专利名称：水稻干旱诱导型启动子Oshox24P的鉴定和利用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域。涉及一种植物逆境特异诱导型启动子的分离 鉴定和应用。通过分离和鉴定一个水稻干旱诱导型基因的启动子，可以将其应用于植物的 基因工程中，以达到植物遗传改良特别是提高植物抗旱性的目的。
背景技术：
干旱一直是造成作物减产的重要原因之一，并且随着全球环境恶化、气候异常将 日益危害着粮食生产安全。对于中国这样一个淡水资源短缺的国家，这一点更为明显。提 高植物抗旱性一直以来都是一个长期而艰巨的任务。一方面转基因已经成为研究功能基 因组学的有效手段，另一方面，通过转基因途径改良植物抗逆性近年来正逐步得到可行性 论证和普遍接受。已经有大量文献报道通过在植物中超量表达逆境应答相关基因能够在 一定程度上提高植物的抗逆性(Saijo 等，Over-expression ofa single Ca2+_d印endent proteinkinase confers both cold and salt/drought tolerance on rice plants. Plant J 23 :319-327,2000 ；Zhang 等，Twocysteine proteinase inhibitors from Arabidopsis thaliana, AtCYSa and AtCYSb, increasing the salt, drought, oxidation and cold tolerance. Plant Mol Biol 68 :131-143, 2008 ;Hou 等，A homo log of human ski-interactingprotein in rice positively regulates cell viability and stress tolerance. Proc Natl Acad Sci 106 :6410_6415,2009 ;Ma 等，Enhanced tolerance to chilling stress in 0sMYB3R_2transgenic rice is mediated by alteration in cell cycleand ectopic expression of stress genes.PlantPhysiol 150:244-56,2009)。 但是报道中的这些超量表达通常用的都是组成型启动子，尽管组成型启动子超量表达效 应高，但是通常会伴随着负面效应，如对植物产生毒害或负担或者使转基因植株致死等 (Shavindra 等,Transgenic approaches to increase dehydration-stresstolerance in plmts.Mol Breed 5:493_503，1999)。尽管已经有文献报道从植物中分离出受逆 境应答的启动子(Yamaguchi-Shinozaki 等，Characterization ofthe expression of a desiccation-responsive rd29gene ofArabidopsis thaliana and analysis of its promoter in transgenic plants. Mol Gen Genet 23 :331_340，1993；Kasuga 等，A combination ofthe Arabidopsis DREBlA gene and stress-indueibIe rd29A promoter improved drought—and low-temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer. Plant Cell Physiol 45 :346_350，2004 ;Xiao 等，Over-expression of a LEA gene in rice improves drought resistance under the field conditions. Theor Appl Genetll5 :35_46，2007)，但是在重要粮食作物水稻中尚且少有很强的逆境诱导型启动子 应用于植物基因工程。HD-Zip (homeodomain-leucine zipper)基因是一类植物中特有 的转录因子基因家族，在植株的生长发育和逆境应答中发挥着多种功能(Scarpella等， A role for the rice homeobox gene Oshoxl in provascular cell fatecommitment. Development 127 :3655_3669，2000 ；Agalou 等，A genome-wide survey ofHD-Zip genesin rice andanalysis of drought-responsive family members. Plant Mol Biol 66: 87-103,2007 ；Dai Functional analysis ofrice H0ME0B0X4(0shox4) gene reveals a negative function in gibberellin responses. Plant Mol Biol66 :289_301，2007 ;Itoh 等，Developmental role and auxin responsiveness of Class III homeοdomain leucine zippergene family members in rice. Plant Physiol,147 (4) : 1960-1975，2008)。本发明是鉴定一个受干旱强烈诱导的水稻HD-Zip转录因子基因的启动子，通过 启动子活性定量分析表明，可以将该启动子用于抗逆性相关基因在水稻等作物中的表达， 从而有效地提高植株的抗逆境性能。
发明内容
本发明的目的是克隆、鉴定一个受干旱胁迫诱导表达的植物内源启动子，并利用 该启动子构建抗旱相关基因表达载体，通过遗传转化方法达到控制目标基因特异地受逆境 表达的目的。本发明通过以下技术方案实施首先是分离受干旱强烈诱导表达的候选基因的启动子。所选择的候选基因是水 稻内源基因HD-Zip转录因子家族的一员，命名为0shox24 (Adamantia等，A genome-wide survey ofHD-Zip genes in rice andanalysis of drought-responsive family members, Plant Mol Biol 66 :87_103，2008) (Κ0ΜΕ 注释号 AK063685)。该基因在水稻品种“中 旱5号”、“中花11”和“珍汕97”的苗期干旱胁迫中均受到强烈的上升诱导表达(如图 2)。所分离的该基因的启动子来源于水稻品种“中旱5号”，命名为0shox24P。0shox24P 启动子是具有附图1中碱基第1-1918位的序列；在88-92、684-688、895-899、957-961、 1480-1484、1550-1554、1681-1685、1820-1824碱基位点含有与逆境相关的ABA应答元 件 ABRELATERD1(Simpson 等，Two different novelcis-acting elements of erd 1, a cIpA homologous Arabidopsis gene function in induction by dehydration stress anddark-induced senescence.Plant J 33 259~270,2003 ；Nakashima 等， Transcriptional regulation of ABI3-andABA_responsive genes including RD29B and RD29A in seeds, germinating embryos, and seedlings of rabidopsis. Plant Mol Biol. 60 :51_68，2006)，在448-455碱基位点含有逆境相关的ABA应答元件 ABRE0SRAB21(Marcotte Abscisic acid-responsive sequences from the Em gene of wheat. Plant Cell 1 :969_976,1989 ;Busk 等，Regulation ofabscisic acid-induced transcription, Plant Mol Biol 37 :425_435,1998 ；Skriver 等，Geneexpression in response to abscisic acid and osmotic stress, Plant Cell 2 :503_512,1990),在 415-421、956-962、1233-1239、1680-1686、1789-1795、1819-1825 碱基位点含有逆境相
ΑΒΑABRERATCAL (Kaplan φ, Rapid Transcriptome Changes Induced by
Cytosolic Ca2+Transients Reveal ABRE-RelatedSequences as Ca2+-Responsive cis Elements in Arabidopsis. Plant Cell 18 :2733_2748，2006)。本发明所提供的启动子0shoX24P区域含有多个与逆境相关的顺式作用元件(如 附图1所示)，能特异性地对逆境和脱落酸(ABA)起应答反应。申请人利用0shox24P启动 子构建的GUS表达载体(如附图3所示)转化水稻受体品种中花11，可以在转基因植株受到逆境胁迫时强烈地诱导报告基因GUS的表达(如附图4所示)。本发明的效果详见具体 实施方式。详细的技术方案如下所述一种分离出的水稻DNA分子，其核苷酸序列如SEQ IDNO 1和附图1所示，其中启 动子0shox24P包含附图1所示的序列中的1-1918位碱基的核酸序列。所述的一种分离的DNA分子，其特征在于区域内除基本启动子元件外 (TATA-box)，还包含多个逆境应答顺式作用元件(ABRELATERDUABRE0SRAB2UABRERATCAL) 的组合。所述的0shoX24P启动子全部或部分序列构建的水稻表达载体。
所述的0shoX24P启动子全部或部分序列构建水稻表达载体，通过遗传转化培育 改良植物的方法。所述的0shoX24P启动子全部或部分序列构建水稻表达载体，通过遗传转化培育 的抗逆植物材料。所述的抗逆植物的材料是指植株、种子或细胞无性系。按照以上的技术方案，很显然，申请人或申请人以外的其他人可以利用本发明所 提供的0shox24P启动子构建抗逆相关基因的表达载体转化植物以提高植物的抗逆性。受 体植物可以是包括水稻、小麦、玉米等在内的禾谷类作物，当然也可以是包括其他一些重要 的经济作物，例如玉米、棉花、油菜或番茄。
序列表SEQ ID NO 1是本发明克隆的水稻启动子0shox24P的核苷酸序列。图1 是本发明克隆的0shox24P启动子序列。下划线序列为扩增0shox24P启动 子所用的引物序列。阴影显示的是基本启动子元件序列。逆境应答ABRE元件核心序列用 红色并加波浪线表示。图2 显示的是0shox24基因在苗期水稻品种“中旱5号”、“中花11”、“珍汕97” 中，当植株受到干旱胁迫时能够被强烈地诱导表达。图3 显示的是本发明构建的表达载体pCAMBIA1391Z-0shoX24P表达载体。该载 体含潮霉素抗性筛选基因(HRG)，启动子0shoX24P被融合到⑶S基因5’端非翻译区。图4 显示的是0shox24P启动子控制下的⑶S基因在干旱胁迫处理下的⑶S活性。 CK是P1391Z空载体转化的中花11，作为对照家系，TG1、TG2和TG3是pl391Z_0shox24P转 化中花11得到的3个独立的转基因阳性家系。4个时间点依次是d0、干旱胁迫前；dl、叶 片微卷；d2、叶片半卷；d3叶片全卷。图5 显示的是0shox24P启动子控制下的⑶S基因在200mM NaCl胁迫处理 下的⑶S活性。CK是P1391Z空载体转化的中花11，作为对照家系，TGU TG2和TG3是 pl391Z-0shoX24P转化中花11得到的3个独立的转基因阳性家系。4个时间点分别是胁迫 0h、3h、6h、24h。图6 显示的是0shox24P启动子控制下的⑶S基因在IOOmM ABA胁迫处理下 的⑶S活性。CK是P139IZ空载体转化的中花11，作为对照家系，TGl、TG2和TG3是 pl391Z-0shoX24P转化中花11得到的3个独立的转基因阳性家系。4个时间点分别是胁迫 0h、0. 5h、3h、24h。
图7 显示的是0shox24P启动子控制下的⑶S基因在4°C冷胁迫处理下的⑶S活 性。CK是P1391Z空载体转化的中花11，作为对照家系，TG1、TG2和TG3是pl391Z_0shox24P 转化中花11得到的3个独立的转基因阳性家系。4个时间点分别是胁迫0h、6h、12h、24h。
具体实施例方式实施例1、0shox24P启动子分离和鉴定通过水稻品种“中旱5号”(由中国上海农业科学院提供的商业品种)的干旱诱 导基因表达谱分析，发现了一个受干旱强烈诱导(干旱胁迫后期表达量提高30倍以上) 的基因，其 TIGR(http://rice, plantbiology. msu. edu/) ID 为 L0C02g43330，被命名为 0shox24(Adamantia 等，Agenome-widesurvey of HD-Zip genes in rice and analysis ofdroug ht-responsive family members, Plant Mol Biol 66 :87_103，2008)，)(寸/S白勺 BAC 克隆号为 AP004868，在KOME数据库(http//cdnaOl. dna. affrc. go. jp/cDNA/)中对应的全 长 cDNA 编号为 AK063685。下一步就是分离该基因的启动子。具体步骤如下在NCBI (http://www.ncbi. nlm. nih. gov/)找到该基因对应的粳稻“日本晴”的基因组序列(AP004868)并选取该基因 的转录起始位点上游2. 5Kb的范围作为候选启动子区域进行PCR扩增。设计引物0shox2 4P-F(5，-ATAGGATCCAGACGAGAAAGGAGTGCC-3，)和 0shox24P_R(5，-ACAGGATCCCGAATGTAAGAC CAGAGCA-3’ )，并在引物5’端添加限制性酶切位点BamHI (用斜体加下划线表示，酶切位点 前的三个碱基为保护碱基)。首先利用引物0shoX24P-F和0shoX24P-R以“中旱5号”基 13组 DNA (CTAB ^去才由■，Zhang 等，genetic diversity and differentiation of indicaan japonica rice detected by RFLP analysis, 1992,Theor Appl Genet,83,495-499)为模 板进行扩增，反应体系为20uL GC buffer I体系(购自宝生物工程(大连)有限公司，即 TaKaRa 公司)，反应条件是94°C预变性 5min ；94°C 30sec，55°C 30sec，72°C 2mim, 32 个循 环；72°C延伸7min。PCR产物连入pGEM-TEasy载体上，筛选阳性克隆并测序(ABI3730测序 仪，Applied Biosystem，测序在国家植物基因中心[武汉]完成)，结果证实所扩增序列 为预期的0shox24P启动子序列，其包含多个干旱、ABA逆境应答顺式作用元件(如图1)。实施例2、检测水稻内源基因0shox24的诱导表达以水稻品种“中旱5号”、“中花11”、“珍汕97”为材料，种在大棚的沙土中，3叶 期时进行断水干旱胁迫。胁迫前取do时间点样品，干旱至叶片微微卷起时取dl时间点样 品，叶片半卷时取d2时间点样品，叶片全卷时取d3时间点样品。总RNA采用TRIZOL试剂 (购自Invitrogen公司)提取(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书)，利用反转录酶 SS III (购自Invitrogen公司)将其反转录合成cDNA (方法根据Invitrogen公司反转录酶 试剂说明书)。以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物(5’-ATCACCTAGACTACTTGGGCGG-3’ 禾口 5，-TTGGCCATATCTCCCACAGATC-3’ )对0shox24基因进行特异的PCR扩增(扩增产物长 78bp)。同时用引物(5，-TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3，和 5，-TGCACAATGGATGGGTCAGA-3，) 对水稻Actinl基因做特异扩增(扩增产物长76bp)，以作为内对照进行定量分析。反应条 件为95°C 10sec,95°C 5sec,60°C 34seC，40个循环。反应过程中进行荧光检测实时定量分 析。结果表明该基因在水稻品种“中旱5号”、“中花11”、“珍汕97”的苗期干旱胁迫中均受 到强烈的上升诱导表达，相应的上升倍数分别约为50倍、100倍、160倍(如图2)。
实施例3、0shox24P启动子逆境诱导活性鉴定本发明的实施方案就是构建0shox24P启动子的GUS基因表达载体并转化到水稻 品种“中花11”(来自中国农业科学院作物研究所商业品种)中，定量地检测0shox24P启 动子的逆境包括干旱、高盐、ABA、冷胁迫的诱导表达活性。具体操作如下首先将实施例1中分离的0shox24P启动子的PCR产物连入pGEM-T Easy载体 (购自Promega公司)，转化大肠杆菌DH5 α (购自Promega公司)并获得阳性克隆。通 过BamHI单酶切从pGEM_T Easy阳性克隆上回收0shox24P再将其连接到⑶S表达载体 P1391Z (来自CAMBIA公开使用的载体，载体含有GUS报告基因)。酶切验证阳性克隆并检 测插入方向正确后，通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系导入到水稻品种“中花11中”，经 过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因植 株。农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系主要应用Hiei等人报道的方法(参见 Efficienttransformation of rice, Oryza sativa L，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries oftheT-DNA,1994, Plant Journal 6 271-282) 并在其基础上进行改良优化。同时将不连接外源片段的P1391Z空载体转化水稻品种“中花 11中”作为对照。主要步骤和试剂如下(1)试剂和溶液缩写本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下 6-BA(6-BenzyIaminoPurine,6-节基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin,羧苄青霉素)； KT (Kinet in, Mij] Μ) ；NAA (Napthalene acetic acid, ΜΖλΜ) ； IAA(Indole-3-acetic acid,吲哚乙酸)；2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2,4- 二氯苯氧乙酸)； AS(Acetosringone, ZilitT#Sll ) ；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate,S )； 服(办81~011^(^1^，潮霉素)；DMSO (Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max (N6 大量成分 溶液)；N6mix (N6微量成分溶液)；MSmax (MS大量成分溶液)；MSmix (MS微量成分溶液)。(2)主要溶液配方1)N6培养基大量元素母液[10倍浓缩液(IOX)]的配制硝酸钾(KNO3)28. 3g磷酸二氢钾(KH2PO4)4. Og硫酸铵((NH4)2SO4)4. 63g硫酸镁(MgSO4· 7H20)1. 85g氯化钙(CaCl2· 2H20)1. 66g逐一溶解，然后室温下定容至IOOOml。2)N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制碘化钾(KI)0. 08g硼酸(H3BO3)0. 16g硫酸锰(MnSO4· 4H20)0. 44g硫酸锌(ZnSO4· 7H20)0. 15g室温下溶解并定容至1000ml。3)铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X)的配制准备800ml双蒸水并加热至70°C，加入乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA · 2H20) 3. 73克，充分溶解后在70°C水浴中保持2小时，定容至IOOOml，4°C保存备用。4)维生素贮存液(100X)配制烟酸(Nicotinicacid)0. Ig维生素Bl (Thiamine HCl)0. Ig维生素B6(Pyridoxine HCl)0. Ig甘氨酸(Glycine)0. 2g肌醇(Inositol)IOg
加水定容至1000ml，4°C保存备用。5)MS培养基大量元素母液(IOX)的配制硝酸铵(NH4NO3)16. 5g硝酸钾19. Og磷酸二氢钾1. 7g硫酸镁3. 7g氯化钙4.4g室温下溶解并定容至1000ml。6)MS培养基微量元素母液(100X)的配制碘化钾0. 083g硼酸0. 62g硫酸锰0. 86g钼酸钠(Na2MoO4· 2H20)0. 025g硫酸铜(CuSO4· 5H20)0. 0025g室温下溶解并定容至1000ml。7) 2，4-D 贮存液(lmg/ml)的配制秤取2，4-D IOOmg,用Iml IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶解完全 后定容至100ml，于室温下保存。8)6_BA 贮存液(lmg/ml)的配制秤取6-BA IOOmg,用Iml IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶解完全后 定容至100ml，室温保存。9)萘乙酸(NAA)贮存液(lmg/ml)的配制秤取NAA lOOmg，用Iml IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶解完全后 定容至100ml，4°C保存备用。10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(lmg/ml)的配制秤取IAA lOOmg，用Iml IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶 解完全后定容至100ml，4°C保存备在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁 (FeSO4· 7H20) 2. 78g。在另一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水用。11)葡萄糖贮存液(0. 5g/ml)的配制
秤取葡萄糖125g，然后用蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4°C保存备用。12) AS贮存液的配制秤取AS 0. 392g，DMSO 10ml，分装至1. 5ml离心管内，4°C保存备用。
13) IN氢氧化钾贮存液
秤取氢氧化钾5. 6g，并用蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。(3)用于水稻遗传转化的培养基配方1)诱导培养基N6max 母液(IOX)IOOmlN6mix 母液(100X)IOmlFe2+EDTA 贮存液(100X)IOml维生素贮存液(100X)IOml2，4_D 贮存液2.5ml脯氨酸(Proline)0. 3gCH0. 6g蔗糖(Sucrose)30gPhytagel3g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分装到 50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。2)继代培养基N6max 母液(IOX)IOOmlN6mix 母液(100X)IOmlFe2+EDTA 贮存液(100X)IOml维生素贮存液(100X)IOml2，4-DC存液2.0ml脯氨酸0.5gCH0. 6g蔗糖30gPhytagel3g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分装到 50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。3)预培养基N6max 母液(IOX)12. 5mlN6mix 母液(100X)1.25mlFe2+EDTA 贮存液(100X)2.5ml维生素贮存液(100X)2.5ml2，4-DC存液0.75mlCH0. 15g蔗糖5g琼脂粉(Agarose)1. 75g加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250 μ 1 AS贮存液，分装倒入 培养皿中(25ml/皿)。
4)共培养基N6max 母液(IOX)12.5mlN6mix 母液(100X)1.25ml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)2.5ml维生素贮存液(100X)2.5ml2，4-DC存液0.75mlCH0. 2g蔗糖5g琼脂粉1.75g加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250 μ 1 AS贮存液，分装倒入 培养皿中(25ml/每皿)。5)悬浮培养基N6max 母液(IOX)5mlN6mix 母液(100X)0.5mlFe2+EDTA 贮存液(100X)0.5ml维生素贮存液(100X)Iml2，4-DC存液0.2mlCH0. 08g蔗糖2g加蒸馏水至100ml，调节pH值到5. 4，分装到两个IOOml的三角瓶中，封口灭菌。使用前加入Iml葡萄糖贮存液和100 μ 1 AS贮存液。6)选择培养基N6max 母液(IOX)25mlN6mix 母液(100X)2.5mlFe2+EDTA 贮存液(100X) 2.5ml维生素贮存液(100X)2.5ml2，4-DC存液0.625mlCH0. 15g蔗糖7. 5g琼脂粉1.75g加蒸馏水至250ml，调节pH值到6. 0，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250 μ 1 HN和400ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。7)预分化培养基N6max 母液(IOX)25mlN6mix 母液(100X)2.5mlFe2+EDTA 贮存液(100X) 2.5ml维生素贮存液(100X) 2.5ml6-BA 贮存液0.5ml
KT C存液0.5mlNAA C存液50 μ 1IAA C存液50 μ 1CH0. 15g蔗糖7. 5g琼脂粉1.75g加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250 μ 1 HN和200ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。8)分化培养基N6max 母液(IOX)IOOmlN6mix 母液(100X)IOmlFe2+EDTA 贮存液(100X) IOml维生素贮存液(100X)IOml6-BA 贮存液2mlKT 贮存液2mlNAA C存液0.2mlIAA C存液0. 2mlCHIg蔗糖30gPhytagel3g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到6. 0。煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。9)生根培养基MSmax 母液(IOX)50mlMSmix 母液(100X)5mlFe2+EDTA 贮存液(100X)5ml维生素贮存液(100X)5ml蔗糖30gPhytagel3g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 8。煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。(4)农杆菌介导的遗传转化步骤3.1愈伤诱导(1)将成熟的水稻种子去壳，然后依次用70%的乙醇处理1分钟，0. 15%氯化汞(HgCl2)种子表面消毒15分钟；(2)用灭菌水洗种子4-5次；(3)将种子放在诱导培养基上；(4)将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25士 1°C。3. 2愈伤继代
挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温 度 25 士 1°C。3. 3预培养挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度 25 士 1°C。3. 4农杆菌培养(1)在带有对应抗性选择的LA培养基上预培养农杆菌EHA105 (来源于CAMBIA，商 用菌株)两天，温度28°C ；(2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28°C摇床上培养2-3小时。3. 5农杆菌侵染(1)将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；(2)调节农杆菌的悬浮液至OD6J). 8-1. 0 ；(3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；(4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养2天，温度 19-20 "C。3. 6愈伤洗涤和选择培养(1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；(2)浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；(3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；(4)转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。(第一次潮霉素筛选浓度为 400ppm，第二次以后为250ppm)3. 7 分化将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7周；转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26°C。3. 8 生根(1)剪掉分化时产生的根；(2)然后将其转移至生根培养基中，光照下培养2-3周，温度26°C。3. 9 移栽洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保 持水分湿润。申请人:采用构建的pl391Z-0shoX24P载体(如图3)转化水稻“中花11中”，得到 转基因阳性植株18株；不连接外源片段的pl391Z空载体转化水稻“中花11中”得到转基 因阳性植株8株。选取3个转启动子阳性家系和1个转空载体阳性对照家系对Tl代种子 进行潮霉素(HN)抗性筛选发芽，将发芽的苗子一部分种于小红桶的沙土内长至4叶期做干 旱胁迫，一部分种于小方盒内长至3、4叶期做高盐、ABA、4°C冷胁迫。其中干旱胁迫方法如 实施例2中所述，取胁迫前d0、叶片微卷dl、叶片半卷d2、叶片全卷d3四个时间点的样品。 小方盒内用的是实施例3中的生根培养基，高盐胁迫是在小方盒内加入100mL200mMNaCl， 取0h、3h、6h、24h时间点样品；ABA胁迫是在每个小方盒内加入70mL100mMABA，取0h、0. 5h、 3h、24h时间点样品，冷胁迫是将小方盒放入4 °C冷库中，取Oh、6h、12h、24h样品。每份样品取的是该家系的混合样(不少于10株)。样品用液氮磨样，通过⑶S抽提液(50mM Na2HP04, pH7. 0, IOmM β-mercaptoethanol，IOmMNa2EDTA, 0· 1% Sarkosyl，0· 1% Triton-100)抽提总蛋白，从样 品中取出一定量的蛋白着进行GUS活性定量分析。通过分析荧光结果获得原样品的GUS 比酶活。具体步骤如下通过Bradford法(参见A rapid andsensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dyebinding. 1976，Anal Biochem,72 248-254)测得样品的总蛋白浓度，再根据浓 度用移液器量取一定体积的相同质量的总蛋白，用相同量的总蛋白质提取物+0. 4mlGUS提 取缓冲液+10μ 1 40mM 底物 MUG(4-methylumbelifferyl-0-D-glucuronide)在 37°C 水浴 一定时间(Ih以内)后，加入1. 6ml反应终止液(0. 2MNa2C03)；每个反应设置三个技术重复。 用Tecan光栅型酶标仪infinite M200测量各个样品在激发光365nm，发射光455nm处的荧 光值，同时以50nM MU的荧光值作为参比。进而通过以上数据计算出各个样品中⑶S蛋白 的比酶活，即Iug总蛋白每分钟反应底物MU的量(单位pmol MU/min/ug protein)。通过⑶S蛋白活性定量测量发现，0shox24P启动子控制下的⑶S蛋白活性受到干旱胁迫的强烈诱导，在三个独立转基因家系中⑶S蛋白在叶片全卷时的活性是胁迫前的约 3至18倍(如图4)；同时在ABA胁迫时该启动子控制下的GUS蛋白活性也呈现出增强的趋 势，变化幅度约2至3倍(如图6)；在高盐胁迫和冷胁迫时GUS蛋白的活性变化不大或者 变化规律不明显(如图5和图7)。
权利要求
一种被干旱、高盐或低温特异诱导表达的启动子Oshox24P，它的核苷酸序列如SEQ IDNO1所示。
2.权利要求1所述的启动子0shox24P在控制基因在植物中表达的应用。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域。涉及一种植物逆境特异诱导型启动子的分离鉴定和应用。通过分离和鉴定获得一种水稻干旱诱导型基因的启动子Oshox24P，它具有如序列表SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本发明的启动子可以应用于植物的基因工程中，以达到植物遗传改良特别是提高植物抗旱性的目的。
文档编号C12N15/113GK101831430SQ201010162848
公开日2010年9月15日 申请日期2010年4月27日 优先权日2010年4月27日
发明者杨梅, 熊立仲 申请人:华中农业大学