专利名称：老年黄斑变性疾病的检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测老年黄斑变性疾病的试剂盒，具体地说检测与老年黄斑变性 疾病相关CFH基因变异的试剂盒。
背景技术：
黄斑变性疾病被认为是一类以进行性中心视力下降及黄斑部视网膜色素上皮变 性为特征的异质性疾病，是重要的致盲性眼病。黄斑变性包括老年黄斑变性、黄斑营养不良 (stargart病、best病、sorsby目艮底营养不良等)。老年黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD)现已成为老年人最主要的致盲性眼病之一，全世界患病人数1000万， 我国60-69岁人群AMD患病率为7. 77%，70岁以上可达15. 33%。目前对于AMD还无有效 的治疗方法，其主要原因就是发病机制尚不清楚。近年来研究认为，黄斑变性是一组异质性疾病，遗传因素在其发病机制中起着重 要作用。一些与老年黄斑变性(AMD)有相似临床和组织病理表现的其他类型黄斑变性的研 究已取得重要进展，比如近年研究发现隐性Stargardt黄斑变性在ABCR基因上有变异； 显性Stargardt黄斑变性(STCD3)在EL0VL4基因上有变异；Best黄斑营养不良(BMD)在 VMD2基因上有变异；Sorsby眼底营养不良患者在TIMP3基因存在点变异，还有黄斑蝶样萎 缩等与Peripherin/RDS基因变异有关。老年性黄斑变性是导致发展中国家不可逆性视力丧失的主要原因，很多研究显示 其具有显著的遗传倾向。目前针对不同人群和种族的黄斑变性疾病的研究，正成为国际研 究热点之一。国内单基因性黄斑变性疾病及疾病人群和种族相匹配对照人群的基因分析 (多基因疾病分析)工作尚未真正系统性开展，亦没有相关的基因谱分析。AMD的前期研究证实补体旁路途径成员的编码基因，包括补体因子H(CFH)以及因 子B/C2和个体患病风险有关，尤其是位于染色体lq31上的(FH被认为是AMD主要的风险 因子。其他一些关联分析还显示染色体10q26上存在另一个AMD的风险位点。然而其确切 致病基因尚不清楚。老年黄斑变性是一种和年龄增长有关的多因素复合作用的眼底病。多发生在45 岁以上，年龄越大，患病率越高。是全球成人致盲的首要疾病之一。老年性黄斑变性有时发 展很慢，使患者不易察觉，有时却进展很快，迅速剥夺患者视物能力，因而其早期发现和预 防显得至关重要。本病真正病因不明，系多因素疾病，影响因素除年龄外，还有人种、性别、代谢等， 遗传因素至关重要。临床上分为萎缩型(干性型)和渗出型(湿性型)。干性者，在眼底 可见玻璃膜疣，逐步引起黄斑区变薄，从而影响功能。目前尚无特别有效的方法治疗。湿性 者，多引起视力的严重障碍，其视力破坏的原因主要是异常的新生血管在视网膜下生长，引 起视网膜出血、水肿及视网膜组织的破坏，最终导致疤痕形成，从而引起视力的丧失。湿性 AMD —旦发病，病程迅速，常规治疗的效果不佳，难以大幅度地恢复其已经丧失的视功能。因 此，早期诊断发现，及早干预，能更好的延缓病程，减少病人的视力丧失，提高生活质量。
目前的AMD诊断于依赖1、多于50岁以上老年人发病，年龄越大，发病率越高；2、 双眼先后发生视物变形、视力减退或明显视力障碍；3、眼底有较明显的玻璃膜疣及两型各 自的表现；4、眼底荧光血管造影。但是，在病人发病初期缺乏监测诊断指标，利用本研究的 遗传标记物，可以早期筛选发现AMD高危人群，并实施早期检测和预防，减少其视力损害。
发明内容
本发明的目的在于提供检测老年黄斑变性疾病的试剂盒，该试剂盒通过检测来源 于待测个体的样本中是否存在CFH基因变异(单核苷酸多态性SNPrsl061170、rsl329428、 rs800292、rs3753394)从而在早期监测或诊断老年黄斑变性疾病的发生，进而为临床诊断 和治疗提供参考。本发明针对lq32染色体(FH基因的易感位点进行了 AMD和正常对照的基因型分 析，发现位于CFH基因之间的多个SNP变异是导致中国人AMD的重要病因，这些变异SNP 包括位于9号外显子的rsl061170(C/T)、15号内含子的rsl329428 (G/A)、2号外显子的 rs800292 (G/A)、5、非编码区的rs3753394 (T/C)，本发明在全国首次发现了这些变异和中 国人AMD的直接关联性。根据本发明的一个方面，提供用于检测老年黄斑变性疾病的试剂盒，试剂盒的 检测原理为检测与老年黄斑变性疾病密切相关的(FH基因变异是否存在，试剂盒中可以 包括用于检测与中国人AMD病变相关的CFH基因SNP位点包括rsl061170、rsl329428、 rs800292、rs3753394的试剂。首先对获得的样本提取DNA并针对CFH基因9号外显子的 rsl061170 (C/T)、15 号内含子的 rsl329428 (G/A)、2 号外显子的 rs800292 (G/A)、5~ 非编码 区的rs3753394(T/C)位点进行扩增，检测方法可以参考本领域技术人员熟知的检测基因 点突变位点的方法，例如直接测序法或使用限制性片段长度多态方法或单碱基引物延伸法 或Taqman法或芯片杂交等，判断这些SNP位点的等位基因型。根据本发明的另一方面，还提供(FH基因9号外显子的rsl061170变异、15号内含 子的rsl329428变异、2号外显子的rs800292变异和/或5、非编码区的rs3753394变异在 制备用于AMD筛选诊断试剂中的应用。具体地，所述筛选诊断试剂包括检测(FH基因9号外显子的rsl061170的T — C变 异、15号内含子的rsl329428的A — G变异、2号外显子的rs800292的A — G变异和/或
非编码区的rs3753394的C — T变异的试剂；以及任选的用于扩增包含CFH基因9号外 显子的rsl061170、15号内含子的rsl329428、2号外显子的rs800292和/或非编码区 的rs3753394基因片段的试剂。更加具体地，所述检测(FH基因9号外显子的rsl061170的T — C变异、15号内含 子的rsl329428的A — G变异、2号外显子的rs800292的A — G变异和/或5、非编码区的 rs3753394的C — T变异的试剂为测序用试剂、限制性片段长度多态方法用试剂、Snapshot 试剂以及限制性内切酶酶切法、变性高效液相色谱法(DHPLC法)、Taqman实时荧光定量PCR 法、特异引物PCR法(AS0)或基于等位基因特异性寡核苷酸杂交反应原理的芯片检测方法 用试剂。本发明提供了检测老年黄斑变性疾病的试剂盒，可用于早期监控和检测AMD高危 人群，实施早期预防和治疗，减少其视力损害。本发明试剂盒以(FH基因中多个与AMD相关联的SNP突变为目标进行协同检测，更可提高检测的准确性。
图
图 1 是 Snapshot 检测 SNP rsl061170/rsl329428/rs800292/rs3753394 的基因型
发明的具体实施方式
实施例1血样收集及标本处理
选取240例中国人老年性黄斑变性(AMD)患者以及250例对照者。患者为临床确 诊的AMD，其中1M例湿性AMD患者，迎例干性AMD患者，对照是符合AMD患者年龄段的大 于或等于60岁、非玻璃疣和视网膜色素改变的人群。对所有参加者详细调查其病史以及家族史，并对其进行体格检查和详细的眼科专 科检查。在签署知情同意书以后每人采集EDTA抗凝血样5 10ml。酚-氯仿法提取基因 组 DNA。实施例2包含 rsl061170、rsl329428、rs800292、rs3753394单核苷酸多态性DNA 片段的PCR扩增和基因型分析1、提取AMD患者和对照组的血液基因组DNA。2、PCR 扩增基因组包含目的序列(rsl061170、rsl329428、rs800292、rs3753394) 的基因组DNA片段引物序列rsl061170 正向5，-TGGTCCTTAGGAAAATGT-3，反向5，-GCTTTTGGAAGAGCGTAG-3，rs 1329428 正向5，-GGCTCACCCCAGTGATACAT-3，反向5，-AACAGGGGAGCTGCATTTTA-3，rs800292 正向5，-CCATTCTCCCTTCCTGCATA-3，；反向5，-GATTGCAATGAACTTCCTCCA-3，rs3753394 正向5，-CCCCAAATTCATCAAGCACT-3，；反向5，-TAGGGAAATTCTCCGTTGGA-3，反应条件rsl061170 95 °C 3minutes, (94 °C 30seconds, 50 72°C 45seconds)氺35cycles 72°C lOminutes 4°C foreverrsl329428 95 °C 3minutes, (94 °C 30seconds, 51 72°C 45seconds)氺35cycles 72°C lOminutes 4°C foreverrs800292 95 °C 3minutes, (94 °C 30seconds, 53 72°C 45seconds)氺35cycles 72°C lOminutes 4°C foreverrs3753394 95 °C 3minutes, (94 °C 30seconds, 53 72°C 45seconds)氺35cycles 72°C lOminutes 4°C forever3、样本的基因型分析(一 )单碱基引物延伸法基因分型(SnapShot)1.纯化PCR反应产物
°C 30seconds,
°C 30seconds,
°C 30seconds,
°C 30seconds,
反应体系
PCR产物总体积
Exol 酶
SAP buffer
ddH20
SAP
9u 1 0. In 1 0. In 1 0. 8u 1 2u 1
r Total 12u 注PCR产物总体积9 ill视PCR反应数量而定，N对引物的PCR，则每对引物获得 的产物加样为9 u 1/N。
反应条件:37°C lhour ； 75°C 15min 2.单碱基引物延伸 反应体系
纯化产物1 U 1
SNaPshot Multiplex 1u 1 SNaPshot primer0.2XN
DdH20补足 5 u 1
反应条件:96 V lmin
Total 1
25个循环
96°C 10 sec、 50°C 5 sec 60°C 30 sec
snpshot弓丨物
rs1329428 :TTTCATTCAG GGACTGTATT CTAAA(25bp) rsl061170 :ATTTT CCTTATTTGG AAAATGGATA TAATCAAAAT(35bp) rs800292 :ATGGATTA AGAGCAACCC ATTCTCCCTT CCTGCATACC ATTATTA (45bp) rs3753394:AATAGAC CCGAATAGAG TTTGAATAAT TGAAGGGTTT ATGAAATCCA GAGGATAT(55bp)
3.纯化反应物
反应体系0.7 ill SAP/well 反应条件:37°C lhour ； 75°C 15min
4.变性
反应体系
纯化产物
lii
反应条件95°C 5min ；迅速冰浴冷却
5. ABI3100上机读取基因型结果( 二 )核苷酸序列测定1、胶回收(1)将放有胶回收的管中加入 Binding Buffer30ulfangru 55°C孵育 7min。(待完全溶化)(2)胶溶化后，取出柱管，作好标记，把液体转入柱管中，lOOOOrpm/lmin离心，完 毕后倒掉上清液，再加入700ulSpw，静置2 3min，10000rpm/lmin离心，倒掉上清液。(3)重复上述2操作一次。(4)倒掉上清液后，把柱管lOOOrpm/lmin空转。(5)加入 15ulElution Buffer 到柱中央，静置 2 3min，10000rpm/lmin 离心。(6)重复上述操作(7)把洗脱下来的液体轻转至干净管中，作好标记，置于冰箱中。2、测序前扩增反应体系 反应条件 3、第二步纯化 4、上机测序混勻后lul/well，25ul 无水乙醇 /wel 避光保存 15min，4100rpm/30min 离心。尽 量吸干上清液，70%乙醇40ul/well，4100rpm/10min离心.。吸干上清液，室温避光保存 15min。加入 9ul/well，避光放置 lhour。(三)其他方法1、基于等位基因特异性寡核苷酸杂交反应原理的芯片检测流程DNA抽提-----DNA消化一一加接头一一扩增一一产物片段化一一生物
素标记芯片杂交一洗涤染色扫描数据分析
2、Tagman 方法流程序列比对----引物设计引物合成DNA抽提和定量一PCR—探 针杂交——扫描一一分析3、变性高效液相色谱(Denature HPLC)图 1 为 Snapshot 检测 SNP rsl061170、rsl329428、rs800292、rs3753394 的基因 型图，图中，rsl329428为杂合子A/G，rsl061170为杂合子C/T，rs800292为杂合子G/A， rs3753394 为杂合子 C/T。rsl329428 纯合子 GG，rsl061170 纯合子 CC，rs800292 纯合子 GG，rs3753394纯合子TT与患病风险正相关。实施例3CFH基因单核苷酸多态性与AMD的关联性分析结果采用卡方检验分析等位基因相关性，同时计算优势比和95%可信区间，评价风险 等位基因与患病风险关系(OR值表示)。表中带“*”碱基为风险基因。实施例4CFH基因单倍体型多态性与AMD的关联性分析结果利用软件HaploView对CFH基因单倍体多态性(rs3753394，rs800292, rsi061170and rsl329428)与AMD的关联性分析可以发现单倍体型CATA是一种保护型单
倍体型与AMD有密切关联(见下表)。从而可通过筛查试剂查出可能患AMD低风险个体。实施例5试剂盒本试剂盒用于1、AMD患者的早期诊断和分型参考；2、AMD易感人群的基因检测和 风险评估。[试剂] [操作步骤]rsl061170 ；sl329428 ；rs800292 ;rs3753394 的 PCR 扩增和基因型分析1.取样取患者全血(EDTA抗凝)1ml，提取AMD患者的血液基因组DNA。2. PCR 操作基因组 DNA lul+9ul PCR 混合液反应条件
rsl061170/rsl329428 95°C 3minutes, (94°C 30seconds, 50°C 30seconds, 72°C 45seconds)*35 cycles 72°C lOminutes 4°C foreverrs800292/rs3753394 95°C 3minutes, (94°C 30seconds, 53°C 30seconds, 72°C 45seconds)*35 cycles 72°C lOminutes 4°C forever3、PCR产物纯化反应体系 注PCR产物总体积视PCR产物浓度决定用量。反应条件 4、单碱基引物延伸反应体系 反应条件 snpshot 弓丨物rs1329428 :TTTCATTCAG GGACTGTATT CTAAA(25bp)rsl061170 :ATTTT CCTTATTTGG AAAATGGATA TAATCAAAAT(35bp)rs800292 :ATGGATTA AGAGCAACCC ATTCTCCCTT CCTGCATACC ATTATTA (45bp)rs3753394 :AATAGAC CCGAATAGAG TTTGAATAAT TGAAGGGTTT ATGAAATCCAGAGGATAT (55bp)5、纯化反应物反应体系0.7u 1 SAP/well反应条件37°Clhour ； 75°C 15min6、ABI遗传分析仪读取结果反应体系纯化产物1 y 1+HD 9 u 1反应条件95°C 5min ；迅速冰浴冷却。ABI3100上机读取基因型结果[结果判定]
权利要求
用于检测老年黄斑变性疾病的试剂盒，包括任选的用于检测CFH基因9号外显子的rs1061170变异、15号内含子的rs1329428变异、2号外显子的rs800292变异和/或5`非编码区的rs3753394变异用于AMD筛选诊断的相关试剂。
2.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测(FH基因9号外显子的 rsl061170的T — C变异、15号内含子的rsl329428的A — G变异、2号外显子的rs800292 的A — G变异和/或5、非编码区的rs3753394的C — T变异的试剂；以及任选的用于扩增 包含CFH基因9号外显子的rsl061170、15号内含子的rsl329428、2号外显子的rs800292 和/或5、非编码区的rs3753394基因片段的试剂。
3.权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述检测(FH基因9号外显子的rsl061170 的T — C变异、15号内含子的rsl329428的A — G变异、2号外显子的rs800292的A — G 变异和/或5、非编码区的rs3753394的C — T变异的试剂为测序用试剂。
4.权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述检测(FH基因9号外显子的rsl061170 的T — C变异、15号内含子的rsl329428的A — G变异、2号外显子的rs800292的A — G 变异、5、非编码区的rs3753394的C — T变异的试剂为限制性片段长度多态方法用试剂。
5.权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述检测(FH基因9号外显子的rsl061170 的T — C变异、15号内含子的rsl329428的A — G变异、2号外显子的rs800292的A — G 变异、5、非编码区的rs3753394的C — T变异的试剂为Snapshot试剂。
6.CFH基因9号外显子的rsl061170变异、15号内含子的rsl329428变异、2号外显子 的rs800292变异和/或5、非编码区的rs3753394变异在制备用于AMD筛选诊断试剂中的 应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述筛选诊断试剂包括检测(FH基因9号 外显子的rsl061170的T — C变异、15号内含子的rsl329428的A — G变异、2号外显子的 rs800292的A — G变异和/或5、非编码区的rs3753394的C — T变异的试剂；以及任选 的用于扩增包含CFH基因9号外显子的rsl061170、15号内含子的rsl329428、2号外显子 的rs800292和/或5、非编码区的rs3753394基因片段的试剂。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述检测(FH基因9号外显子的rsl061170 的T — C变异、15号内含子的rsl329428的A — G变异、2号外显子的rs800292的A — G 变异和/或5、非编码区的rs3753394的C — T变异的试剂为测序用试剂。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述检测(FH基因9号外显子的rsl061170 的T — C变异、15号内含子的rsl329428的A — G变异、2号外显子的rs800292的A — G 变异和/或5、非编码区的rs3753394的C — T变异的试剂为限制性片段长度多态方法用 试齐11°
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述检测(FH基因9号外显子的 rsl061170的T — C变异、15号内含子的rsl329428的A — G变异、2号外显子的rs800292 的A — G变异和/或5、非编码区的rs3753394的C — T变异的试剂为Snapshot试剂。
11.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述检测(FH基因9号外显子的 rsl061170的T — C变异、15号内含子的rsl329428的A — G变异、2号外显子的rs800292 的A — G变异和/或5、非编码区的rs3753394的C — T变异的试剂为限制性内切酶酶切 法、变性高效液相色谱法、Taqman实时荧光定量PCR法、特异引物PCR法或基于等位基因特异性寡核苷酸杂交反应原理的芯片检测方法用试剂。
全文摘要
本发明提供了检测老年黄斑变性疾病的试剂盒，包括任选的用于检测CFH基因9号外显子的rs1061170变异、15号内含子的rs1329428变异、2号外显子的rs800292变异和/或5`非编码区的rs3753394变异用于AMD筛选诊断的相关试剂。通过检测以上位点是否存在变异，检测老年黄斑变性疾病的患病风险，与AMD的关联度高。可用于早期监控和检测AMD高危人群，实施早期预防和治疗，减少其视力损害。
文档编号C12Q1/68GK101857899SQ201010162728
公开日2010年10月13日 申请日期2010年4月6日 优先权日2009年4月3日
发明者刘小琦, 杨正林, 鲁芳 申请人:四川省医学科学院(四川省人民医院)