专利名称：适于pcr反应的快速提取食用菌基因组dna的方法
技术领域：
本发明涉及一种快速提取食用菌基因组DNA的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
近年来，随着食用菌产业的迅速发展，对于食用菌的基础研究已深入到分子水平。 一方面各种DNA分子标记技术已应用到食用菌的分类鉴定和遗传多样性研究中，另一方面 食用菌基因工程的研究日益深入，从各种食用菌中快速提取基因组DNA是这些工作的前 提。食用菌的细胞壁及染色体上结合有复杂的多糖和丰富的蛋白质，且其菌丝体通常 会产生色素，致使制备的基因组DNA中含有不同数量的多糖、蛋白质、色素以及成分不明的 胞壁物质，这些物质的存在会影响后续实验。
目前已有多种从食用菌的菌丝体及子实体中提取DNA方法的报道，提取方法步骤 大体相似，区别在于破壁方法的不同。常用的破壁方法主要有液氮研磨法、石英砂或玻璃珠 机械破壁法、CTAB法和氯化苄法等。最初用于细菌基因组DNA的提取的CTAB法，利用在一 定的盐浓度下，DNA与多糖在CTAB溶液中溶解度不一样而达到去多糖的目的。自将CTAB法 引入植物分子系统学研究领域，并在其后的研究中被逐步改进。但是改方法步骤多，操作繁 琐，费时费力。此后改进了的CTAB法由于大都不能避免液氮研磨这一步骤，在处理的样品 多的时候不占优势。国内多采用建立的氯化苄提取法，这一方法具有简便易行的优点，但也 存在提取DNA质量不够稳定，对分散性不好的材料提取效果不好等不足。近年来，很多研究 者针对如何快速提取食用菌的基因组做了大量的研究，孙立夫等(菌物学报，2009年28卷 第2期299-302)采用带有无菌塑料钻头的小型手动电钻来研磨成功提取了蜜环菌总DNA， 该方法虽然避开了使用液氮，但仍然有费时的缺点；赵春喜等(安徽农业科学，2008年36 卷第28期12122-12200)尝试采用改进的TRIS饱和酚一步法从各种食用菌子实体中提取 高质量DNA的简捷方法，获得的食用菌DNA质量较好，能够满足PCR等后续分子生物学试 验，但此方法中仍然采用了可能对人和环境产生影响的酚仿抽提的方法；杨同文等(生物 技术，2009年19卷第1期32-34)探索出一种简捷、高效CTAB结合DNA凝胶试剂盒的方 法，省去了苯酚_氯仿的抽提，免去了 DNA的晾干和再溶解等步骤将CTAB的裂解功能与胶 回收试剂盒的纯化功能有机结合，优化组合操作步骤，成功提取了平菇、香菇、金针菇子实 体DNA，但该方法，成本较高。总之，目前提取食用菌基因组DNA的提取方法普遍存在操作繁琐、提取时间长、成 本较高、毒性较大等不足之处。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种提取食用菌基因组DNA的方法，用该方法 提取食用菌的基因组DNA时间短、速度快、操作简单、成本低、提取效率高，对环境无污染， 提取的DNA质量稳定，适于PCR反应。
本发明提供的技术方案是一种适于PCR反应的快速提取食用菌基因组DNA的方 法，包括以下步骤(1)取材取菌丝体或子实体于离心管中；(2)加入少量石英砂或玻璃珠后，用研磨杵对菌丝体或子实体进行研磨至糊状；(3)加入抽提缓冲液，涡旋振荡l-3min ；(4)水浴 10_15min ；(5)加入乙酸铵溶液，冰中放置8-lOmin ；(6)离心10，000-13，000r/min 离心 10_15min ；(7)取上层水相至另一离心管中，加入冰预冷的异丙醇或无水乙醇，颠倒混 勻，-20 0C _4°C 放置沉淀 15-30min ；(8)离心10，000-13，000r/min 离心 10_13min ；(9)弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀，风干；(10)加入ddH20和RNaseA溶液中，完全溶解沉淀，_20°C保存。上述第(1)步取材，菌丝体取气生菌丝；子实体取菌盖部位，将取好的材料置于 1. 5mL离心管中。上述第(3)步中，加入0. 5mL的抽提缓冲液，所述抽提缓冲液为200mmol/L Tris-HCl，250mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA 禾Π 2% SDS 的混和液，涡旋振荡 2min。所述Tris-HCl 的 pH 值为 8. 5。上述第(4)步中，水浴温度为65°C。上述第(5)步中，水浴后立即加入浓度为lOmol/L的乙酸铵溶液200 μ L。上述第(7)步中，加入异丙醇或无水乙醇的体积为上层水相体积的0. 5-0. 6倍，温 度为0-4°C。上述第(7)步中，放置沉淀的温度为0°C以下，例如-20°C。根据权利要求1所述的方法，其特征在于第(9)步中，用70%乙醇洗涤沉淀两次。所述食用菌为黑平王、美味牛肝菌、香菇、金针菇、血红铆钉菇、紫花脸香蘑。本发明从食用菌菌丝和子实体中快速提取基因组DNA的方法，是用研磨杵结合石 英砂研磨的破壁方法、乙酸铵沉淀获得DNA样品，此方法有如下优点(1)所需用于提取总DNA的材料的量少、容易获得，既可以是斜面或平皿上的菌 丝，也可以是子实体，省去了菌丝的活化及培养时间，也为现有栽培品种的快速鉴定及野生 食用菌资源分子水平上的多样性的研究提供了新思路，为食用菌的分子生物学研究提供一 种高效可行的分子技术途径。(3)提取过程中，避免了使用苯酚，减少了对人体和环境造成危害。(4)避免了使用液氮研磨，降低了成本。(3)只需在离心管中用研磨杵研磨结合石英砂漩涡振荡研磨即可，在提取大量样 品的基因组时占优势，省时省力，可以在1个半小时内完成DNA提取。(4)提取的基因组DNA效率高、完整，糖和蛋白含量低，可直接用于PCR反应，足以 满足PCR扩增。(5)相对其他方法而言，所用的设备和药品相对较少，经济节约。
(6)本发明方法不仅应用于食用菌基因组的提取，也适用于其他丝状真菌菌丝体 基因组DNA的提取，例如木霉、曲霉等的基因组DNA的提取。
图1为本发明方法提取的黑平王的基因组的电泳图，其中，M :lkb ρIusDNA marker ；1 以黑平王子实体为材料提取的基因组DNA ；2 以黑平王菌丝体为材料提取的基 因组DNA。图2为ITS片段的扩增检测黑平王基因组DNA为模板的质量电泳图，其中，M :lkb plus DNA marker ；1 以黑平王子实体为材料提取的基因组DNA为模板进行ITS-PCR的产 物；2 以黑平王菌丝体为材料提取的基因组DNA为模板进行ITS-PCR的产物。
具体实施方式
下面通过具体实施方式
的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限 制，仅仅作示例说明。提取平菇的基因组DNA的方法如下一、材料平菇(Pleurotus ostreatus，黑平王)为北京市农林科学院植物保护环境保护研 究所食用菌研究室保存菌种。二、试剂抽提缓冲液200mmol/LTris-HCl (ρΗ8· 5)，250mmol/L NaCl, 25mmol/LEDTA, 2 % SDS ； 10mol/L 乙酸铵；异丙醇；70% 乙醇；10mg/mL RNaseA0三、提取基因组DNA提取基因组DNA的具体步骤如下(1)取材取菌丝体或子实体于1. 5mL的离心管中。取菌丝体材料刮取斜面或平 皿培养基上的少量菌丝，尽量多取气生菌丝；取子实体材料直接取少量子实体，尽量取菌 盖部位。(2)加入少量石英砂后用研磨杵对菌丝体或子实体进行研磨至糊状。(3)加入0. 5mL的抽提缓冲液，涡旋振荡2-3min。(4) 65°C水浴 IOmin。(5)加入200 μ L的乙酸铵溶液，冰中放置8min。(6) 12，000r/min 离心 lOmin。(7)取上层水相至另一离心管中，加入0. 5-0. 6倍体积的冰预冷的异丙醇，颠倒混 勻，-20°C放置 15min。(8) 12，000r/min 离心 lOmin。(9)弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀两次，风干。(10)加入20 μ L的ddH20和1 μ L的RNaseA溶液中，完全溶解沉淀，_20°C保存。四、对上述提取的DNA质量进行电泳检测1、琼脂糖凝胶电泳检测取提取的菌丝体和子实体的基因组DNA样品各3 μ L进行0. 8%的琼脂糖凝胶电泳20min，EB染色，凝胶成像系统中观察提取DNA的质量并照相记录。结果如图1所示，所提取的DNA样品大小均在IOkb以上，条带明亮清晰，无明显后拖尾现象，说明通过本发明方 法能较完整地从食用菌的菌丝体和子实体中分离获得完整基因组DNA，且提取产物中含多 糖或蛋白较少。整个提取时间短，简便易行。2、用ITS-PCR扩增检测所提取的DNA质量选 取 ITSl (5，- tccgtaggtgaacctgcgg-3，)和 ITS4(5，-tcctccgcttattgatatgc-3')为引物，以所提取的基因组DNA为模板进行PCR扩 增:95°C 5min (预变性)；30 个循环(95°C 30s, 58°C lmin，72°C 30s) ；72°C IOmin ；降至 4°C 结束。反应体系为50yL。然后进行电泳检测。结果如图2所示，所得产物片段大小700bp 左右，提取的DNA完整，糖和蛋白含量低，与预期结果相一致，表明该方法提取获得的食用 菌DNA质量较好，能够满足基于PCR反应的后续分子生物学试验。图2ITS片段的扩增检测黑平王基因组DNA为模板质量。M=Ikb ρIusDNA marker ； 1 以黑平王子实体为材料提取的基因组DNA为模板进行ITS-PCR的产物；2 以黑平王菌丝 体为材料提取的基因组DNA为模板进行ITS-PCR的产物。
权利要求
一种适于PCR反应的快速提取食用菌基因组DNA的方法，其特征在于包括以下步骤(1)取材取菌丝体或子实体于离心管中；(2)加入少量石英砂或玻璃珠后，用研磨杵对菌丝体或子实体进行研磨至糊状；(3)加入抽提缓冲液，涡旋振荡1-3min；(4)水浴10-15min；(5)加入乙酸铵溶液，冰中放置8-10min；(6)离心10,000-13,000r/min离心10-15min；(7)取上层水相至另一离心管中，加入冰预冷的异丙醇或无水乙醇，颠倒混匀，-20℃-4℃放置沉淀15-30min；(8)离心10,000-13,000r/min离心10-13min；(9)弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀，风干；(10)加入ddH2O和RNaseA溶液中，完全溶解沉淀，-20℃保存。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于第(1)步取材，菌丝体取气生菌丝；子实 体取菌盖部位，将取好的材料置于1. 5mL离心管中。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于第(3)步中，加入0.5mL的抽提缓冲液， 所述抽提缓冲液为 200mmol/L Tris-HCl, 250mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA 和 2% SDS 的混 和液，涡旋振荡2min。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述Tris-HCl的？11值为8.5。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于第⑷步中，水浴温度为65°C。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于第(5)步中，水浴后立即加入浓度为 10mol/L的乙酸铵溶液200 ii L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于第(7)步中，加入异丙醇或无水乙醇的体 积为上层水相体积的0. 5-0. 6倍，温度为0-4°C。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于第(7)步中，放置沉淀的温度为0°C以下。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于第(9)步中，用70%乙醇洗涤沉淀两次。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述食用菌为黑平王、美味牛肝菌、香 菇、金针菇、血红铆钉菇、紫花脸香蘑。
全文摘要
本发明提供一种适于PCR反应的快速提取食用菌基因组DNA的方法，该方法包括取材；研磨；加缓冲液振荡后水浴；加乙酸铵溶液后放置沉淀；离心后取上清液口加冰预冷异丙醇，混匀，放置沉淀；离心；洗涤沉淀，风干；溶解沉淀，保存等步骤。用本发明方法提取食用菌的基因组DNA时间短、速度快、操作简单、成本低、提取效率高，对环境无污染，提取的DNA质量稳定，适于PCR反应。
文档编号C12N15/10GK101831422SQ20101016284
公开日2010年9月15日 申请日期2010年4月28日 优先权日2010年4月28日
发明者刘宇, 孟莉莉, 王兰青, 王守现, 耿小丽, 许峰, 赵爽, 魏民 申请人:北京市农林科学院