专利名称：一种检测猕猴属动物TRIMCyp基因型的PCR方法
技术领域：
本发明涉及一种检测动物基因型的方法，尤其涉及一种检测猕猴属动物TRIMCyp 基因型的PCR方法，属于猕猴属动物TRIMCyp基因型的检测领域。
背景技术：
目前研究表明，HIV-I不能在猴体内有效复制的一个主要原因是在猴体内存在 两种抑制逆转录病毒的细胞限制因子，即Tripartite motif protein 5_ α (TRIM5 α ) 禾口 Apolipoprotein B mRNA-editing catalytic polypeptide 3G(AP0BEC3G)(Sakuma R, Noser J A, Ohmine S, Ikeda Y. Inhibition of HIV-I replication by simian restrictionfactors,TRIM5[alpha]and AP0BEC3G[J]. Gene Ther 2006 ； 14 (2) :185_189)。 本文研究限于TRIM5 α，该蛋白为一种组成型表达的胞浆蛋白，介导了逆转录病毒进入细胞 后的限制。TRIM5ci结合病毒的衣壳蛋白(capsid，CA)，主要限制了逆转录病毒进入胞浆 后的脱壳，并将TR IM5 α-CA靶向于蛋白酶体而降解(Stremlau M, Owens C, Perron Μ, et al.The cytoplasmic body component TRIM5α restricts HIV-I infection inOld World monkeys [J]. Nature, 2004 ；427 (6977) :848_853)。TRIM5 α 同源基因存在于一些灵长类生 物中(Sawyer SL, Wu Li, Emerman Μ, et al. Positive selection ofprimate TRIM5alpha identifies a critical species-specific retroviral restrictiondomain[J]. Proc Natl Acad Sci U S A 2005 ； 102 2832-2837 ；Song B, Gold B，0，HuiginC，et al. The B30. 2(SPRY)domain of the retroviral restriction factor TRIM5alphaexhibits lineage-specific length and sequence variation in primates[J]. J Virol 2005 ； 79 :6111-6121.)，包括人和类人猿。然而，在一些猕猴属灵长类动物中，TRIM5基因座发 生天然的CypA转座子插入突变，产生TRIMa-CypA融合基因，即TRIMCyp这种插入突变 使TRIM5ci所结合CA结构域的构象发生变化，从而失去了限制HIV-I复制的作用(Liao C H, Kuang Y Q, Liu H L, et al. A novel fusion gene, TRIM5-Cyclophi 1 in A in the pig-tailed macaque determines its susceptibility to HIV-I infection[J]. AIDS, 2007 ；8 :S19-26.)。利用TRIMCyp基因型宿主，可使HIV-I较易突破猴的宿主限制性，并使 其他抑制活性较弱的限制因子作用得以更清晰表现，为研究逆转录病毒跨种间传播和建立 新型艾滋病动物模型提供独特平台。猕猴属的食蟹猴和恒河猴是研究艾滋病的主要非人灵长类模型动物。虽然国外已 报道在这2种猴中发现了 TRIMCyp基因突变个体，却尚未能在中国恒河猴中找到TRIMCyp 基因型。国内亦未见携带TRIMCyp基因的食蟹猴报道。因此，有必要开展中国地区猕猴属 TRIMCyp基因存在情况调查，为艾滋病疫苗免疫保护性评价和治疗药物筛选提供灵长类实 验动物的战略资源储备，以及建立更加有效的新模式动物平台。
发明内容
本发明目的是提供一种检测猕猴属动物TRIMCyp基因型的PCR方法；
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的一种检测猕猴属动物TRIM5基因座突变的PCR方法，包括(1)从猕猴属动物的毛 发中提取DNA ；⑵以所提取的DNA为模板，以SEQ ID N0:UPSEQ ID NO :2为引物进行PCR 扩增；(3)如果扩增的产物为一条2300-2400bp的片段，则待检测猕猴属动物的TRIM5基因 座没有发生因CypA插入而导致的突变；如果扩增的产物分别得到两条片段，其中为一条为 2300-2400bp的片段，另一条为3000-3150bp的片段，则待检测猕猴属动物的TRIM5基因座 因CypA插入而发生杂合突变；如果扩增产物仅为一条3000-3150bp的片段，则待检测猕猴 属动物的TRIM5基因座因CypA插入而发生纯合突变。优选的，上述检测方法中，如果扩增的产物为一条2，400bp的片段，则待检测猕猴 属动物的TRIM5基因座没有发生因CypA插入而导致的突变；如果扩增的产物分别得到两 条片段，其中为一条为2，400bp的片段，另一条为3，IOObp的片段，则待检测猕猴属动物的 TRIM5基因座因CypA插入而发生杂合突变；如果扩增产物仅为一条3，IOObp的片段，则待 检测猕猴属动物的TRIM5 α基因座因CypA插入而发生纯合突变。其中，所述的猕猴属包括平顶猴(Macaca nemestrina),食蟹猴 (Macacafascicularis)(Macaca mulatta) sK^Hf^ (Macaca thibetana)；步骤(2)中所述的PCR扩增体系优选为2 μ L IOX扩增缓冲液，IuL待检测的模 板，1.6yL dNTP，上下游引物各0. 4yL，0. 16 μ L LA Taq酶，补水至20 μ L体系；所述的PCR 扩增条件为95°C预变性5min，95°C变性40s，64°C退火40s，72°C延伸2. 5min，35个循环， 720C IOmin。本发明建立了从猕猴属动物毛发中检测TRIMCyp基因型的PCR方法，成功地筛 选出了突变基因阳性个体。本发明主要应用毛发基因组PCR法对猕猴属的平顶猴、恒河 猴以及食蟹猴TRIMCyp突变体进行了检测。检测的3份平顶猴样本均为TRIMCyp纯合突 变，与已报道结果相符，是平顶猴易感HIV-I的主要原因(KuangY Q，Tang X，Liu F L，et al. Genotyping of TRIM5 locus in Northern pig-tailed macaques(Macaca eonine), a primate species susceptible to human immunodeficiency virus typel infection[J]. Retrovirology,2009 ；6(1) :58)。食蟹猴是艾滋病常用动物模型之一。虽有检出TRIMCyp 基因型个体的报道，但其在群体中比例不详(Brennan，G，Y. Kozyrev, Shiu-Lok Hu. TRIMCyp expression in Old World primates Macaca nemestrinaand Macaca fascicularis[J]. Proc Natl Acad Sci U S A 2008 ；105(9) :3569_74·)。本发明检测了 7 只食蟹猴的样本， 分别检测出1个纯合TRIMCyp突变体，2个TRIMCyp杂合突变体和4个野生型TRIM5个体。本发明了用猕猴属动物的毛发和血液中提取的染色体DNA进行了 TRIMCyp的PCR 扩增效果，二者的检测结果相同，表明本发明方法从猕猴属动物毛发中提取基因组DNA进 行PCR检测，能够准确的检测出猕猴属动物的TRIMCyp基因型，检测结果可信，可以用于调 查TRIMCyp在中国地区猕猴中分布，筛选阳性个体。本发明方法减轻了采样过程对猴体的 刺激，避免可能的损伤，同时也提高了采样的效率。
图1引物Pl序列和位置。图2引物Ρ2序列和位置。
图3TRIM5及TRIMCyp的基因结构和PCR引物位置。1-8分别标注8个外显子，CypA 标记插入的该基因片段。图4平顶猴毛发DNA样品PCR检测TRIMCyp突变结果；M =DNA MarkerDL15000+2000 ；1 =H2O ；2 从恒河猴白血细胞中所提取的基因组DNA ；3 从平顶猴血 液中所提取的基因组DNA ；4-7 从平顶猴毛发中所提取的基因组DNA。图5恒河猴毛发DNA样品PCR检测TRIMCyp突变结果；M :DNA MarkerDL15000+2000 ；1 =H2O ；2 从恒河猴白血细胞中所提取的基因组DNA ；3 从平顶猴血 液中所提取的基因组DNA ；4-8 从恒河猴毛发中所提取的基因组DNA。图6食蟹猴毛发DNA样品PCR检测TRIMCyp突变结果；M =DNA MarkerDL15000+2000 ；1 =H2O ；2 从恒河猴白血细胞中所提取的基因组DNA ；3 从平顶猴血 液中所提取的基因组DNA ；4-9 从食蟹猴毛发中所提取的基因组DNA。图7食蟹猴白细胞DNA样品PCR检测TRIMCyp突变结果；M =DNA MarkerDL15000+2000 ；1 =H2O ；2 从恒河猴白血细胞中所提取的基因组DNA ；3 从平顶猴血 液中所提取的基因组DNA ；4-9 从食蟹猴白血细胞中所提取的基因组DNA。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1材料和方法1. 1实验材料试验用平顶猴、食蟹猴毛发取自华南灵长类研发中心，恒河猴毛发为 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所慢病毒研究室提供(说明平顶猴、食蟹猴以及恒河猴 的毛发都可从各地的猕猴养殖场购买得到，例如，可以从广东蓝岛生物技术公司、四川宜宾 生物技术公司购买得到)，采样后均存于-20°C，直至使用。毛发基因组提取试剂盒DNA IQ System购自Promega。LA Taq酶，DNAMarker，dNTP均购自宝生物工程(大连)有限公司。1. 2引物设计猕猴TRIM5基因包含8个外显子，已发现的猕猴属TRIMCyp基因型中的CypA插入到第8外显子后的3’ UTR0参照已发表猴基因组14号染色体序列 (Genbank No. NW_001100384. 11 Mmul4_WGA20947_l :640913_675268，NC_007871. 1)，分另Ij 在TRIM5 α第6外显子和3’ UTR序列设计PCR引物，筛选出一对稳定性好、特异性强的 引物。上游引物Pl在第6外显子上，位于第6外显子的第10 27位碱基。其序列为 CATGACCTTGAAGAAGCC(SEQ ID NO :1)。下游引物Ρ2在3，UTR上，位于第8外显子后的第 1058 1079位碱基，其序列为TAGCATATCCATCACCTCAAAT(SEQ ID NO 2)(引物序列详细位 置见图1和图2)。引物由Irwitrogen公司合成。按设计，如果没有CypA插入，PCR扩增产 物将为一条2，343bp片段。CypA插入个体有杂合体和纯合体2种状态。用该PCR引物对扩 增杂合突变体DNA，分别形成一条2，343bp和一条3，IlObp的片段；而扩增来自纯和突变体 DNA时则仅形成一条3，IlObp片段(图3)。1. 3毛发中染色体DNA提取以及目的片段的PCR扩增
取带有毛囊的毛发1-2根，按照毛发基因组提取试剂盒DNA IQ System的说 明书提取染色体DNA。以提取的DNA为模板，通过PCR扩增目的片段，反应体系为2 μ L 10 X buffer，IuL 模板，1·6μ L dNTP,上下游引物各 0. 4 μ L，0. 16 μ L LATaq 酶，补水至 20 μ L体系；反应条件为95°C预变性5min，95°C变性40s，64°C退火40s，72°C延伸2. 5min， 35 个循环，72°C IOmin。2试验结果2. 1平顶猴TRIMCyp突变个体检测结果根据报道，100%的平顶猴为TRIMCyp基因型，以提取的3只平顶猴毛发DNA为模 板进行PCR扩增，对其产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。作为对照，应用常规方法分别从 1只平顶猴和一只已知TRIMCyp突变阴性恒河猴白细胞中提取的染色体DNA样品亦同时进 行了 PRC扩增和电泳检测。结果显示，平顶猴和恒河猴白细胞DNA样品分别扩增出1条大小 约为3，IOObp和2，400bp的单一、清晰条带，与推算TRIMCyp基因型和TRIM5基因型相符。 3份平顶猴毛发DNA样品均呈现一条大小约为3，IOObp的TRIMCyp基因型片段，但同时在较 低分子量处出现若干非特异性条带(见图4)。对扩增的TRIMCyp基因型片段进行克隆后的 测序结果证实了该PCR方法的特异性。2. 2恒河猴TRIMCyp突变个体检测结果
以提取的5只恒河猴猴毛发DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物进行1 %琼脂 糖凝胶电泳，各样品均可见一大小约为2，400bp的TRIM5基因型条带，即5只恒河猴皆为 TRIMCyp阴性个体(见图5)。作为对照，平顶猴和已知TRIMCyp突变阴性恒河猴白细胞中提 取的染色体DNA样品亦同时进行了 PCR扩增和电泳检测，分别扩增出1条大小约为3，IOObp 和2，400bp单一条带。2. 3食蟹猴TRIMCyp突变检测结果虽然食蟹猴是艾滋病研究主要动物模型之一，目前国内尚无食蟹猴TRIMCyp突变 体的报道。本发明对7只食蟹猴进行了 TRIMCyp突变体的检测，结果显示，其中4只为TRIM5 基因型，1只为TRIMCyp基因纯合子个体，2只为TRIMCyp基因杂合子个体(图6)。为了证 实从毛发中提取DNA进行TRIMCyp突变体PCR检测的可靠性，本发明从这7只食蟹猴的白 细胞中提取了染色体DNA，以此为模板进行了 PCR，检测TRIMCyp突变体。结果显示，血液样 品检测的基因型与毛发样品测试结果一致，扩增后片段琼脂糖凝胶电泳显示的特异性和条 带的清晰度亦无明显差别(图7)。
权利要求
一种检测猕猴属动物TRIM5基因座突变的PCR方法，包括(1)从猕猴属动物的毛发中提取DNA；(2)以所提取的DNA为模板，以SEQ ID NO1和SEQ IDNO2为引物进行PCR扩增；(3)如果扩增的产物为一条2300-2400bp的片段，则待检测猕猴属动物的TRIM5基因座没有发生因CypA插入而导致的突变；如果扩增的产物分别得到两条片段，其中为一条为2300-2400bp的片段，另一条为3000-3150bp的片段，则待检测猕猴属动物的TRIM5基因座因CypA插入而发生杂合突变；如果扩增产物仅为一条3000-3150bp的片段，则待检测猕猴属动物的TRIM5基因座因CypA插入而发生纯合突变。
2.按照权利要求1所述的PCR方法，其特征在于步骤(3)中，如果扩增的产物为一条 2，400bp的片段，则待检测猕猴属动物的TRIM5基因座没有发生因CypA插入而导致的突变； 如果扩增的产物分别得到两条片段，其中为一条为2，400bp的片段，另一条为3，IOObp的片 段，则待检测猕猴属动物的TRIM5基因座因CypA插入而发生杂合突变；如果扩增产物仅为 一条3，IOObp的片段，则待检测猕猴属动物的TRIM5 α基因座因CypA插入而发生纯合突 变。
3.按照权利要求1所述的PCR方法，其特征在于所述的猕猴属包括平顶猴(Macaca nemestrina)食蟹猴(Macaca fascicularis)恒河猴(Macaca mulatta) 或藏酋猴 (Macaca thibetana)。
4.按照权利要求1所述的PCR方法，其特征在于步骤⑵中所述的PCR扩增体系为 2yL IOX扩增缓冲液，IuL待检测的模板，1.6μ L dNTP，上下游引物各0. 4 μ L，0. 16 μ L LATaq酶，补水至20 μ L体系。
5.按照权利要求1所述的PCR方法，其特征在于步骤(2)中所述的PCR扩增条件为 95°C预变性 5min，95°C变性 40s，64°C退火 40s，72°C延伸 `2. 5min，35 个循环，72°C IOmin0
全文摘要
本发明公开了一种检测猕猴属动物TRIM5基因座突变的PCR方法，包括(1)从猕猴属动物毛发中提取DNA；(2)以SEQ ID NO1和SEQ ID NO2为引物进行PCR扩增；(3)如果扩增产物为一条2300-2400bp片段，则待检测动物TRIM5基因座没有发生突变；如果扩增产物分别为2300-2400bp和3000-3150bp的两条片段，则TRIM5基因发生杂合突变；如果扩增产物仅为一条3000-3150bp的片段，则TRIM5基因座发生纯合突变。本发明方法能够准确的检测出猕猴属动物的TRIMCyp基因型，可以用于调查TRIMCyp在中国地区猕猴中分布，筛选阳性个体。
文档编号C12Q1/68GK101818204SQ201010163049
公开日2010年9月1日 申请日期2010年4月30日 优先权日2010年4月30日
发明者于长青, 刘晓明, 吕晓玲, 周建华, 汤艳东, 胡哲, 那雷, 饶军华 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所;广东蓝岛生物技术有限公司