专利名称：一种丙酮丁醇梭菌及其构建方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及丙酮丁醇梭菌及其构建方法和用途。
背景技术：
近年来，由于石油等化石资源的日益匮乏，采用丙酮-丁醇发酵将生物质转化为化学品和液体燃料的方法又重新成为人们关注的重点。传统的丙酮_ 丁醇发酵是以玉米或 糖蜜为基质，接入丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)进行发酵，其发酵产物为 丙酮、丁醇、和乙醇，其比例为3 6 1，混合醇占总容剂量的70%，其中丁醇占总容剂量 的60%。由于丁醇能量含量高、挥发性小、与汽油混合对水的宽容度大、与其他生物燃料相 比安全性高、温室气体排放少，因此，人们大多认为提高丁醇在溶剂中的比例非常有意义。 为此，研究人员一直在致力筛选或构建性能更为优良的丙酮丁醇梭菌。目前已有许多新的 技术方案。如CN101423813A公开了一种重组梭菌及其构建方法与应用，该重组梭菌是由编 码甲酸脱氢酶的基因导入梭菌中构建而成。所述梭菌可用于丙酮-丁醇发酵，从而生产丁 醇，其丁醇产量可达到14. lg/L。CN101423815A公开了另一种用于丙酮-丁醇发酵的重组 丙酮丁醇梭菌。该重组丙酮丁醇梭菌是由含有FoFl型ATP合酶的亲水部分的编码基因的 DNA片段导入丙酮丁醇梭菌中构建而成，用其发酵生产丁醇产率最高可达到13. 7g/L。但这 些方法均为基因工程技术，故技术手段复杂、制造成本高。为解决这一问题，CN101250496公 开了一种丙酮丁醇梭菌(SB-1 CGMCC N2. 2287)，其用于发酵生产生物醇，所得混合醇占总 容剂比可达77 82%，丁醇占总容剂比可达68 75%。该方法的不足之处在于，该方法 采用的依旧是传统的菌种筛选法，故其筛选效率、数量都有可能严重制约该方法的工业化 应用。
发明内容
本发明的目的就是要提供一种可有效提高生物产醇量的丙酮丁醇梭菌；同时提供 一种构建该丙酮丁醇梭菌的构建方法，以及该菌株的一种新用途。本发明的目的是这样实现的本发明所提供的菌株为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) pll47(CGMCCNo3686)。本发明所提供的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)为丙酮丁醇梭菌 pll47(CGMCCNo3686))于2010年3月22日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学 院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编 号为 CGMCNo3686。本发明所提供丙酮丁醇梭菌pll47(CGMCCNo3686)是由丙酮丁醇梭状芽孢杆菌 (Clostridium acetobutylicum)ATCC 824(以下简称 ATCC 824)的原生质体融合而成。本发明方法是采用原生质体技术构建成丙酮丁醇梭菌pll47 (CGMCCNo3686)，故其 具有生长快、繁殖量大、周期短，菌株稳定等诸多优点。
本发明所选用的ATCC824可从商业渠道获得。本发明在此提供一种优选的丙酮丁醇梭菌pll47(CGMCCNo3686)的构建方法，它 包括以下步骤a、原生质体的制备离心收集厌氧培养的ATCC824，使用终浓度为4mg/ml 10mg/ml的溶菌酶酶解30min 40min，55°C 60°C 30min 40min加热致死其原生质体；b、再生、融合将a步工序中致死的原生质体，加入5 10mlPEG4000 PEG6000对原生质体诱 导融合5 lOmin，离心收集，加入终浓度为50 60mM的Ca2+、和75mMMg2+溶液，将菌体混 勻，均勻涂布于SRA固体平板上，厌氧箱中培养；C、融合子的筛选洗下再生的梭菌，取接种到液体梭菌培养基中，35 38°C厌氧培养48h 72h，离 心收集菌体，涂布与玉米平板，37°C厌氧培养3 4d，挑取单菌落至6%淀粉醪糟种子培养 基中，37°C培养24h 48h，取ImL转接8%淀粉发酵培养基，37°C培养48h 72h，选出发酵 速度快的丙酮丁醇梭菌pll47(CGMCCNo3686)。在上述的方法中，玉米淀粉培养液为更优选的淀粉培养液。玉米淀粉培养液中玉米淀粉占培养液质量百分含量的7. 5%，其培养效果更优。丙酮丁醇梭菌pll47可用于产生含有异丙醇的混合醇。其具体的方法是将丙酮丁醇梭菌pll47接种到发酵培养基中，发酵初始菌液浓度为IO9-IO11Cfu/ mL，于35 40°C，静止发酵，即可产出含有异丙醇的混合醇。或采用生长至对数期的丙酮丁醇梭菌pll47(CGMCC No. 3686)，按照体积百分含 量，以5%的接种量接种到所述发酵培养基中。其更优选的培养条件是所述的发酵温度为35 40°C，发酵初始PH值5 7，发酵 时间为48 72h。最为优选的培养条件是发酵温度为38°C，发酵周期为72h。实验表明，本发明所提供的丙酮丁醇梭菌pll47，可将发酵产物中的丙酮转化为异 丙醇，产生出含有丁醇、乙醇、异丙醇的混合醇，总混合醇可达16g/L。由于丙酮丁醇梭菌 P1147在发酵过程中可转化发酵产物中的丙酮，使溶剂总量中的丙酮含量减低，因此当所制 混合醇用于液体燃料时，可有效减低燃料燃烧时的碳排放量，故有利于环保。再则，含有异 丙醇的混合醇，不仅具有更好的热量，还可以起到防冻剂的作用，因而其相对于现有技术中 生产的混合醇具有更加广泛的应用性。另外，异丙醇本身是一种性能优良的有机溶剂，也是 生产多种有机化合物的重要中间体，还广泛用作石油燃料的防冻添加剂。本发明也提供了 一种用生物质生产异丙醇的方法。本发明所提供的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)pll47，具有以下 微生物学特征1、其形态学特征营养细胞的形态呈梭状，以周生鞭毛运动。芽孢卵圆形，次端生。 菌落圆形、突起，直径3-5mm，边缘不规则，色灰白，半透明，表面有光泽。2、其培养学的特征在38°C条件下，在以下各种培养基中培养时，本发明菌株具有以下特征(表1)
表1 3、其生理生化特征，见表2表2 用‘‘ + ”表示可以‘‘_”表示不可以。本发明所提供的丙酮丁醇梭菌pll47 CGMCCNo3686，其性状优良，用于丙酮-丁醇 发酵时所产混合醇浓度高，是其具有一种特殊的功能，即其用于丙酮_ 丁醇发酵时还可产 出一种含有异丙醇的混合醇，这是目前一般丙酮丁醇梭菌所不具有的功能。因此本发明提 供了丙酮丁醇梭菌Ρ1147用于丙酮丁醇梭菌发酵产生含有异丙醇的混合醇的新用途。
本发明所提供的丙酮丁醇梭菌pll47，RCM培养基平板上划线传代培养100代，经对形态学特征、生理生化学特征、以及其发酵生产能力等一系列检定后，其结果表明均与原 始菌种一致，且无支原体及其他微生物污染，由此可见其可用于规模化生产。
图1是本发明中的实验对比色谱图，其中A部分是ATCC824发酵液的色谱图。B部分是丙酮丁醇梭菌pi 147发酵液的色谱图。
具体实施例方式下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。实施例1构建丙酮丁醇梭菌pll47(CGMCC No3686)a、原生质体制备选择分离、培养好的ATCC824菌，使用终浓度为4mg/ml的溶菌酶 酶解30min，55 V 30min加热致死ATCC824菌原生质体。b、再生及融合将致死的原生质体加入5ml PEG4000，对原生质体诱导融合5，离心IOmin收集，加 入终浓度为60mM的Ca2+、和75mMMg2+溶液，将菌体混勻，均勻涂布于SRA固体平板上，厌氧 箱中，37°C培养3d观察结果。其中ATCC824从市场中购得，供应商为美国菌株保藏中心。玉米粉培养基每升培养基含玉米粉50g。RCM培养基每升培养基含酵母粉3. Og,蛋白胨10. 0g，牛肉膏10. 0g，葡萄糖 5. Og,淀粉10. Og,乙酸钠3. 0g, L-半胱氨酸盐酸盐0. 5g，ρΗ6· 8。CBM 培养基每 100 克培养基中含有葡萄糖，Ig ；MgSO4,0. 008g ；MnSO4,0. 00063g ； FeSO4, 0. 00083g ；K2HPO4, 0. 0784g ；KH2PO4, 0. 0224g ；casein hydrolysate, 0. 08g ；PABA, 0. OOlg ；biotin,0. 2μ goSRA培养基的组成每100克培养基中含有葡萄糖，Ig ；MgSO4,0. 008g ；MnSO4, 0. 00063g ；FeSO4, 0. 00083g ；K2HPO4, 0. 0784g ；KH2PO4, 0. 0224g ；casein hydrolysate, 0. 22g ；yeast extract,0. 8g ；asparagine,0. Ig ；cysteine,0. 05g ；CaCl2 0. 4g ；MgCl2 0. 5g。C、融合子的筛选在再生平板中加入Iml去氧的液体RCM培养基，洗下再生的梭菌，取200 μ 1接 种到液体RCM培养基中，37°C厌氧培养48h，离心收集菌体，涂布与玉米平板，37°C厌氧培 养3 4d，挑取单菌落至6%玉米醪糟种子培养基中，37°C培养24h，取Iml转接8%玉米 发酵培养基，37°C培养48h，选出生长快的菌株。菌株命名为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)pll47(CGMCC No. 3686)。其中
RCM培养基的组成为每升培养基含酵母粉3. 0g，蛋白胨10. 0g，牛肉膏10. 0g，葡萄糖5. Og,淀粉10. Og,乙酸钠3. 0, L-0. 5半胱氨酸盐酸盐，丁醇加至全量，pH6. 8。实施例2构建丙酮丁醇梭菌pll47(CGMCC No3686)a、原生质体制备收集ATCC824菌，使用终浓度为10mg/ml的溶菌酶酶解40min，60°C 40min加热致 死原生质体.b、将致死的原生质体加入IOml PEG6000，对原生质体诱导融合lOmin，离心IOmin 收集，加入终浓度为50mM的Ca2+、和75mMMg2+溶液，将菌体混勻，均勻涂布于SRA固体平板 上，厌氧箱中，37°C培养2d观察结果。其中ATCC824从市场中购得，供应商为美国菌株保藏中心。玉米粉培养基每升培养基含玉米粉50g。RCM培养基每升培养基含酵母粉3. Og,蛋白胨10. Og，牛肉膏10. 0g，葡萄糖 5. Og,淀粉10. Og,乙酸钠3. 0g, L-半胱氨酸盐酸盐0. 5g，ρΗ6· 8。SRA培养基的组成每100克培养基中含有葡萄糖，Ig ；MgSO4,0. 008g ；MnSO4, 0. 00063g ；FeSO4, 0. 00083g ；K2HPO4, 0. 0784g ；KH2PO4, 0. 0224g ；casein hydrolysate, 0. 22g ；yeast extract,0. 8g ；asparagine, 0. Ig；cysteine,0. 05g ；CaCl2 0. 4g ；MgCl2 0. 5g。C、融合子的筛选在再生平板中加入Iml去氧的液体RCM培养基，洗下再生的梭菌，取200 μ 1接 种到液体RCM培养基中，37°C厌氧培养48h，离心收集菌体，涂布与玉米平板，37°C厌氧培 养4d，挑取单菌落至6%玉米醪糟种子培养基中，37°C培养24h，取Iml转接8%玉米发 酵培养基，37°C培养48h，选出生长快的菌株。菌株命名为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)pll47(CGMCC No. 3686)。实施例3利用实施例1所构建培养的丙酮丁醇梭菌P1147与市购的ATCC824用于生产混合 醇的实验对比。1、将实施例1所培养的丙酮丁醇梭菌pll47(为实验组1)，与市购的ATCC824(为 对照组)分别用6%玉米醪糟培养基，温度37°C，发酵48-96h。2、发酵产物检测取发酵液使用GC-7890A(AgilengtTeChnOlOgieS)检测发酵组分变化，检测条件 色谱柱 DB-624(30mX0.32mmX1.8ym，AgilengtTechnologies)；检测器:FID(300°C)；载 气=N2 ；温度模式1阶程序升温，初温55°C，保持8min，速率45°C /min,终温190°C，保持 9min;分流比30 1 ；进样方式自动进样器(AgilengtTechnologies)，进样量0. 2 μ L ； 定量方法内标法，内标物异丁醇(分析纯)。3、实验结果详见图1，以及表4、表5。表4实验组1发酵结果 表5对照组发酵结果 从图1中的A部可以看出，本发明菌发酵液中所产生的混合醇含有异丙醇，从图1 中的B部可以看出，ATCC824菌发酵液中所产生的混合醇中没有异丙醇。从表4、表5的对比可以看出，本发明菌发酵所产生的混合醇中不仅含有异丙醇， 而且混合醇含量以及丁醇含量均都远远高于对照组。 从表4还可以看出，本发明菌株的发酵48h开始产生，在72h发酵液中所含混合醇 以及异丙醇的含量最高。实施例4利用实施例2所构建培养的丙酮丁醇梭菌pll47，发酵生产混合醇。1、将实施例2所构建培养的丙酮丁醇梭菌P1147用6%玉米醪糟培养基与38°C温 箱中静置培养至对数期，作为发酵种子液。2、将发酵种子液按照体积百分比为5%的量接种到7. 5%玉米醪糟培养基中进行 发酵，初始PH值选择5、6(自然pH)、7、8;发酵温度为35°C、38°C、40°C、42°C ；发酵时间为 72h。3、发酵产物检测(同实施例3)结果见下表6:表6混合醇发酵结果 注组合编号方式为pH+温度，如835即发酵Ph值为8，初始温度为35°C的实验组。由表6可以看出本发明所构建培养的菌株，发酵时，PH值为5 7，发酵温度为
35 38°C时都可以产生异丙醇，随着温度升高，达到40°C时，菌株将不产异丙醇。混合醇
(乙醇+异丙醇+ 丁醇)的发酵最佳发酵条件为pH7，发酵温度38°C时产量达到最大，混合
醇比例达到82%。实施例5利用丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)pll47 CGMCC No. 3686生产混
合醇1、将丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)pll47 CGMCC No. 3686 用 6%
玉米醪糟培养基与38°C温箱中静置培养至对数期，作为发酵种子液。2、将发酵种子液按照体积百分比为5%的量接种到木薯粉、甘薯粉、玉米粉、玉米
淀粉等不同的发酵底物进行发酵试验，除玉米粉和甘薯粉外其它底物加入1. 5%的玉米浆
配制为7. 5%的发酵培养基，发酵条件为初始pH7，发酵温度38°C，发酵时间72h。3、发酵产物检测(同实施例3)。结果见下表7:表7 不同底物混合醇发酵结果
从表7可以看出对于淀粉基类底物，该菌均可利用，并且都可以产生异丙醇。最 佳利用底物为玉米粉，其次为甘薯粉；不同底物培养基生产的乙醇、异丙醇、正丁醇、及丙酮 的最终浓度比不同。
权利要求
一种丙酮丁醇梭菌p1147(CGMCCNo3686)。
2.一种丙酮丁醇梭菌pll47(CGMCCNo3686)的构建方法，其特征在于其由丙酮丁醇梭 状芽孢杆菌ATCC824的原生质体融合筛选而成。
3.根据权利要求2所述的丙酮丁醇梭菌pll47(CGMCCNo3686)的构建方法，其特征在于 所述的丙酮丁醇梭状芽孢杆菌ATCC824的原生质体融合筛选包括以下步骤a、原生质体制备离心收集厌氧培养的ATCC824，使用终浓度为4mg/ml 10mg/ml的溶菌酶酶解 30min 40min，55°C 60°C 30min 40min加热致死其原生质体；b、再生、融合将a步工序中致死的ATCC824原生质体，加入5 10mlPEG4000 PEG6000，对原生质 体诱导融合5 lOmin，离心收集，加入终浓度为50 60mM的Ca2+和75mMMg2+溶液，将菌 体混勻，均勻涂布于SRA固体平板上，厌氧箱中培养；C、融合子的筛选洗下再生的梭菌，取接种到液体梭菌培养基中，35 38°C厌氧培养48h 72h，离心 收集菌体，涂布与玉米平板，37°C厌氧培养3 4d，挑取单菌落至6%淀粉醪糟种子培养基 中，37 °C培养24h 48h，取ImL转接8 %淀粉发酵培养基，37°C培养48h 72h，选出发酵速 度快的丙酮丁醇梭菌pll47(CGMCCNo3686)。
4.根据权利要求3所述的丙酮丁醇梭菌pll47(CGMCCNo3686)的构建方法，其特征在于 所述淀粉的培养液为玉米淀粉培养液。
5.根据权利要求4所述的丙酮丁醇梭菌pll47(CGMCCNo3686)的构建方法，其特征在于 所述玉米淀粉培养液其玉米淀粉占培养液质量百分含量的7. 5%。
6.一种丙酮丁醇梭菌pll47CGMCCNo3686，其可用于发酵产生含有异丙醇的混合醇。
7.根据权利要求6所述丙酮丁醇梭菌pll47CGMCCNo3686用于发酵产生含有异丙醇的 混合醇，其特征在于将P1147接种到发酵培养基中，发酵初始菌液浓度为Io9-Io11CfuAiL, 于35 40°C，静止发酵，即可产出含有异丙醇的混合醇。
8.根据权利要求6所述丙酮丁醇梭菌pll47CGMCCNo3686用于发酵产生含有异丙醇的 混合醇，其特征在于采用生长至对数期的丙酮丁醇梭菌Pl 147 (CGMCC No. 3686)，按照体积 百分含量，以5%的接种量接种到所述发酵培养基中。
9.根据权利要求8所述丙酮丁醇梭菌pll47CGMCCNo3686用于发酵产生含有异丙醇的 混合醇，其特征在于所述的发酵温度为35 40°C，发酵初始pH值5 7，发酵时间为48 72h。
10.根据权利要求8所述丙酮丁醇梭菌pll47CGMCCNo3686用于发酵产生含有异丙醇的 混合醇，其特征在于所述的发酵温度为38°C。发酵周期为72h。
全文摘要
本发明公开了一种的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)p1147(CGMCCNo3686)；其是由丙酮丁醇梭状芽孢杆菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC 824的原生质体融合而成。该菌株可以用于发酵产生含有异丙醇的混合醇。本发明所提供的菌株，生长快、繁殖量大、周期短，菌株稳定。用其发酵生产混合醇产量高，质量好。
文档编号C12P7/04GK101845413SQ20101016251
公开日2010年9月29日 申请日期2010年5月5日 优先权日2010年5月5日
发明者冯文亮, 刘力强, 时蕾, 杨丽萍, 杨明, 武芳, 牛昆, 王正品, 石晨光, 范俊辉, 贾娟娟, 邸胜苗, 闫海荣 申请人:华北制药集团有限责任公司