专利名称：：检测老年黄斑变性疾病的试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种检测老年黄斑变性疾病的试剂盒，具体地说检测与老年黄斑变性疾病相关HTRA1基因变异的试剂盒。
背景技术：
：黄斑变性疾病被认为是一类以进行性中心视力下降及黄斑部视网膜色素上皮变性为特征的异质性疾病，是重要的致盲性眼病。黄斑变性包括老年黄斑变性、黄斑营养不良(stargart病、best病、sorsby眼底营养不良等)。老年黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration,AMD)现已成为老年人最主要的致盲性眼病之一，全世界患病人数1000万，我国60-69岁人群AMD患病率为7.77%，70岁以上可达15.33%。目前对于AMD还无有效的治疗方法，其主要原因就是发病机制尚不清楚。近年来研究认为，黄斑变性是一组异质性疾病，遗传因素在其发病机制中起着重要作用。一些与老年黄斑变性(AMD)有相似临床和组织病理表现的其他类型黄斑变性的研究已取得重要进展，比如近年研究发现隐性Stargardt黄斑变性在ABCR基因上有变异；显性Stargardt黄斑变性(STGD3)在ELOVL4基因上有变异；Best黄斑营养不良(BMD)在VMD2基因上有变异；Sorsby眼底营养不良患者在TIMP3基因存在点变异，还有黄斑蝶样萎縮等与Peripherin/RDS基因变异有关。老年性黄斑变性是导致发展中国家不可逆性视力丧失的主要原因，很多研究显示其具有显著的遗传倾向。目前针对不同人群和种族的黄斑变性疾病的研究，正成为国际研究热点之一。国内单基因性黄斑变性疾病及疾病人群和种族相匹配对照人群的基因分析(多基因疾病分析)工作尚未真正系统性开展，亦没有相关的基因谱分析。AMD的前期研究证实补体旁路途径成员的编码基因，包括补体因子H(CFH)以及因子B/C2和个体患病风险有关，尤其是位于染色体lq31上的CFH被认为是AMD主要的风险因子。其他一些关联分析还显示染色体10q26上存在另一个AMD的风险位点。然而其确切致病基因尚不清楚。老年黄斑变性是一种和年龄增长有关的多因素复合作用的眼底病。多发生在45岁以上，年龄越大，患病率越高。是全球成人致盲的首要疾病之一。老年性黄斑变性有时发展很慢，使患者不易察觉，有时却进展很快，迅速剥夺患者视物能力，因而其早期发现和预防显得至关重要。本病真正病因不明，系多因素疾病，影响因素除年龄外，还有人种、性别、代谢等，遗传因素至关重要。临床上分为萎縮型(干性型)和渗出型(湿性型)。干性者，在眼底可见玻璃膜疣，逐歩引起黄斑区变薄，从而影响功能。目前尚无特别有效的方法治疗。湿性者，多引起视力的严重障碍，其视力破坏的原因主要是异常的新生血管在视网膜下生长，引起视网膜出血、水肿及视网膜组织的破坏，最终导致疤痕形成，从而引起视力的丧失。湿性AMD—旦发病，病程迅速，常规治疗的效果不佳，难以大幅度地恢复其已经丧失的视功能。因此，早期诊断发现，及早干预，能更好的延缓病程，减少病人的视力丧失，提高生活质量。目前的AMD诊断于依赖1、多于50岁以上老年人发病，年龄越大，发病率越高；2、双眼先后发生视物变形、视力减退或明显视力障碍；3、眼底有较明显的玻璃膜疣及两型各自的表现；4、眼底荧光血管造影。但是，在病人发病初期缺乏监测诊断指标，可以早期筛选发现AMD高危人群，并实施早期检测和预防，减少其视力损害。
发明内容本发明的目的在于提供检测老年黄斑变性疾病的试剂盒，该试剂盒通过检测来源于待测个体的样本中是否存在HTRA1基因512G—A变异，而在早期监测或诊断老年黄斑变性疾病的发生，进而为临床诊断和治疗提供参考。本发明针对染色体10q26的易感位点进行了AMD和正常对照的基因型分析，发现位于10q26染色体HTRA1基因转录起始点上游512bp处的G—A变异是导致AMD的主要病因，此处等位基因G—A的改变属于单核苷酸序列多态性(SNPrsl1200638)，于2003年在基因组研究时发现报道。然而该变异的意义尚不清楚。本发明全世界首次发现了rsl1200638和AMD的直接关联性。即使相对于包含己知AMD风险基因CHF变异的对照者，分析得到rsl1200638变异的人群归因危险度也达到49.3%。将rsl1200638和CHF基因变异协同分析，得到人群归因危险度达到71.4%。此外，染色体10q26上的rsl0490924G—T变异也和AMD高度相关，并且rsl1200638和rsl0490924处于一个LD。研究结果显示存在G—A变异的AMD患者淋巴细胞和视网膜色素上皮细胞HTRA1的转录翻译水平上调，免疫印迹也显示AMD患者眼睛HTRA1抗体反应强阳性。由此可见，rsll200638的G—A变异引起了HTRAl的表达上调，从而在AMD易感性中占据重要地位。HTRA1基因编码分泌型丝氨酸蛋白酶，其编码产物在小鼠视网膜和视网膜色素上皮细胞均有表达，研究发现HTRA1蛋白参与调控细胞外基质蛋白聚糖降解，促进了基质蛋白降解酶对底物的降解作用，例如胶原酶和基质金属蛋白酶。可以想见，HTRA1的过度表达会破坏Bruch's膜的完整性，使得脉络膜血管易于穿透侵入细胞外基质，形成湿性AMD。此外，TGF-(3在调节细胞外基质降解和血管生成中发挥着重要作用，而HTRA1能够结合并抑制转化生长因子TGF-(3。因此，rsl1200638的G—A上调了HTRA1表达，继而HTRA1蛋白及其下游信号活性分子的改变影响了眼内细胞外基质代谢降解过程以及血管生成，最终参与了AMD的发病进程。根据本发明的一个方面，提供用于检测老年黄斑变性疾病的试剂盒，试剂盒的检测原理为检测与老年黄斑变性疾病密切相关的HTRA1rsl1200638G—A变异位点是否存在，试剂盒中可以包括任选的用于检测HTRA1基因512G—A变异的试剂，例如检测HTRA1基因512G—A突变的试剂和任选的用于扩增HTRA1基因或包含HTRA1基因rsl1200638基因片段的试剂。首先对获得的样本提取DNA并针对HTRA1基因或其512位碱基位点进行扩增，检测方法可以参考本领域技术人员熟知的检测基因点突变位点的方法，例如直接测序法或使用限制性片段长度多态方法或单碱基引物延伸法或Taqman法或芯片杂交等，判断rsll200638位点的等位基因型。优选地，可以在试剂盒中进一歩包括扩增和检测CHF基因Y402H变异的相关试剂，通过检测HTRA1和CHF两个基因的点突变发生的协同作用，由于rsl1200638和rsl0490924连锁度高，检测rsl0490924也具有诊断AMD的效力。可以在试剂盒中加入rsl0490924位点的扩增和检测试剂，进一步提高准确性。根据本发明的另一方面，由于HTRA1基因512G—A突变导致AMD患者的HTRA1转录翻译水平上调和HTRA1蛋白表达水平上调，因此针对HTRA1基因的RNA转录水平和蛋白表达水平设计的试剂盒同样适用本发明。对于检测HTRA1基因的RNA转录水平可以采用例如RT-PCR技术，提取mRNA,检测患者淋巴细胞内的HTRA1基因转录水平而获得检测结果。对于蛋白表达水平的检测，可以通过提取来源于视网膜色素上皮细胞的总蛋白，与HTRA1蛋白抗体进行反应，测定蛋白的表达水平而获得检测结果。更进一步，可以通过制备HTRA1蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体，采用免疫组织化学和荧光原位杂交方法在原位进行蛋白表达水平的检测。本发明提供了检测老年黄斑变性疾病的试剂盒，可用于早期监控和检测AMD高危人群，实施早期预防和治疗，减少其视力损害。本发明试剂盒以HTRA1基因512G—A突变及其相关位点/基因为目标，与AMD的关联度高，协同CHF基因突变的分析，更可提高检测的准确性。图1是Snapshot检测SNPrsl1200638的基因型图；图2是HTRA1基因含rsl1200638位点的测序结果图；图3是免疫组化图；图4是荧光免疫组化图5是定量RT-PCR检测人淋巴细胞中HTRA1mRNA丰度结果；图6为Western检测HTRA1在人视网膜色素上皮细胞(RPE)的表达结果；图7为PCR产物酶切结果。具体实施例方式以下实施例中所用试剂，除非特别说明，均为市售购买。实施例1血液样本收集选取581例老年性黄斑变性(AMD)患者以及309例对照者。患者为临床确诊的AMD，其中392例湿性AMD患者，189例干性AMD患者，对照是符合AMD患者年龄段的大于或等于60岁、非玻璃疣和视网膜色素改变的人群。对所有参加者详细调查其病史以及家族史，并对其进行体格检查和详细的眼科专科检查。在签署知情同意书以后每人采集血样510ml。实施例2包含rsll200638基因的PCR扩增和基因型分析1、提取AMD患者和对照组的血液基因组DNA。2、PCR扩增基因组DNA片段(包含rsl1200638)引物序列正向5'-ATGCCACCCACAACAACTTT-3，反向5，-CGCGTCCTTCAAACTAATCC-3'反应条件95。C3minutes,(94。C30seconds,52°C30seconds,72°C45seconds)*35cycles3、基因分型限制性内切酶鉴定(1)PCR产物采用EagI酶切鉴定G等位基因采用NEB的限制性内切酶EagI(5'...CAGGCCG...3')，反应体系如下3.9ulH2O+5ulPCR产物+lulbuffer3+0.1ulEagl;反应条件如下37°C12houra(2)2%琼脂糖凝胶电泳酶切产物，根据电泳条带判读基因型(AA纯合子为原PCR产物等大小的一条DNA条带；GG纯合子包括两条完全酶切后的产物，其大小之和等于PCR产物大小；AG杂合子是三条条带，其中一条较大的与原PCR产物大小相同，另外两条与完全酶切产物相同)。Snapshot基因分型1.纯化PCR反应产物反应体系PCR产物总体积9^1Exol酶0.1piSAPbuffer0.1jilddH20O.一SAP_2^1共计12(il注PCR产物总体积9pl视PCR反应数量而定，N对引物的PCR，则每对引物获得的产物加样为9pl/N。反应条件37°Clhour;75°C15min2.单碱基引物延伸反应体系纯化产物1^1SNaPshotMultiplexSNaPshotprimer0.2xNDdH20_补足5|al共计5^1反应条件96°Clmin3.纯化反应物反应体系0.7^1SAP/well反应条件37°Clhour;75°C15min4.变性反应体系纯化产物1^1HP_9^1共计lOpl反应条件95°C5min;迅速冰浴冷却5.ABI3100上机读取基因型结果核苷酸序列测定1、胶回收(1)将放有胶回收的管中加入BindingBuffer30ulfangru55。C孵育7min。(待完全溶化)(2)胶溶化后，取出柱管，作好标记，把液体转入柱管中，10000rpm/lmin96。C10sec50°C5sec^25个循环60°C30sec」离心，完毕后倒掉上清液，再加入700ulSpw，静置23min，10000rpm/lmin离心，倒掉上清液。(3)重复上述2操作一次。(4)倒掉上清液后，把柱管1000rpm/lmin空转。(5)加入15ulElutionBuffer到柱中央，静置23min，10000rpm/lmin离心。(6)重复上述操作(7)把洗脱下来的液体轻转至干净管中，作好标记，置于冰箱中。2、测序前扩增反应体系DNAlul5xBuffer1ulPrimer(0.2pm)0.5ulS叫0.5ulddH702ul共计5ul反应条件96。Clmin96。C15sec50°C10sec60°C4sec「29个循环3、第二步纯化NaAc12ulEDTA12ul4、上机测序混匀后lul/well，25ul无水乙醇/wel避光保存15min，4100rpm/30min离心。尽量吸干上清液，70。/。乙醇40ul/well,4100rpm/10min离心.。吸干上清液,室温避光保存15min。加入9ul/we11，避光放置lhour。图1为Snapshot检测SNPrsl1200638的基因型图(绿色峰为A，蓝色为G)。该检査结果为杂合子基因型的个体，其包含一个风险等位基因A;如果是纯合子AA型就表现为绿色单峰，GG则为蓝色单峰。相混合资AA型患病风险显著高于GG型，杂合AG型患病风险介于二者之间。图2为HTRA1基因含rsl1200638位点的测序结果图。箭头所示为该位点信号，杂合子A/G。等位基因型的意义如前所示。实施例3包含rsl0490924基因的PCR扩增和基因型分析1、提取AMD患者和对照的血液基因组DNA。2、PCR扩增基因组DNA片段(包含rs10490924)。引物序列正向5'-TACCCAGGACCGATGGTAAC-3，；反向5，-GAGGAAGGCTGAATTGCCTA-3，。反应条件95。C3minutes,(94°C30seconds,52°C30seconds,72°C45seconds)*35cycles3、基因分型限制性内切酶鉴定(1)PCR产物采用PVUII酶切鉴定G等位基因。采用NEB的限制性内切酶PVUII(5'...CAGACTG...3')，反应体系如下3.9ulH20+5ulPCR产物+lulbuffer2十O.lulPVUII;反应条件如下37°C12hour。(2)2%琼脂糖凝胶电泳酶切产物，根据电泳条带判读基因型(TT纯合子为原PCR产物等大小的一条DNA条带；GG纯合子包括两条完全酶切后的产物，其大小之和等于PCR产物大小；TG杂合子是三条条带，其中一条较大的与原PCR产物大小相同，另外两条与完全酶切产物相同)。实施例410q26上15个SNP的关联性分析结果采用SNaPshot方法，在ABI3130遗传分析仪上进行。表l15个SNP的关联性分析<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>基因组10q26上15SNP的关联性分析结果显示，rsl1200638的意义最显著(P值)，该单核苷酸多态性A风险等位基因和AMD的关联性最高。实施例5rsl0490924和rsl1200638的患病风险度比较首先对442例AMD患者(265湿性AMD和177干性AMD)和309对照进行了基因型分析，比较等位基因出现频率，随后针对581例AMD患者(392例湿性AMD和189例干性AMD),研究rsl0490924和rsl1200638基因型，比较了二者AMD的患病风险度。结果显示rsl04卯924与AMD相关性较高，与之前报道一致。同时发现在15个SNP中rsl1200638为相关性最高的变化位点(p=lxl(r9,ORhet=1.86(1.35，2.56)，ORhom=6.56(3.23,13.31)，Aallele:40.3%incasesversus25.2%incontrols;)。并且rsl0490924和rsl1200638为T一A型的相关性高于单纯rsl0490924(T)，但低于rsl1200638(A)。为了进一歩研究其相关性，追加了139例AMD病人，比较上述两种变异体的差异，结果显示二者与AMD的相关性均升高，(rsl04%924:p=1.2xl0-8，rsll200638:p=1.6xl0-11)，并且rsl1200638仍然是相关度最高的单个变异体(OR^=1.90(1.40，2.58),ORh。m=7.51(3.75，15.04))。此外还对比了rsl1200638和CFH基因rsl061170变异体(位于人染色体lq31的己知的AMD重要患病风险因子)。结果显示rsll200638与AMD高度相关，即使是基于包含CFH等位风险基因(C)的分析(p=5.9xl0_8)。所有的AMD患者的研究结果显示rsl1200638的AA同源等位基因风险性大于AG异源等位基因(ORh。m=7.29(3.18,16.74);ORhet=1.83(1.25，2.68))，证实了等位基因剂量效应。采用等位基因剂量模型，得到rsl1200638的AMD人群归隐危险度为49.3%。rsll200638和CFHY402H的结合模式分析，得到二者相加效应的AMD人群归隐危险度为71.4%(即任意一个位点变异)。实施例6数据分析10q26:采用卡方检验分析等位基因相关性，同时计算优势比和95%可信区间，评价纯合子和杂合子的患病风险度。lq31上CFHY402H和10q26上rs11200638双位点分析基于病例-对照以及双位点基因型组合构建列联表，CFHY402H和rsl1200638双位点基因型组合包括TT/GG，TT/AG，TT/AA，CT/GG，CT/AG，CT/AA，CC/GG，CC/AG禾卩CC/AA。双位点9x2列联表全部采用8自由度卡方检验处理。以正常的纯合子等位基因组合TT/GG为对照，计算每种基因组合的优势比和95%可信区间。采用Levin公式计算人群归因危险度(populationattributablerisks,PAR),反映人群中该基因型的总的患病风险。表2白种人HTRA1rsl1200638禾口CFHrsl061170两个位点的oddsratios结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>结果表明，同时具有HTRA1rsll200638位点AA风险等位基因型和CFHrsl061170位点CC风险等位基因型的个体患病风险度远远大于其他个体(oddsratios为31.52)表3中国人AMD关联分析结果HTRA1(rsl1200638)禾QARMS2(rsl0490924)同CNV(非Drusen)的相关性<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>结果表明，HTRAlrsll200638和中国人AMD高度相关，尤其是危害严重的湿'性AMD。实施例7HTRA1免疫组化AMD患者眼球多聚甲醛固定，含0.3%H202的甲醇灭活内源性过氧物酶活性。HTRA1多抗为R&D公司产品(HTRA1/PRSS11MAb,Clone275615,100UG)，浓度5(ig/ml。采用VectorStainEliteABCkit试剂盒，采用NikonEclipse80i显微镜采集信号。免疫组化结果如图3，荧光免疫化学结果如图4。实施例8定量RT-PCR检测人淋巴细胞中HTRAlmRNA丰度采用实时定量PCR系统(Opticon;MJResearch,Watertown,MA)反映HTRA1在AMD患者淋巴细胞内的转录水平。1、采用RNeasy试剂盒(Qiagen)提取患者外周血液淋巴细胞总RNA。2、使用QuantiTectSYBRGreenRT-PCRkit(Qiagen)RT-PCR一歩法扩增HTRA1mRNA，引物正向5，-AGCCAAAATCAAGGATGTGG-3，；反向5，-GATGGCGACCACGAACTC-3，。RNA用量100ng。采用0—400ng总RNA,平行扩增看家基因GAPDH得到标准曲线。引物正向5，-CTGCACCACCAACTGCTTAG-3，；反向5，陽GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'。3、计算AA基因型相对于GG基因型的HTRA1RNA丰度。结果见图5。实施例9Western检测HTRA1在人视网膜色素上皮细胞(RPE)的表达提取四位AA基因型的湿性AMD患者和六位GG基因型的正常对照的RPE的总蛋白，取25吗进行SDS-PAGE电泳，抗体浓度1.5pg/ml进行Westernblotting。HTRA1蛋白表达水平以卩-actin为内参。采用SPSSversion13.0进行独立样本t检验分析数据，计算其统计学意义。结果如图6，结果表明，AA基因型的HTRA1蛋白表达是GG基因型蛋白表达的约1.8倍。实施例10试剂盒检测本试剂盒用于1、AMD患者的早期诊断和分型参考；2、AMD易感人群的基因检测和风险评估。[试剂]试剂盒清单试剂可进行50份测定.成分PCR反应混合液ml(l瓶)450ulEag-I限制性内切酶ul幽5ul10x酶切Bufferul(l瓶)lOOulControlDNA-1ml(l瓶)A/A基因型的对照DNAControlDNA-2ml(l瓶)G/G基因型的对照DNAControlDNA陽3ml(l瓶)A/G基因型的对照DNArsll200638基因的PCR扩增和基因型分析l取样取患者全血(EDTA抗凝)lml，提取AMD患者的血液基因组DNA。2.PCR操作引物设计PCR扩增基因组DNA片段(包含rsl1200638)引物序歹U:正向5'-ATGCCACCCACAACAACTTT-3，反向5，-CGCGTCCTTCAAACTAATCC-3，3.加样体系取出lul基因组DNA(浓度为50100ng)加入反应混合液9ul4.反应条件1、95。C预变性5minutes2、95。C变性30seconds3、52。C退火30seconds4、72。C延伸45se謹ds5、步骤24共35个循环6、4。C保存5.PCR产物采用EagI酶切鉴定等位基因反应体系3.9ulH20+5ulPCR产物+10xBufferlul+0.1ulEag-I;反应条件37"C酶切12小时；2%琼脂糖凝胶电泳，实验结果如图7，泳道1为AA纯合子样品DNA的酶切结果，泳道2为GG纯合子样品DNA的酶切结果，泳道6为AG杂合子的酶切结果。权利要求1、用于检测老年黄斑变性疾病的试剂盒，包括任选的用于检测HTRA1基因rs11200638变异用于AMD筛选诊断的相关试剂。2、权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测HTRAl基因512G—A变异的试剂；以及任选的用于扩增包含HTRAl基因rsl1200638基因片段的试剂。3、权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述检测HTRAl基因512G—A变异的试剂为测序用试剂。4、权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述检测HTRAl基因512G—A变异的试剂为限制性片段长度多态方法用试剂。5、权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述检测HTRAl基因512G—A变异的试剂为Snapshot试剂。6、权利要求2所述的试剂盒，其特征在于进一歩包括检测CHF基因Y402H基因变异的试剂，和/或任选的用于检测10q26上rsl04卯924变异的试剂。7、用于检测老年黄斑变性疾病的试剂盒，包括任选的检测HTRAl蛋白表达用于AMD筛选诊断的试剂。8、权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述的检测HTRAl蛋白表达的试剂包括HTRAl蛋白的抗体；以及任选的检测HTRAl蛋白表达量的试剂。9、用于检测老年黄斑变性疾病的试剂盒，包括任选的检测HTRAlmRNA用于AMD筛选诊断的试剂。10、权利要求9所述的试剂盒，其特征在于所述检测HTRAlmRNA的试剂为定量RT-PCR试剂。全文摘要本发明提供了检测老年黄斑变性疾病的试剂盒，可用于早期监控和检测AMD高危人群，实施早期预防和治疗，减少其视力损害。本发明试剂盒以HTRA1基因512G→A突变及其相关位点/基因为目标，与AMD的关联度高，协同CHF基因突变的分析，更可提高检测的准确性。文档编号C12Q1/68GK101173314SQ20071016286公开日2008年5月7日申请日期2007年10月16日优先权日2006年10月18日发明者康张,杨正林,芳鲁申请人:四川省医学科学院(四川省人民医院)