基上黑暗中28°C生长4周，培养基中存在合适浓度的选择剂。在该时间段中，快 速生长的抗性愈伤组织岛得到发育。将该材料转移至再生培养基中并在光下培养时，胚胎 生成性潜能得到释放，并在接下来的四至五周内发芽。切下愈伤组织上的芽并在含有植物 生长素的培养基上培养2至3周，并从该培养基上转移至土壤中。将硬化的芽在温室中高 湿度下和短期内生长。最后，在移植三至五月后收集种子。该方法以高于50%的比例产生 了单基因座转化子(Aldemita 和 Hodges，Plantal99，612-617，1996 ；Chan 等，Plant Mol. Biol. 22 (3)，491-506，1993 ；Hiei 等，Plant J. 6 (2)，271-282，1994)。(iv)转基因稻植物的评价产生了约15至20株独立的TO稻转化子。将首次转化子从组织培养室转移至温 室中，以便生长并采收Tl种子。通常，保留5-10个事件，其中Tl后代中存在/缺失转基因 的分离比为3 1。对于这些事件中的每个，通过监控可筛选标记的表达来选择约10个含 有转基因(杂合体和纯合体)的Tl幼苗和约10个缺失转基因(零合子)的Tl幼苗。棺物牛长测量
将所选择的Tl植物(约10株具有转基因和约10株不具有转基因)转移至温室。 每个植物接受独特的条形码标记，清楚地将表型数据和对应的植物相联系。使所选择的 Tl植物在以下环境条件下生长于直径IOcm罐中的土壤上11. 5小时的光周期，日光强度 30，OOOlux或更强，日间温度28°C或更高，夜间温度22°C，相对湿度60-70%。将转基因植物 和对应的零合子以随机位置并排种植。从播种的阶段至成熟阶段，每株植物数次通过数字 成像室并成像。在每个时间点，对每株植物从至少6个不同角度取其数字图像(2048X1536 像素，16百万色)。并且，对约10株所选择的带有转基因的转基因植物中的每株照相，还给 所选择的不含有转基因的植物中的每株照相。以下所述参数中的一个或多个可以从所有植 物的所有数字图像中使用图像分析软件以自动化方式导出。(a)地面上棺物的面积通过计算和背景相区别的地面上植物部分的像素总量来测定植物的地面上面积。 对在相同时间点从不同角度拍摄的照片取平均值，并通过校准转化成以mm2表示的物理表 面值。实验显示了该方式测量的地面上植物面积和地面上植物部分的生物量相关。(b)棺物高度通过测量罐的上端边缘和对应于地面上植物部分的最上端像素的水平线之间的 距离来测定植物高度。对在相同时间点以不同角度摄取的照片取平均值，并通过校准而转 化成以mm表示的物理距离。实验显示出该方式测量的植物高度和用尺子人工测量的植物 高度相关。(C)分蘖的数量在采收植物时对主要分蘖进行人工计数。在高于罐边缘3cm处切断分蘖。然后在 切割面计数。一起在同一叶鞘中的分蘖作为一个分蘖计数。(d)主圆锥花序的数量对最高的圆锥花序和垂直比对时与最高圆锥花序重叠的全部圆锥花序进行人工 计数，并视作为主圆锥花序。(e)次圆锥花序的数量对在采收主圆锥花序后植物上保留的圆锥花序的数量进行计数，并视作为次圆锥 花序。(f)生长曲线对每周测量的植物面积建立模型，获得每个植物的生长曲线，以植物面积(mm2)随 着时间(天)的值来作图。从该生长曲线可以计算以下的参数(r)A42A42是如生长曲线模型所预测的播种42天后的植物面积。(h) TmidTmid是植物生长并达到50%最大植物面积时所需的时间。Tmid是从生长曲线模 型预测出来的。⑴ T90T90是植物生长并达到90%最大植物面积时所需的时间。T90是从生长曲线模型 预测出来的。种子相关参数的测量倌
收集成熟的主圆锥花序、装袋、作条形码标记，然后在37°C烤炉中干燥3天。然后 将圆锥花序脱粒并收集和计数所有种子。使用鼓风装置将空的外壳与饱满外壳分开。丢弃 空的外壳，然后再次计数剩余的部分。在分析天平上对饱满外壳称重。该方法得到了一系 列如下所述的种子相关参数。(a)每株棺物的种子总量通过计数从植物采收的外壳数量来测量每株植株的种子总数。(b)饱滿种子的数量通过对分离步骤后剩余的饱满外壳计数来测定饱满种子的数量。(C)每株棺物的种子总产量通过将从植物采收的饱满外壳称重来测量种子总产量。(d)棺物的收获指数本发明的收获指数(harvest index)定义为种子总产量和地面上面积(mm2)之间 的比例，再乘以倍数106。(e)棺物的千仁重量(Thousand Kernel ffeight, TKff)该参数是从计数的饱满种子的数量和它们的总重外推出来的。(f)总面积 Emergence Prop.是指植物达到其最大总面积30%时的时间。(r)总面积循环时间是指当植物达到其最大总面积90%时的时间。(ν)统计分析t_检验和F-检验利用双因子ANOVA (变量分析)作统计模型，用于植物表型特征的全面评价。对在 本发明的基因转化的所有事件的所有植物上测量的所有参数都进行F检验。进行F检验来 检测该基因对所有转化事件的效果，以及验证基因的整体效果，在此命名为“总体基因效果 (globalgene effect)”。如果F检验的值显示出数据比较显著，则可确定存在“基因”效果， 意味着不仅仅该基因的存在或位置导致表型的差异。对于F检验，真实总体基因效果的显 著性阈值设定为5%概率水平。为了检测事件中基因的效果，即品系特异性效果，在每个事件中进行t-检验，其 中使用来自转基因植物和相应的无效植物(ruillplant)的数据。“无效植物”或“无效分离” 是指用和转基因植物相同的方式处理的、但是其中转基因已经发生分离的植物。无效植物 还可以描述为纯合阴性转化子。t-检验显著性的阈值设定为10%概率水平。在5个转化 事件的一个群体中，一些事件可以低于或高于该t-检验阈值。这是基于如下假设即基因 可能仅在基因组中特定位置具有效果，且该位置依赖性效果的发生并非不同寻常。在此还 将这种基因效果命名为“基因的品系效果”。通过比较t值和t分布或者通过比较F值和F分布来获得P值。该P值表示无效 假设(无效假设是“不存在转基因效果”)正确的概率。(vi)特定生长条件如之前所述，植物的生长在温室中进行，可在最佳条件或次佳(sub-optimal)条 件下。在最佳条件下，用含有N P K 20 20 20的最终电导性EC= LlmS的营养 液定期浇灌植物。
使用两种次佳条件1-盐胁迫用NaCl补充营养液至15mM。从播种后3周直至采收时将盐溶液应用于植物，2-干旱胁迫使植物生长，并以对生长最佳的频率浇灌，使得没有灌溉过量或不足的信号可见， 直至抽穗期。当针对特定构建体的对照非转基因植物中的大约50%达到了抽穗期末，并且 在分蘖阶段开始形成圆锥花序时(V9阶段的末期至RO阶段，如Coimce等2000定义的)，对 属于特定构建体的所有植物(转基因和非转基因)进行浇灌，直至罐中含有60%RWC(相对 水含量)，然后停止浇灌水，直至RWC跌落至20% (大多数对照植物显示卷曲指数(rolling index)为4)。然后恢复浇灌到正常的最佳频率。从农艺学观点看，在温室中测量的生物量或种子参数显示出值提高的转基因植物 选择用来在田间条件下进一步测试。
权利要求
改变选自下述中的一种或多种植物特性的方法植物提高的产量、提高的生物量、改变的结构或改变的细胞分裂，该方法包括在植物中提高编码植物2类非共生血红蛋白的核酸序列的表达。
2.权利要求1的方法，其中所述提高的产量包括提高的种子产量。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述编码植物2类非共生血红蛋白的核酸是来自 双子叶植物的分离的核酸，优选来自十字花科，更优选来自拟南芥，最优选该分离的核酸编 码根据SEQ ID NO 4的蛋白质，或是SEQ ID NO 3所示的。
4.提高植物的非生物胁迫耐受性的方法，包括在植物中提高编码植物2类非共生血红 蛋白的核酸序列的表达。
5.权利要求4的方法，其中所述非生物胁迫是渗透胁迫。
6.提高植物的高温胁迫耐受性的方法，包括在植物中提高编码植物血红蛋白、优选非 共生血红蛋白、更优选2类非共生血红蛋白的核酸序列的表达。
7.权利要求4至6中任一项的方法，其中所述编码植物2类非共生血红蛋白的核酸序 列是从双子叶植物、优选从十字花科、更优选从甜菜中分离的，最优选该分离的核酸编码根 据SEQ ID NO 2的蛋白质，或是SEQ ID NO 1所示的。
8.通过权利要求1至7中任一项的方法可获得的植物。
9.编码植物2类非共生血红蛋白的分离的核酸，其选自(i)包括根据SEQ ID NO 1的序列或其互补序列的核酸序列；( )编码蛋白质的核酸序列，该蛋白质具有与SEQ ID NO 2所示氨基酸序列至少(以 递增次序的优选)79 %、80 %、85 %、90 %、95 %、96 %、97 %、98 %或99 %相同的氨基酸序 列；(iii)编码包含SEQID NO 2所示氨基酸序列的蛋白质的核酸序列；(iv)根据(i)至(iii)中任一项的、由于遗传密码而为简并性的核酸序列；(ν)作为(i)至(iv)中任一核酸的剪接变体的核酸序列；(vi)由于编码SEQID NO 2所示的等位基因或(i)至(ν)中所定义的序列之间的差异 而有不同的核酸序列；(vii)编码由(i)至(vi)中任一DNA序列所编码的蛋白质的免疫学活性和/或功能片 段的核酸序列；和(viii)在严格条件下和(i)至(vii)中所定义的任一序列杂交的核酸序列，前提条件是(i)至(viii)中没有一个包括GenBank登录号BE 590299或BQ 586966 所示的序列。
10.分离的植物2类非共生血红蛋白，其中包括选自以下之一的多肽(i)SEQID NO 2所示的多肽；(ii)具有与SEQID NO 2所示氨基酸序列至少(以递增次序优选)79%、80%、85%、 90%、95%、96%、97%、98%和99%相同的氨基酸序列的多肽；(iii)由权利要求9的核酸编码的多肽；(iv)(i)至(iii)中任一定义的蛋白质的同系物、衍生物、免疫学活性和/或功能性片段。
11.一种核酸构建体，其中包含(i)根据权利要求9的分离的核酸序列；( )控制(i)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；以及可选地(iii)转录终止子序列。
12.权利要求11的构建体，其中所述的分离的核酸序列如SEQIDNO 1所示。
13.含有根据权利要求9的核酸或者根据权利要求11或12的构建体的宿主细胞，其中 所述宿主细胞是细菌、酵母、真菌、植物或动物细胞。
14.产生具有改变的生长特性的转基因植物的方法，包括以下步骤(i)将权利要求9的核酸序列引入植物或植物细胞中；( )在促进再生和/或成熟植物生长的条件下培养所述植物或植物细胞。
15.具有提高的产量、提高的生物量、提高的细胞分裂、提高的渗透胁迫耐受性和改变 的结构中至少一种特征的植物细胞、植物部分或植物，其中所述植物细胞、植物部分或植物 中编码植物2类非共生血红蛋白的核酸序列的表达提高。
16.具有提高的高温胁迫耐受性的植物细胞、植物部分或植物，其中所述植物细胞、植 物部分或植物中编码植物血红蛋白的核酸序列的表达提高。
17.根据权利要求15或16的转基因植物，其中所述植物是作物，其选自大豆、向日葵、 canola、苜蓿、油籽油菜或棉花，优选其中所述植物是单子叶植物，如甘蔗，最优选谷类，如 稻、玉米、小麦、小米、大麦、高粱、燕麦。
18.根据权利要求15至17中任一项的植物的转基因后代、转基因可采收部分或繁殖 体，其中所述可采收部分选自种子、叶、花、果实、茎培养物、根茎、块茎和鳞茎。
19.编码植物2类非共生血红蛋白的核酸序列用于提高植物产量、生物量或细胞分裂 中的一种或多种和/或改变植物结构的用途。
20.权利要求19的用途，其中所述提高的产量包括种子产量。
21.根据权利要求19或20的用途，其中所述编码植物2类非共生血红蛋白的核酸序列 是从双子叶植物、优选从十字花科、更优选从拟南芥中分离的，最优选所述分离的核酸是如 SEQ ID NO 3所示的。
22.编码植物2类非共生血红蛋白的核酸序列用于提高植物的非生物胁迫耐受性的用途。
23.权利要求22的用途，其中所述的非生物胁迫是渗透胁迫。
24.权利要求22或23的用途，其中所述编码植物2类非共生血红蛋白的核酸序列是 从双子叶植物、优选从十字花科、更优选从甜菜中分离的，最优选该分离的核酸是如SEQ ID NO 1所示的。
25.编码植物血红蛋白的核酸序列用于提高植物的高温耐受性的用途，优选所述的植 物血红蛋白是非共生血红蛋白，更优选2类非共生血红蛋白。
26.权利要求25的用途，其中所述编码植物2类非共生血红蛋白的核酸序列是从双子 叶植物、优选从十字花科、更优选从甜菜中分离的，最优选该分离的核酸是如SEQ ID NO 1 所示的。
27.血红蛋白或编码血红蛋白的核酸序列用于改变酵母的胁迫耐受性的用途。
28.根据权利要求9的核酸序列和/或根据权利要求10的氨基酸序列在治疗性或诊断 性组合物中的用途。
29.根据权利要求9的核酸序列和/或根据权利要求10的氨基酸序列在调控O2或其 它化合物的水平中的用途。
30.根据权利要求9的核酸序列和/或根据权利要求10的氨基酸序列在改变信号转导 途径中的用途。
全文摘要
本发明总体涉及改善在正常和在胁迫条件下、更特别在渗透胁迫下和/或极端温度下植物生长的方法，该方法包括改变植物中植物血红蛋白基因表达和/或改变植物血红蛋白的含量。本发明进一步涉及提高植物产量的方法，包括改变植物中植物基因表达和/或改变植物血红蛋白含量。本发明还涉及编码赋予该改变生长和胁迫耐受性的血红蛋白的核酸。
文档编号C12N15/82GK101880670SQ20101016298
公开日2010年11月10日 申请日期2004年4月1日 优先权日2003年4月1日
发明者A·I·桑莫里内罗, J·M·米莱萨洛尔特, R·塞拉诺萨洛姆 申请人:作物培植股份有限公司