专利名称：调控花青素合成与代谢的小麦新基因TaMYB3的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，涉及调控小麦花青素合成代谢的小麦新基因 TaMYB3，包括该基因的重组质粒、宿主及其应用。
背景技术：
花青素是植物中重要的次生代谢产物，参与了广泛的生物学过程(Beckwith et al. ,2004 ；Downs and Siegelman,1963 ；Lo and Nicholson, 1998 ；Vinterhalter et al., 2007 ；Zhou and Singh，2002)。作为食物，花青素不仅是优良的食品添加剂，而且具有抗心 率失调，抗癌的功能，降低心血管疾病，肥胖症，糖尿病的发病率(Lietti et al.，1976)。因 此人们需要更多来自水果、蔬菜以及粮食中的花青素(Boyd，2000)，但由于饮食习惯和经济 方面的原因，水果和蔬菜并不能为人们提供足够的花青素(Butelli et al.，2008)。植物体内花青素合成与代谢的控制主要是通过调控结构基因的表达量来实现的 (Davies and Schwinn，2003)。转录因子WD40、bHLH和MYB形成一个转录调控复合体，调控 着结构基因的表达量，从而控制花青素的合成与代谢(Hernandez et al.，2004)。MYB类转录因子是一类DNA结合蛋白，它们在结构上都有一段保守的MYB结构域。 MYB结构域是一段序列特异的能够结合DNA的区域，约由52个氨基酸构成，呈现螺旋_转 角_螺旋的构象。根据MYB结构域数目的差异将MYB类转录因子分为，(1)单一 MYB结构域 (R1/2)蛋白；(2) 2个重复MYB结构域(R2R3)蛋白；(3) 3个重复MYB结构域(R1R2R3)蛋白。 植物中绝大多数的MYB蛋白有2个重复MYB结构域(R2R3) (Martin and Paz-Ares, 1997)。 这些MYB蛋白调控了植物中多种生理过程，如毛状体发育(GhMYB109) (Suo et al. ,2003), 圆锥细胞发育(AmMYBMIXTA) (Sugimoto et al.，2000)，茎形态发生(AtMYB13) (Kiriket al.，1998)，赤霉素信号转导(AtMYB33, AtMYB65, AtMYB 101) (Gocal etal.，2001)，脱水反 应与 ABA 调节(AtMYB2) (Abe et al. ,2003 ；Urao et al.，1996)，色氨酸生物合成(ATRl) (Celenza et al.，2005)，调节细胞周期(AtCDC5) (Lin et al.，2007)等。其中的一个分支 调控了花青素合成代谢的生理过程，如ZmCl，PhAN2 (Hsuchen and Coe, 1973 ；Shimada et al.，2007)。MYB类基因对花青素生物合成结构基因的调控一般需要bHLH基因家族成员的参 加。例如，ZmCl和ZmPL对花青素合成代谢的调节需要bHLH基因ZmR或ZmB参加。ZmCl和 ZmR编码的蛋白通过与BZl (花青素合成代谢的结构基因)启动子的顺式元件直接结合，从 而实现对BZl基因表达的调控(Roth et al.，1991)。虽然单独的ZmCl蛋白能够结合到结 构基因启动子序列的转录元件上，但是只有ZmCl并不能产生转录活性。它还需要ZmR存在， 才能产生转录活性(Lloyd et al.，1992)。bHLH转录因子是通过激活某种未知的能够结合 到结构基因的CIS元件，或者通过从抑制因子上释放ZmCl，从而达到调控花青素合成的目 的(Heine et al.，2004)。也有极少数的MYB转录因子只要其自身过表达就能够诱导花青 素的合成，而不需要bHLH转录因子的协作，如VvMYBAl。利用基因枪介导的瞬时表达技术 单独将VvMYBAI在葡萄的胚性愈伤组织中表达时，能够诱导花青素的合成(Cutanda-Perez
3et al. ,2009) ο这一过程不依赖于bHLH转录因子。调控花青素合成的MYB类调控蛋白的DNA结合序列虽然高度相似，但具有特异性。 玉米的ZmCl和ZmR不能够诱导番茄果实产生花青素(Bovyet al.，2002)，而金鱼草中的 AmDel (bHLH) and AmROSEAl (MYB)确能够使得果实呈现紫色。玉米中花青素类化合物生物 合成需要两个早期结构基因CHS、CHI和一个后期结构基因DFR的表达。这三个结构基因不 受ZmCl和ZmR或ZmCl和ZmB调控，而受单拷贝MYB基因ZmP的调节(Grotewoldet al.， 1991 ；Grotewold et al.，1994)。研究发现ZmP蛋白所结合的DNA序列为CCT/AACC，与动 物MYB蛋白的结合序列(C/TAA)有显著差别。P蛋白对DFR启动子激活的前提是有蛋白质 的结合位点。玉米的BZl启动子含有ZmCl结合点，可以被ZmCl激活，但不能被P蛋白活化 (Grotewoldet al. , 1991 ；Grotewold et al.，1994)。不同植物中的结构基因启动子序列也 有所差异。玉米ZmCl和ZmB基因能够诱导玉米悬浮细胞合成花青素，但是不能够诱导葡萄 胚性愈伤组织细胞产生花青素。这种调控花青素合成与代谢的MYB类转录因子的功能分化 给基因工程改变植物体内的花青素含量和认识自然中与花青素相关性状的变异提供了机 遇和挑战。更多MYB类转录因子的克隆与功能验证将为解释自然界中颜色性状的差异，和 基因工程改良作物提供更多的选择。
发明内容
本发明人通过对调控花青素合成代谢的MYB类转录因子AtTT2，ZmCl，0s06gl0350 的编码框和基因组核苷酸序列进行比较后，在第一和第三个外显子的保守区域设计保守引 物，在紫色籽粒小麦品种高原115开花后7天光照处理和暗处理48小时后的籽粒果皮cDNA 中扩增出表达量随光照处理明显加强的220bp核苷酸片段。用这一核苷酸片段在小麦EST 库(TIGR)中 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)到与其高度相似的 EST 序列， 并将这些EST进行拼接后，设计特异引物用PCR方法从光处理48小时后的籽粒的cDNA文 库中克隆到一个含有完整读码框的片段，命名为TaMYB3，完整读码框含有783个核苷酸，编 码一个261个氨基酸的蛋白。该蛋白含有2个MYB转录结构域，与调控花青素合成的MYB 类转录因子ZmCl亲源关系较近。在高原115籽粒中，光能够诱导TaMYB3的表达。采用基 因枪介导的瞬时表达技术，在开花后14天高原115籽粒的果皮中实现了 TaMYB3的过表达， 揭示了在bHLH基因ZmR存在的条件下，TaMYB3具有调控花青素合成与代谢的MYB类转录 因子活性。通过病毒介导的基因沉默技术降低TaMYB3在高原115籽粒中的表达量，同时也 降低了高原115籽粒果皮中花青素的含量，说明TaMYB3参与了高原115籽粒中花青素的合 成与代谢。本发明揭示了光诱导的小麦TaMYB3基因具有调控花青素合成代谢的MYB类转录 因子的转录活性，并参与了紫色籽粒小麦品种高原115籽粒中花青素合成与代谢的调控过程。具体地，在一方面，本发明涉及调控花青素合成与代谢的小麦基因TaMYB3，其核苷 酸序列为SEQ ID NO: 11所示的序列。优选地，小麦基因TaMYB3的编码序列为SEQ ID N0: 10所示的序列。在本发明的另一个方面，涉及小麦基因TaMYB3所编码的蛋白，其氨基酸序列为 SEQ ID NO 12所示的序列。
在本发明的又一个方面，涉及重组载体，其包含权利要求1或2所述的小麦基因 TaMYB3。在本发明的另一个方面，涉及宿主细胞，其包含权利要求1或2所述的小麦基因 TaMYB3或权利要求4所述的重组载体。并且，所述宿主细胞不是人或动物的生殖细胞或胚 胎干细胞。在本发明的另一个方面，涉及所述小麦基因TaMYB3或其编码蛋白在调控花青素 合成与代谢中的应用。在本发明的另一个方面，涉及调控植物中花青素合成与代谢的方法，包括将上文 所述的基因与序列为SEQ ID NO :24的ZmR基因共转染到植物中，使权利要求1或2所述的 基因和ZmR基因进行表达。在本发明的另一个方面，涉及培育转染上文所述基因的植株的方法，包括构建含 所述基因的植物表达载体；用所述构建的表达载体转化植物细胞；和将转化的植物细胞培 育成转基因植株。
图1:保守引物的设计在MYB基因的第一个和第三个外显子上分别设计正向和反向PCR引物， 图中箭头所指位置即为引物设计位置。黑框表示外显子部分，而黑线表示内含子。 0s06gl0350 (genome, NC_008399 ；CDS, NM_001063625) ；ZmCl(genome, AF320613 ；CDS, AF320613) ；AtTT2 (genome, NM_122946 ；CDS, NM_122946)。图2 调控花青素合成代谢的MYB类转录因子蛋白序列比对。R2、R3分别表示两个 不同的MYB结构域。AtTT2, NP_198405 ；DcMYBl, ΒΑΕ54312 ；GhMYB10, CAD87010 ；MdMYBll, ΑΒΚ58136 ； VvMYB5a,AAS68190 ；ZmCl,AF320613 ；ZmPL,AAA19821 ；TaMYB3(genome, SEQ ID NO 11 ；CDS, SEQ IDNO 10)。图3 调控花青素合成与代谢的MYB类基因结构示意图[MdMYBl (genome, DQ886414 ；CDS, DQ886414)，0s06gl0350 (genome, NC_008399 ；CDS, ΝΜ_001063625)， VvMYBAl(genome, DQ886418 ；CDS, DQ886418) ；ZmCl(genome, AF320613 ；CDS, AF320613)， AtTT2 (genome, NC_003076 ；CDS, NM_122946) ；TaMYB3(genome, SEQID NO 11 ；CDS, SEQ ID NO :10)]。图4 调控花青素合成代谢的MYB类转录因子蛋白系统发生树(LeANTl,AAQ55181 ； StPANl, AAX53087 ；PhAN2, AF146702 ；CaA, CAE75745 ；GhMYB10, CAD87010 ；AmVENOSA, ABB83828 ；AmROSEAl, ABB83826 ；AmR0SEA2, ABB83827 ；AtPAPl, ABB03879 ；GmMYB10, ACM62751 ；VvMYBAl, BAH15078 ；VvMYBA2, BAD18978 ；MdMYBl-1, ABK58136 ；MdMYB1-2, ABK58137 ；MdMYB1-3, ABK58138 ；DcMYBl，BAE54312 ；VvMYB5a, AAS68190 ；AtTT2, Q9FJA2 ； ZmCl，AF320613 ；ZmPL, AAA19821 ；AtTRIPTYCHON, NP_200132 ；AtMYB66,NP-196979)。图5 :TaMYB3染色体座位(A) =CS表示中国春；4BL-10 (0. 95)表示4B染色体长臂 缺失顶端5%物理长度的中国春；4BL-13(0. 62)表示4BL染色体长臂缺失顶端38%物理长 度的中国春。(B) JE29-1表示A染色体组；AS69表示D染色体组；LND表示Langdon (AB组染色体)；CS表示中国春；4D/4A表示指4A染色体被中国春4D染色体替换了的Langdon ； 4D/4B表示指4B染色体被中国春4D染色体替换了的Langdon)。图 6 :TaMYB3 的亚细胞定位(PMNG1001 TaMYB3 表示 TaMYB3 构建到 PMNG1001 载 体中，能够产生TaMYB3和GFP的融合蛋白，而PMNG1001表示空载体，只能产生GFP蛋白。 A.瞬时表达载体，B.瞬时表达后的小麦和拟南芥原生质体)。图7 光诱导高原115籽粒中TaMYB3基因表达量的上调，并诱导花青素的合成(A， 开花后14天高原115幼穗上光处理和暗处理48小时后的籽粒。B，利用Tubulin特异引物 为内参，对开花后14天高原115幼穗上暗处理和光处理48小时籽粒果皮分别进行TaMYB3 基因表达量的分析。C，利用ImageJ软件计算TaMYB3基因表达量的相对值)。图8 用于瞬时表达的载体图9 基因枪轰击开花后14天高原115籽粒，暗处理48小时后验证TaMYB3的功 能。图中红色箭头所指为含有花青素的细胞。仏1 +2111(1表示？皿1::21111 和？皿1::2111(1 共转；B :R+TaMYB3 表示 PUBI ZmR 和 PUBI TaMYB3 共转；C :R 表示 PUBI ZmR 单转；D TaMYB3表示PUBI: :TaMYB3单转；E :C1表示PUBI ZmCl单转；F :CK表示对照未进行轰击)。图10 :BSMV载体结构示意图。(GFP全长基因是正向插入γ b蛋白的终止密码子 前，而TaMYB3的基因片段是反向插入Y b蛋白的终止密码子前)图11 在开花后14天，将接种不同病毒载体的高原115幼穗的颖壳去除接受光照 处理，48小时后测定籽粒中花青素含量，并以细胞骨架蛋白Tubulin为对照，进行模板量的 均一化后，测定病毒外壳蛋白基因(BSMV-CP)和TaMYB3基因转录水平。A，接种不同病毒载 体的植株籽粒中TaMYB3和BSMV-CP的表达量。B，不同接种处理的高原115籽粒中花青素 含量。(CK表示接种蒸馏水，GFP表示接种BSMV: :GFP, TaMYB3表示接种BSMV: TaMYB3)
具体实施例方式下面通过实施例详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解，下述实施例 仅是用于举例说明的目的，并非限制本发明。本发明的保护范围由后附的权利要求所界定。实施例1 TaMYB3基因的克隆所有的实验材料购自中国科学院遗传与发育生物学研究所。所有用于DNA和RNA 提取的样品都在取样后，液氮迅速冷冻并保存在-80冰箱中。所有的核苷酸序列测定都 是在北京奥科生物技术有限公司完成。DNA的提取采用CTAB法(Murray and Thompson, 1980)，RNA的提取采用改进的Trizon法(Li and Trick，2005)。质体提取使用北京博大 泰克生物基因技术有限公司的试剂盒(中国)。核苷酸和蛋白序列比对使用软件Vector NTIAdvance 10. 0 (http //www. invitrogen.com/)。蛋白系统发生树构建使用软件 MEGA 4. O (http //www. megasoftware. net/)。基因图绘制使用 GSDS 软件(http //gsds. cbi. pku. edu. cn/help. php)。通过对已知能够调控花青素合成代谢的MYB类转录因子玉米 ZmCl (Paz-Ares et al.，1987)，拟南芥的 AtTT2 (Wei et al. ,2007)和水稻的同源基 因0s06gl0350 (Ohyanagi et al. ,2006)的基因组和编码区的核苷酸序列比对，设计跨 内含子的保守引物 TACl-F 5 ‘ -CYCATGGCGAAGGCARRTGG-3 ‘ (SEQ ID NO 1) ；TACl-R 5' -TTTCRTTGTCTGTTCGGCC-3‘ (SEQ ID NO 2)(图 1)。对紫色籽粒小麦品种高原 115 开花后7天的籽粒采取光照和暗处理(去除其籽粒的颖壳，使籽粒接受阳光照射为光处理，而不 去颖壳的作为暗处理)。光处理48小时，能够诱导高原115籽粒产生花青素。而暗处理的 籽粒未见明显的花青素产生。对处理48小时后的籽粒分别按照上述方法进行RNA提取并进 行反转录。对获得的RNA反转录产物用TaCl-F和TaCl-R引物进行扩增，扩增程序为94°C 4 分钟，32个循环(94°C 30秒，540C 30秒，72°C 1分钟)，72°C 10分钟，4°C保存。在暗处理籽 粒的cDNA中未能扩增到明显条带。在光处理籽粒的cDNA中扩增得到220bp片段(序列为 SEQ ID NO :3)，将该序列输入TIGR 网站(http//blast, jcvi. org/euk-blast/index. cgi ？ project = tael)进行搜索后获得 TA59663_4565，TA59683_4565 (序列分别为 SEQ ID NO 4，和5)。将这两段序列拼接后，获得了一个1232bp的cDNA片段(序列为SEQ IDNO 6)。 对此片段进行编码区预测，获得了 732bps的蛋白编码区(序列为SEQ ID NO :7)。以此编码 区为模板，设计扩增引物(TaMYB3-F 5' -ATGAGGACGTGCAGCGCGAAGG-3 ‘ (SEQ IDNO:8); TaMYB3-R 5' -TTAATACGCCATCTGCAGGGACTTGAC-3 ‘ (SEQ ID NO :9))。使用引物 TaMYB3_F 和TaMYB3-R从开花后7天的高原115受光48小时的籽粒cDNA中获得了 TaMYB3编码区 全长(序列为 SEQ ID N0:10)。扩增条件(反应条件94°C 4min，94°C lmin，63°C lmin， 72°C lmin，32 个循环，72°C 5min。反应体系:1 XPCR 反应缓冲液，IU LA-Taq 酶(Takara 公 司)，20ngcDNA，0. 2mM dNTPs，0. 2 μ M引物，加重蒸水至20 μ 1)。同时利用引物TaMYB3_F和 TaMYB3-R从高原115的基因组DNA克隆到TaMYB3的基因组DNA序列(序列为SEQ ID NO 11)(反应条件-MV 4min，94°C lmin，63°C lmin，72°C lmin，32 个循环，72°C 5min。反应体 系1 XPCR 反应缓冲液，IU LA-Taq 酶(Takara 公司)，20ng cDNA,0. 2mM dNTPs，0.2yM 引 物，加重蒸水至20 μ 1)0实施例2 :TaMYB3生物信息学分析为了了解TaMYB3与其它同类基因的关系，从而预测TaMYB3的生物学功能，我们对 TaMYB3进行生物信息学分析。生物信息学分析表明，预测的TaMYB3蛋白(SEQ ID NO 12) 与其它调控花青素合成的MYB类转录因子相比，具有同源性较高的R2和R3两个保守结构 域(图2)。TaMYB3的基因结构与其它同源基因相异。TaMYB3只有一个内含子，而玉米、水 稻、拟南芥和苹果中调控花青素合成代谢的MYB基因具有2个内含子(图3)。我们选择了 已知能够调控花青素合成代谢的MYB类转录因子的蛋白全长序列构建系统发生树。从同源 性来看，TaMYB3蛋白从属于调控花青素合成代谢的MYB类蛋白。与玉米的ZmCl，ZmPL划分 在同一分支，这一分支下所有的蛋白都有调控花青素合成的功能(图4)。实施例3 :TaMYB3基因的染色体座位用TaMYB3基因特异引物TaMYB3_F和TaMYB3_R在各种细胞遗传学的材料进行PCR 扩增，来确定TaMYB3染色体座位。在乌拉尔图小麦IE29-1 (具有普通小麦A染色体组，没 有B和D染色体组)和节节麦As69 (具有普通小麦D染色体组，没有A和B染色体组)中 未能扩增出TaMYB3。而在中国春、Langdon等具有B染色体组的材料中都能够稳定扩增出 TaMYB3。这说明TaMYB3不在A、D染色体组上，而是在B染色体组上(图5. B)。在缺4B染 色体而添加中国春4D染色体的四倍体小麦Langdon(AABB)的基因组DNA中，未能扩增出 TaMYB3。在具有4B染色体的其它代换系中能够将TaMYB3稳定扩增，推断TaMYB3定位于小 麦的4B染色体上(图5. B)。在中国春4B染色体片段缺失系中，4BL-10(0.95)(缺失4B染 色体长臂末端物理距离的5%)的基因组DNA中能够扩增出目标条带。在4BL-13(0. 62)(缺
7失4B染色体长臂末端物理距离的38% )中未能扩增出目标条带(图5. A)。所以TaMYB3 位于4B染色体长臂物理图谱的0. 62-0. 95之间。实施例4 :TaMYB3蛋白的亚细胞定位在TaMYB3编码区的5’端和3’端分别设计带有酶切位点的引物。TaMYB3+BamHI-F 5' -CGGGATCCATGGGGATGAGGACGTGCAG-3' (SEQ ID NO 13), TaMYB3+BamHI-R 5' -CGGGA TCCATACGCCATCTGCAGGGACTTGAC-3 ‘ (SEQ ID NO: 14)。PCR 扩增后与 PMNG1001 载体(Ubi 启动子下带有sGFP) (Upadhyaya et al.，1998) 一起，用BamHI过夜酶切回收，连接后转化 大肠杆菌DH10B。这样将TaMYB3构建到PMNG1001载体上，获得PMNG1001 TaMYB3载体 (图6. A)。利用PEG法将构建好的PMNG1001 :TaMYB3载体质粒对拟南芥和小麦的原生质 体进行转化。原生质体的制备和基因的瞬时表达按照Sheen的方法(Sheen，2002)。拟南 芥取未开花前的叶片制备原生质体。小麦取发芽后7天的黄化苗幼茎制备原生质体。带 有GFP的PMNG1001空载体转化时，荧光蛋白在拟南芥和小麦的原生质体中是遍在表达的， 而PMNG1001: :TaMYB3载体的TaMYB3_GFP融合蛋白只在细胞核中表达(图6. B)，这说明 TaMYB3蛋白亚细胞定位于植物细胞核。实施例5 :TaMYB3的表达受到光的诱导在紫色籽粒品种高原115开花后14天，去除其幼穗2排籽粒的颖壳，使其接受光 照处理，而不去颖壳的2排籽粒作为暗处理。处理后48小时，高原115籽粒能够在光的诱导 下，产生花青素，而暗处理的籽粒没有花青素的产生(图7. A)。如实施例1所述方法提取光 处理和暗处理的籽粒果皮样品总RNA，检测质量并测定浓度。均取2 μ g进行反转录反应，之 后作为模板用。用植物细胞中表达量相对稳定的微管蛋白Tubulin基因的特异引物Tub-F 5' -AGAACACTGTTGTAAGGCTCAAC-3‘ (SEQ ID NO 15) ；Tub-R 5' -GAGCTTTACTGCCTCGAACA TGG-3' (SEQ ID NO 16)扩增各cDNA模板，琼脂糖电泳后凝胶成像系统扫描，利用ImageJ 软件(http://rsbweb.nih. gov/ij/)计算各泳带的灰度值，根据灰度值进行稀释来调整模 板量。当所有模板的Tubulin特异引物扩增后的灰度值一致时，用TaMYB3-F和TaMYB3_R 引物对各模板进行PCR扩增，并利用ImageJ软件进行相对表达丰度的测定。RT-PCR结果表 明，TaMYB3基因的表达也受到光的诱导而上调(图7. B，图7. C)。实施例6 :TaMYB3基因调控花青素合成代谢的转录活性功能验证TaMYB3具有调控花青素合成的功能结构域(图2)，进化上与ZmCl亲缘关系较 近(图4)。已有研究表明ZmCl必须在bHLH基因的协同下才能发挥作用(Sainz et al., 1997)。在TaMYB3编码区的5，端设计带有BamHI酶切位点的引物，TaMYB3+BamHI-F 5' -C GGGATCCATGGGGATGAGGACGTGCAG-3‘ (SEQ ID N0:17)。3，端设计带有 KpnI 酶切位点的引 物，TaMYB3+KpnI-R :5' -CGGGATCCATACGCCATCTGCAGGGACTTGAC-3 ‘ (SEQ ID NO: 18)。用这 对引物以TaMYB3cDNA克隆质粒为模板进行扩增，PCR产物与PUBI载体(载体完整图谱在图 8A;序列为SEQ ID NO :19，本领域的普通技术人员完全可以理解可以使用本领域已知的其 它表达载体)一起用BamHI和KpnI过夜酶切，回收目标条带并连接，转化大肠杆菌DH10B。 构建成PUBI :TaMYB3瞬时表达载体(图8. B)。将PUBI :ZmR、PUBI :ZmCl (质粒的图谱在 图8. C、D中；序列分别为SEQ ID NO 20和21，本领域的普通技术人员完全可以理解可以 使用本领域已知的其它表达载体)和PUBI ::TaMYB3用基因枪介导方法，在高原115开花后 14天籽粒果皮细胞中瞬时表达。基因枪轰击的方法按照Ahmed等的方法(Ahmed et al.,
82003)，每个处理3次重复。开花后14天高原115的籽粒轰击后用锡箔纸包裹后暗处理。 从图8中可以看出PUBI ZmCl和PUBI ZmR共转时，暗处理的高原115籽粒果皮细胞能够 产生花青素(图9. A)。PUBI: :TaMYB3和PUBI ZmR也能够促使果皮细胞合成花青素(图 9. B)。但是单一 PUBI: :TaMYB3、PUBI: :ZmCl、PUBI: :ZmR转化都不能促使暗处理高原115的 果皮细胞产生花青素(图9. C ；图9. D ；图9. E)。TaMYB3在玉米的bHLH基因ZmR的协作下， 能够诱导高原115籽粒果皮细胞产生花青素，这表明TaMYB3具有调控花青素合成的功能。 但是TaMYB3在没有ZmR的协作时，不能诱导果皮细胞中花青素的合成，这说明TaMYB3发挥 调控花青素合成代谢的功能，需要bHLH基因的协作。从结果上看，ZmCl基因也能够调控花 青素的合成，并需要bHLH基因的协作。所以TaMYB3与ZmCl基因的功能上可以相互替换。实施例7 :BSMV (大麦条纹花叶病毒)介导TaMYB3基因表达量的降低减少了高原 115籽粒中花青素含量本领域的普通技术人员完全可以理解可以使用本领域已知的其它表达载体。作 为实例，使用BSMV载体，其构建根据Petty等的方法(Petty etal.，1988)。BSMV:: α , BSMV: β、BSMV: γ 载体图谱见图 10，载体的序列为 SEQ ID NO :22，23，24 (Tai et al.， 2005)。根据TaMYB3基因的外显子核苷酸序列设计引物TaMYB3_BSMV_F 5' -CGGCTAGCACG AGCAAGGAGGACCAAAC-3‘ (SEQ ID NO 25),TaMYB3-BSMV-R 5' -CGGCTAGCCAAGGGTGCTGTTCC AGTAGTT-3 ‘ (SEQ ID NO 26)。从TaMYB3cDNA克隆质粒中扩增出288bp保守性片段(序列 为SEQ ID NO :27)，经NheI酶切后反向插入到BSMV载体RNA γ链Yb蛋白编码区的终止 密码子前形成BSMV: :TaMYB3载体(序列为SEQID NO 28)，鉴定后进行测序验证。实验中 使用的BSMV: :GFP由周焕斌博士惠赠(载体图谱在图10，序列为SEQ ID NO 29) (Zhou et al.，2007)。GFP是连接到Y b蛋白编码区的终止密码子前。接种前首先将载体酶切线性化，BSMV α、BSMV TaMYB3 (y), BSMV GFP ( γ )用 MluI，BSMV: β 用 SpeI，酶切体系为(酶，2 μ 1 ； 10 XBuffer, 5 μ 1 ；Plasmide X μ 1 (2 μ g)； Add H20 to 50 μ 1)。在37°C条件下酶切6小时后进行纯化。在上述酶切产物中加入 350 μ 1 DEPC Η20，500μ 1 苯酚氯仿(1 1)，混勻，静置 5min 后，12000rpm离心 15min。取 450 μ 1 上清，依次 45 μ 1 NaAc (ρΗ5· 2，3Μ)、1000 μ 1 无水乙醇，混勻，_20°C过夜，12000rpm 离心15min。吸去上清，加入70%乙醇500μ 1洗涤后，12000rpm离心lOmin，去除上清。加 入20μ1 DEPC Η20溶解，点Ιμ 估计模板浓度后进行体外反转录。体外反转录的体系 为(Template, 1. 2_1· 5μ g ； 10 X Buffer, 2 μ 1 ； Cap/NTP,8y 1 ；DTT,2y 1 ；T7 enzyme, 2 μ 1 ； 加水至20μ1)，42 条件下反应2. 5小时。体外反转录后获得α、β和γ三条正义RNA 链(Zhou et al.，2007)。α，β，γ转录物_70°C单独保存，根据需要，各取10 μ 1 α , β，Y转录物混合，共30 μ 1，加3倍体积(90 μ 1)的DEPC Η20,总体积达到120 μ 1，再加 1 倍体禾只(120 μ 1)的 GKP 缓7中液(50mM glycine, 30mM dipotassiumhydrogenphosphate, pH9. 2,1% bentonite,l% celite)，制得240 μ 1的接种病毒混合液。用接种病毒混合 液侵染高原115孕穗时期的倒二叶(Zhou et al.，2007)。BSMV侵染寄主植物后，含有 目的基因片段的病毒在植物体内大量复制，形成大量的双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)；植物体内的Dicer酶识别dsRNA，将这些双链RNA切割成21-25个核苷酸的短干 扰RNA (short interfering RNA, siRNA)；然后siRNA的单链与RNA诱导基因沉默复合体 (RNA-induced silencing complex, RISC)结合识别细胞质中与其互补的mRNA，并将其降解。因为病毒载体上含有目标基因片段，所以目标基因也被特异性降解，从而造成目标基 因在mRNA水平的沉默(Constantin et al.，2008)。大麦条纹花叶病毒的检测使用病毒 外壳蛋白的特异引物(BSMV-CP-F :TGACTGCTAAGGGTGGAGGA(SEQ ID NO 30) ；BSMV-CP-R CGGTTGAACATCACGAAGAGT(SEQ ID NO 31)，扩增条件(反应条件-MV 4min，94°C lmin, 58°C lmin,72°C lmin，32 个循环，72°C 5min。反应体系1 XPCR 反应缓冲液，IU LA-Taq 酶 (Takara公司)，20ng cDNA,0. 2mM dNTPs，0. 2 μ M引物，加重蒸水至20 μ 1)。扩增片段大小 为 446bps在开花后14天，去除不同处理的高原115幼穗籽粒的颖壳，使其接受光照处理。 48小时后测定籽粒中的花青素含量，并利用细胞骨架蛋白Tubulin对籽粒cDNA进行均一 化(如实施例5所述，即当所有模板的Tubulin特异引物扩增后的灰度值一致时)，检测籽 粒中TaMYB3基因和病毒外壳蛋白基因CP转录水平。接种了 BSMV TaMYB3和BSMV :GFP 的植株籽粒中都有病毒外壳蛋白BSMV-CP的表达，而对照籽粒(CK)中没有病毒外壳蛋白 的表达(图11. A)。接种BSMV::TaMYB3高原115植株的籽粒中，TaMYB3表达量与接种 BSMV :GFP植株籽粒相比明显减弱，并且这种表达量的降低减少了高原115籽粒中花青素 含量(图11. A)。接种BSMV::TaMYB3植株籽粒中花青素含量比接种BSMV::GFP下降了 46. 6% (图11. B)。病毒介导的基因沉默效应具有特异性，所以接种BSMV: :TaMYB3的植株 会特异地降低高原115籽粒中TaMYB3基因的表达，而不会影响其它基因的表达。所以接 种BSMV: :TaMYB3植株籽粒中花青素含量的降低，是由TaMYB3表达量的下调引起，这说明 TaMYB3确实参与了高原115籽粒中花青素的合成。参考文献Abe, H. , Urao, Τ. , Ito, Τ. , Seki, Μ. , Shinozaki, K. , and Yamaguchi-Shinozaki, K. (2003).Arabidopsis AtMYC2(bHLH)and AtMYB2(MYB) function astranscriptional activators in abscisic acid signaling. Plant Cell 15,63-78. Ahmed,N. ,Maekawa,M., Utsugi, S. , Himi, Ε. , Ablet,H. ,Rikiishi, K. ,andNoda, K. (2003). Transient expression of anthocyanin in developing wheatColeoptiIe by maize Cl and beta-peru regulatory genes for anthocyaninsynthesis. Breeding Science 53,29-34.Beckwith, A. G. ，Zhang, Y. ，Seeram, N. P. ，Cameron, A. C. ，and Nair, M. G. (2004). Relationship of light quantity and anthocyanin production inPennisetum setaceum Cvs. rubrum and red riding hood. 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权利要求
调控花青素合成与代谢的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO11所示的序列。
2.权利要求1的基因，其编码序列为SEQID NO :10所示的序列。
3.权利要求1或2的基因所编码的蛋白，其氨基酸序列为SEQID N0:12所示的序列。
4.重组载体，其包含权利要求1或2所述的基因。
5.宿主细胞，其包含权利要求1或2所述的基因或权利要求4所述的重组载体。
6.权利要求1或2所述的基因在转化植物获得转基因植物中的应用。
7.权利要求1或2的基因在调控花青素合成与代谢中的应用。
8.权利要求3所述的蛋白在调控花青素合成与代谢中的应用。
9.调控植物中花青素合成与代谢的方法，包括将权利要求1或2所述的基因与序列为 SEQ ID NO 20的ZmR基因共转染到植物中，使权利要求1或2所述的基因和ZmR基因进行 表达。
10.培育转染权利要求1或2所述基因的植株的方法，包括构建含权利要求1或2所述 基因的植物表达载体；用所述构建的表达载体转化植物细胞；和将转化的植物细胞培育成 转基因植株。
全文摘要
本发明提供一种从紫色籽粒小麦品种高原115中分离到的调控花青素合成与代谢的MYB类转录因子TaMYB3。TaMYB3定位小麦4B染色体长臂物理图谱的0.62-0.95之间，蛋白质产物亚细胞定位于细胞核。推导的氨基酸序列表明TaMYB3编码一个调控花青素合成代谢的MYB类转录因子。紫色籽粒小麦品种高原115中TaMYB3能够在光的诱导下表达量上调。瞬时表达时，TaMYB3在玉米bHLH转录因子ZmR存在下能够促使暗处理的高原115籽粒的果皮细胞合成花青素，单独的TaMYB3和ZmR基因都不能够诱导花青素的合成，这表明TaMYB3具有调控花青素合成代谢的转录活性。大麦条纹花叶病毒(BSMV)介导高原115籽粒中TaMYB3表达量的下调，降低了籽粒中花青素含量，说明TaMYB3参与了高原115籽粒中花青素的生物合成。
文档编号C12N15/63GK101935663SQ20101016276
公开日2011年1月5日 申请日期2010年4月28日 优先权日2010年4月28日
发明者刘宝龙, 刘昕, 安学丽, 张怀刚, 王道文, 秦焕菊 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所;中国科学院西北高原生物研究所