抗癌胚抗原抗体及其应用的制作方法

专利名称：抗癌胚抗原抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗癌胚抗原(CEA)人源化嵌合抗体，编码该抗体的多核苷酸，包 含该多核苷酸的表达载体以及含有所述表达载体的宿主细胞，以及它们在制备用于诊断和 /或治疗肿瘤的药物中的用途。
背景技术：
1965年，加拿大的Gold和Fredman用人结肠癌提取液免疫兔所得的血清检测多 种人组织，发现由人内胚叶来源的消化道肿瘤为染色强阳性，同时还发现2-6个月胎儿的 消化道组织也阳性，因而将这种在消化道肿瘤中表达呈阳性的抗原分子命名为癌胚抗原 (Carcinoembryonic antigen，CEA)。后来发现CEA抗原在由内胚层细胞分化而来的肿瘤细 胞中的表达水平较正常组织高上百倍，是多种人恶性肿瘤重要的肿瘤抗原和标志物。CEA是 一种由糖链和肽链组成的分子量约为180-200KD的糖蛋白，由于糖链的组成不同和来源不 同其生化特性及免疫原性显示出极大的异质性、多样性和不均一性，是一个相对大的大分 子家族。CEA分子具有许多不同的抗原表位，这些不同的表位在成人不同正常组织、胎儿器 官和各种恶性肿瘤组织中的表达不同，特异性也有差别。Hammarstrom等于1989年提出把 CEA抗原表位分为5组，即Gold 1-5组(Gold分类)，研究表明Gold 1-5组的抗原表位分 别位于CEA分子的结构域A3、B2、B3、Al和N，其中A3和B3结构域与其它CEA相关分子的 同源性低，是CEA分子相对专一的结构域。CEA主要在细胞胞膜和胞浆表达，在8周的胚胎的各胚层组织也有表达。3个月后 的胚胎组织中CEA主要表达于胃肠上皮组织，至成人组织CEA表达明显减弱或消失，只有结 肠上皮细胞表面有微量表达。但当细胞发生癌变后，CEA在多种恶性肿瘤高表达，包括结肠 直肠癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、膀胱癌、胆囊癌和食管癌等 11种肿瘤，其阳性率达50-90%，并且在这些恶性肿瘤的转移灶中CEA也高表达，且表达水 平高于原发病灶。在这些肿瘤中，结肠直肠癌CEA表达阳性率和强度均居首位，达95%以 上。几乎所有的结直癌组织中都有CEA的高表达，而且其在转移病灶如肝转移灶中的表达 水平和阳性率显著高于原发病灶。大量的研究还证明CEA在恶性肿瘤的表达与肿瘤的负 荷、分期、转移预后密切相关。因此CEA已被世界范围公认为恶性肿瘤特异的分子标志物， 使之成为肿瘤靶向治疗和诊断的最佳靶位之一。CEA阳性的恶性肿瘤发病率高，发病人数巨大，是全世界范围内对人民生命健康威 胁最大的疾病之一。以CEA高表达的结肠癌为例，结肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，结肠直 肠癌的发病率在欧美发达国家居所有恶性肿瘤第三位，死亡率居第二位。全球每年新增病 例超过100万，死于结肠直肠癌的病人达52. 9万。每年我国新增结肠直肠癌病人近40万 需要治疗，有约近20万的结肠直肠癌病人因为治疗失败或无效而死亡。到目前为止FDA批 准的最常用的结肠癌化疗药有4种氟尿嘧啶(fluorouracie)、伊立替康(irinotacan)、 奥沙利钼(oxaliplatin)和卡培他滨(capecitabine)，现有这些化疗药物和化疗方案作为 术后辅助治疗可以减少结肠直肠癌的复发率到约为15%左右，改善和提高5年生存率到约
310-13%。抗体靶向药物是近十年发展起来的另一类治疗恶性肿瘤的新药。在临床上用于 治疗某些血液系统肿瘤，如非霍杰金氏淋巴瘤等，已取得显著的疗效，可提高病人的5年生 存率。以CEA抗原为靶点的放射免疫抗体靶向治疗剂虽然目前尚未有批准上市治疗肿瘤的 CEA抗体药。但现已有2种CEA抗体放射免疫治疗剂被批准正在进行I、II期临床试用研 究。一种是美国Immimomedics公司于1999年研制开发的131I偶联的重组CEA人源化抗体 hMN-14的mI-hMN-14抗体药，目前已基本完成治疗耐药性转移进展期结肠直肠癌的II期 临床研究，进入III期临床研究。另一种抗人CEA抗体药物是美国FDA批准美国City of Hope国家医学中心研发的与放射核素9°y偶联的cT84. 66人/鼠嵌合抗体，目前已完成治 疗进展期恶性肿瘤的I期临床试验。然而，以上2种CEA抗体药物还存在特异性还需进一 步提高，毒副反应需进一步降低；抗体亲合力过高，易造成放射免疫靶向治疗时产生亲合力 壁垒，从而显著影响疗效等问题。需要新的抗CEA抗体以克服现有技术抗CEA抗体存在的 问题。现有的众多研究已经定论，抗体的结合特异性及亲合力均是绝大部分由抗体的轻 链和重链超可变区(或称互补决定区，complementary determinantregion，简称CDR)的氨 基酸序列决定的。美国食品及药品监督管理局(U. S. Food and Drug Administration,FDA) 在其指导原则中认定，凡是具有相同互补决定区的同类型抗体属于同一种抗体。因此，在获 得一种有临床治疗价值的抗体的CDR之后，业界很容易根据成熟、公知的现有各项技术将 其非CDR区域的氨基酸序列改变而获得具有相同甚至更好的生物活性的变体。

发明内容
本发明是基于具有优异的CEA结合特异性和适宜亲合力的亲本抗CEA鼠单克隆抗 体，通过克隆、鉴定与基因结构的分析，确定了其⑶R区序列，构建了相应的人源化嵌合抗 体及其真核细胞表达载体，并获得了表达并分泌该抗CEA人源化嵌合抗体的细胞株。本发明进一步证明了所述的人源化嵌合抗体除了具有与原鼠单抗相匹配的适宜 的亲合力外，还具有优异的CEA结合特异性和体内肿瘤靶向性，并在体内可显著抑制多种 结肠癌动物模型的生长，同时由于具有人源性，将可减少其人体应用时的毒副作用。本发明 进一步采用动物模型及放射免疫显像等实验在体内充分证明了所述的人源化嵌合抗体具 有优异的CEA阳性肿瘤的靶向性，因此可用于制备CEA阳性肿瘤的体内诊断药物。此外，本 发明还利用放射免疫治疗等实验在多种动物模型体内证明了所述的人源化嵌合抗体具有 优异的抑制CEA阳性肿瘤生长的能力，因此可用于制备CEA阳性肿瘤的治疗药物。因此，本发明主要涉及了以下几个方面第一方面，本发明涉及一种抗癌胚抗原的人源化嵌合单克隆抗体或其功能变体， 其中所述单克隆抗体的重链包含SEQ ID NO :7-9所示的CDR区，所述单克隆抗体的轻链包 含 SEQ ID NO 10-12 所示的 CDR 区。第二方面，本发明涉及一种抗CEA人源化嵌合单克隆抗体或其功能变体，其中该 抗CEA人源化嵌合抗体的轻链蛋白质氨基酸序列为SEQ IDNO :1，重链蛋白质氨基酸序列为 SEQ ID NO :2。第三方面，本发明涉及具有与所述人源化嵌合抗体相同的CDR序列的多肽，其具 有与本发明所述的人源化嵌合抗体相同或更高的生物活性。本领域公知，抗体的结合特异性及亲合力均主要由CDR序列决定，根据成熟、公知的现有各项技术可轻易地将非CDR区域 的氨基酸序列改变而获得具有相同甚至更好的生物活性的变体。第四方面，本发明涉及编码编码第一方面或第二方面所述的单克隆抗体或其变体 或第三方面所述的多肽的核酸。本领域公知，即使改变核苷酸的序列，只要最后按照三联密 码子遗传法则可翻译出含氨基酸序列SEQ IDNO 1和氨基酸序列SEQ ID NO 2的抗体蛋白 质，均为编码该抗CEA人源化嵌合抗体的多核苷酸。所述的核酸可为DNA或RNA。第五方面，本发明涉及一种表达载体，其中含有编码氨基酸序列SEQ IDNO=I 或SEQ ID NO :2的多核苷酸，优选所述表达载体在真核细胞中高效表达。优选地，所述 真核细胞是中国仓鼠卵巢细胞。在优选的实施方案中，所述的表达载体为图4所示的 pSRNC-C κ -CEA 或图 5 所示的 pSRDC-C y 1-CEA。第六方面，本发明涉及一种宿主细胞，其包含第五方面所述的表达载体。在优 选的实施方案中，本发明的宿主细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，具体是保藏号为CGMCC No. 3803的细胞。第七方面，本发明涉及治疗有效量的第一到第三方面之一所述的抗体或多肽或它 们的功能变体或它们的偶联物或融合蛋白，或第四方面所述的核酸，或第五方面所述的载 体，或第六方面所述的宿主细胞在制备抗肿瘤药物中的用途。所述的肿瘤选自结直肠癌、胃 癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、膀胱癌、胆囊癌和食管癌组成的组，优 选为结直肠癌。一个优选实施方案中，所述的抗肿瘤的药物包含与放射核素偶联的第一到 第三方面之一所述的抗体或多肽作为活性药物成分，优选所述放射核素是碘131。第八方面，本发明涉及第一到第三方面之一所述的抗体或多肽或它们的功能变体 或它们的偶联物或融合蛋白，或第四方面所述的核酸，或第五方面所述的载体，或第六方面 所述的宿主细胞在制备肿瘤诊断剂中的用途。所述的肿瘤选自结直肠癌、胃癌、肺癌、乳腺 癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、膀胱癌、胆囊癌和食管癌组成的组，优选为结直肠 癌。一个优选实施方案中，所述的肿瘤诊断药物包含与放射免疫显像剂偶联的第一到第三 方面之一所述的抗体或多肽作为活性药物成分，优选所述放射免疫显像剂是铼188。


图1显示采用琼脂糖凝胶电泳分析所提取的亲本鼠单克隆抗体杂交瘤细胞总 RNA。泳道1.分子量标准品，ADNA/Hind III。泳道2.亲本鼠单克隆抗体杂交瘤细胞总 RNA。图2显示采用琼脂糖凝胶电泳分析亲本鼠单克隆抗体VL、VH基因的PCR产物。泳 道1.分子量标准品，ADNA/Hind III。泳道2.亲本鼠单克隆抗体VL基因PCR产物。泳 道3.亲本鼠单克隆抗体VH基因PCR产物。图3显示所扩增获得的亲本鼠单克隆抗体VL、VH基因的核苷酸序列、氨基酸序列 及⑶R序列。图4显示抗CEA人源化嵌合抗体轻链真核表达载体pSRNC-C κ -CEA的结构示意 图。Pw，弱化的真核启动子；Neo，氨基糖苷磷酸转移酶(neo)基因；PhCMV-IE，人巨细胞病毒 立早启动子及增强子；VL基因，带有前导肽序列及5’内含子端剪接位点序列的轻链可变区 基因片段；Ck基因，人抗体轻链κ链恒定区基因片段；BGH poly A，牛生长激素poly A加尾位点；Ap，氨苄抗性基因。图5显示抗CEA人源化嵌合抗体重链真核表达载体pSRDC-C y I-CEA的结构示意 图。Pw，弱化的真核启动子；dhfr，二氢叶酸还原酶(dhfr)基因；PhCMV-IE，人巨细胞病毒立 早启动子及增强子；VH基因，带有前导肽序列及5’内含子端剪接位点序列的重链可变区基 因片段；C Yl基因，人抗体重链Yl链恒定区基因片段；BGH poly A，牛生长激素poly A加 尾位点；Ap，氨苄抗性基因。图6显示高水平分泌表达抗CEA人源化嵌合抗体的细胞株的构建、筛选过程。图7显示采用ELISA法测定分泌表达抗CEA人源化嵌合抗体的细胞株CHO的上清 中嵌合抗体的含量。其中，CHO上清(1 1000)，0D490 = 1.520，对应于0.08 48/1111，上清 原液浓度0. 08 X 1000 = 80 μ g/ml。图8显示采用RT-PCR分析抗CEA人源化嵌合抗体的抗原特异性。泳道1. λ DNA/ Hind III。泳道2. 320bp标记。泳道3.抗CEA人源化嵌合抗体VL基因PCR扩增产物。泳 道4.抗CEA人源化嵌合抗体VH基因PCR扩增产物。泳道5，6.阴性对照。图9显示采用免疫荧光分析抗CEA人源化嵌合抗体的抗原特异性。图10显示抗CEA人源化嵌合抗体可以识别多种CEA表达的癌细胞上的CEA抗原。图11显示采用Western印迹分析抗CEA人源化嵌合抗体的人源性.泳道1.分 子量标记。泳道2.嵌合抗体，抗人IgG Fc-HRP为二抗。泳道3.鼠单克隆抗体，抗人IgG Fc-HRP为二抗。泳道4.嵌合抗体，抗人κ链为一抗。泳道5.鼠单克隆抗体，抗人κ链为 一抗。图12显示抗CEA人源化嵌合抗体的每克组织放射剂量摄入百分比研究(ID% / g)结果。图13显示抗CEA人源化嵌合抗体的肿瘤组织与正常组织放射剂量比值研究(T/ NT)结果。图14显示抗CEA人源化嵌合抗体在体内放射免疫显像CEA阳性结肠癌的肿瘤。图15显示了抗CEA人源化嵌合抗体与碘131的偶联物单次治疗荷人结肠癌裸鼠 移植瘤模型的结果(生长曲线)。图16显示了抗CEA人源化嵌合抗体与碘131的偶联物多次治疗荷人结肠癌裸鼠 移植瘤模型的结果(生长曲线)。
具体实施例方式本发明所涉及的抗CEA人源化嵌合抗体基因的抗体可变区来自于我们以往以CEA 免疫小鼠制备获得的一株抗CEA鼠单克隆抗体C24，其可得自2010年5月4日保藏的保藏号 为CGMCC No. 3802的杂交瘤细胞。以往的多项研究表明(卢宝兰.程明.强来英.等.癌 胚抗原单克隆抗体的制各及免疫学性状的研究.生物工程学报.1986，15 (2) :37)，该鼠单 克隆抗体具有非常优异的适于靶向治疗的生物学特性，包括具有极强的特异性和适宜的亲 合力。该单克隆抗体与CEA抗原结合的特异性强，在体外能特异地与多种人肿瘤结合，包 括胃癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌等，但极少与人的正常组织细胞结 合特异性强，数千例的免疫组织化学研究证明该抗体与上述多种肿瘤组织结合的阳性率 达60% -90%，而与正常组织结合的阳性率仅在5% -10%之间；此外，该单克隆抗体除了特异性强以外的另一个适用于靶向治疗的优点是亲合力适宜，按照抗原抗体结合的动力学 计算结果，过高亲合力的抗体用于靶向治疗时反而导致靶向治疗抗体被吸附阻碍于肿瘤的 表面，而不能继续渗透深入肿瘤内部更好地发挥疗效，因而具有适宜亲合力的抗体更适用 于肿瘤的靶向治疗。而本发明中的抗CEA鼠单克隆抗体具有适宜的亲合力，亲合常数约为 IX lO-l-1，可以预计其人源化抗体将在临床治疗肿瘤中拥有更良好的疗效和应用前景。定义单克降抗体如本文所用，术语“单克隆抗体”是指得自一群基本同源的抗体的抗体，即包含除 了可能以很小量存在的天然发生的突变之外是相同的各个抗体。单克隆抗体是针对单一靶 位点的高度特异性的抗体。另外，与常规的(多克隆)抗体制备物(其典型包括针对不同决 定簇(表位)的不同抗体)相反，每个单克隆抗体均针对靶上的一个单一决定簇。除了其 特异性之外，单克隆抗体的优势是可以通过杂交瘤培养而合成，不被其它免疫球蛋白污染。 修饰语“单克隆”表示抗体得自基本上同质的抗体群的这一特征，而不是指需要通过任何特 殊方法产生该抗体。例如，本发明使用的单克隆抗体可以通过使用熟知的技术分离自噬菌 体抗体文库。根据本发明使用的亲代单克隆抗体可以通过由Kohler和Milstein，Nature 256，495 (1975)首先描述的杂交瘤方法产生，或者可以通过重组方法产生。互补决定区(CDR)如本文所用，术语“互补决定区”是指结合分子如免疫球蛋白的可变区中的序列， 其通常主要提供在形状和电荷分布方面与抗原上被识别的表位互补的抗原结合位点。CDR 区可以特异于线性表位、不连续表位或者蛋白质或蛋白质片段的构象表位，这些表位以其 天然构象存在于蛋白质上或者在一些情况中作为例如通过在SDS中增溶而变性的形式存 在于蛋白质上。表位也可以由翻译后修饰的蛋白质组成。多核苷酸如本文所用，“多核苷酸”包括脱氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或其具有天然核 糖核苷酸的必需性质的类似物，只要其在严格杂交条件下，与天然核苷酸一样和基本上相 同的核苷酸序列杂交和/或与天然核苷酸一样可以翻译成相同的氨基酸。多核苷酸可以是 天然或异源结构或调节基因的全长或亚序列。除非特别指出，该术语包括特异的序列以及 其互补序列。因此，本文中术语“多核苷酸”包含具有为了稳定性或其它原因而修饰的主链 的 DNA 或 RNA。本文中使用的术语“多肽”可与“肽”和“蛋白质”互换使用，指氨基酸残基的聚合 物。该术语用于氨基酸聚合物，其中一或多个氨基酸残基是相应的天然氨基酸的人造化学 类似物，以及用于天然氨基酸聚合物。这种天然氨基酸的类似物的必需性质是当其掺入 蛋白质中时，该蛋白质特异与由相同的但是完全由天然氨基酸组成的蛋白质引发的抗体反 应。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质，，也包括修饰，包括但不限于磷酸化、糖基化、脂质附着、 硫化、谷氨酸残基的Y "羧基化、羟基化和ADP-核糖基化。特异性结合如本文所用，针对抗体与其结合配偶体例如抗原之间的相互作用而提及的术语 “特异性结合”，是指所述相互作用依赖于结合配偶体上特定结构的存在，例如抗原决定簇或表位的存在。换句话说，甚至当所述结合配偶体存在于其它分子或生物体的混合物中时， 所述抗体也优先结合或识别所述结合配偶体。所述结合可以由共价或非共价相互作用或者 这两种作用介导。再换句话说，术语“特异性结合”是指免疫特异性结合抗原或其片段及非 免疫特异性结合其它抗原。免疫特异性结合抗原的结合分子可以以较低亲和性结合其它肽 或多肽，根据例如放射性免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、BIAC0RE或者本领域 已知的其它测定法确定。免疫特异性地结合抗原的结合分子或其片段可以与相关抗原交叉 反应。优选地，免疫特异性地结合抗原的结合分子或其片段与其它抗原不交叉反应。功能变体如本文所用，术语“功能变体”是指包含与亲代结合分子的核苷酸和/或氨基酸序 列相比改变了一或多个核苷酸和/或氨基酸的核苷酸序列和/或氨基酸序列但仍能竞争性 结合亲代结合分子的结合配偶体例如CEA的结合分子。换句话说，亲代结合分子的氨基酸 和/或核苷酸序列中的修饰不显著影响或改变由所述核苷酸序列编码的或含有所述氨基 酸序列的结合分子的结合特性，即所述结合分子仍能识别并结合其靶位。所述功能变体可 具有保守的序列修饰，包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域已 知的标准技术导入，例如定点诱变和随机PCR介导的诱变，并且可以包含天然以及非天然 核苷酸和氨基酸。保守的氨基酸取代包括氨基酸残基由具有相似结构或化学性质的氨基酸残基置 换。本领域已经明确了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例 如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如 甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如 丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、分支的侧链(例如 苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基 酸。本领域技术人员清楚也可以应用除了上述之外的其它氨基酸残基家族分类。另外，变 体可具有非保守的氨基酸取代，例如将氨基酸残基用具有不同结构或化学性质的氨基酸残 基置换。相似的小变化也可以包括氨基酸缺失或插入或者这两者。确定氨基酸残基可以被 取代、插入、或缺失而不消除其免疫学活性的指导可以使用本领域熟知的计算机程序发现。核苷酸序列中的突变可以是在基因座产生的单一改变(点突变)，如转换或颠换 突变，或者可以在一个单基因座插入、缺失或改变多个核苷酸。另外，可以在核苷酸序列内 的任意数目的基因座中产生一或多个改变。突变可以通过本领域已知的合适方法进行。嵌合抗体产生嵌合抗体的方法是本领域技术人员可获得的。例如轻链和重链可使用例如免 疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链在单独的质粒中分别表达。然后将其纯化并在体外装配为 完整抗体；对实现这种装配的方法已有描述。见例如Scharff，M.，Harvey Lectures 69: 125(1974)所述。也见于 0i 等，BioTechniques 4(4) :214_221 (1986)；及 Sun 等，Hybridoma 5(1986)Suppll 517-20 所述。从还原的分离的轻链和重链中形成IgG抗体的体外反应参数也已经描述。见例如 Beychok, S.，Cells of Immunoglobulin Synthesis，学术出版社，纽约，p. 69，1979。轻链 和重链在相同细胞中共表达以实现重链和轻链胞内缔合及连接成为完整的H2L2IgG抗体也 是可能的。这种共表达可以使用相同宿主细胞中的相同或不同质粒实现。
人源化抗体非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列 的嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如抗体的Fv、Fab、Fab'、F(ab' )2片 段或者其它结合靶的亚序列)。一般而言，人源化抗体包含基本上全部的至少一个、通常为 两个可变区，其中所有或者基本上所有CDR区域均相应于非人免疫球蛋白的那些区域，并 且所有或者基本上所有FR区域是人免疫球蛋白共有序列的那些区域。人源化抗体也可以 包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是所选择的人免疫球蛋白模板的至少一部分 免疫球蛋白恒定区。^^术语“载体”是指一种核酸分子，其中可以插入另一种核酸分子以用于将其导入宿 主中以便其复制、在一些情况中表达。换句话说，载体能转运与其连接的核酸分子。克隆以 及表达载体均涵盖在本发明所用术语“载体”中。载体包括但不限于质粒、粘粒、细菌人工 染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)及衍生自噬菌体或植物或动物(包括人)的病毒的 载体。载体包含由指定宿主识别的复制起源，在表达载体情况中还包含由宿主识别的启动 子及其它调节区。含有另一种核酸分子的载体通过转化、转染，或者通过利用病毒进入机制 而导入细胞中。某些载体能在其被导入的宿主中自主复制(例如具有细菌复制起源的载体 可以在细菌中复制)。其它载体可以在导入宿主时整合进宿主基因组中，从而与宿主基因组 一起复制。可操纵地连接术语“可操纵地连接”是指两或多个核酸序列元件通常经物理方式连接并且彼此 存在功能关系。例如，如果启动子能起始或调节编码序列的转录或表达则该启动子与所述 编码序列是可操纵地连接的，在这种情况中编码序列应理解为是在所述启动子的“控制” 下。宿主如本文所用，术语“宿主”是指其中已经导入载体如克隆载体或表达载体的生物体 或细胞。所述生物体或细胞可以是原核或真核生物体或细胞。应理解这个术语不仅是指特 定对象生物体或细胞，也是指这种生物体或细胞的后代。由于突变或环境影响导致在后续 的世代中可以发生某些修饰，因此这种后代实际上与亲代生物体或细胞不相同，但仍包括 在本文所用术语“宿主”范围内。药物学可接受的赋形剂“药物学可接受的赋形剂”是指与活性分子如药物、活性物质(agent)或结合分子 组合的用以制备合适或方便的剂量形式的任何惰性物质。“药物学可接受的赋形剂”是在应 用剂量和浓度对于受体无毒性并且与包含药物、药剂或结合分子的配制品的其它成分相容 的赋形剂。治疗有效量术语“治疗有效量”是指本发明所述抗体有效预防、改善和/或治疗癌症的量。i^X术语“治疗”是指用以治愈疾病或阻止或者至少延迟疾病进展的治疗性处理和预 防措施。需要治疗的对象包括已经患有癌症以及需要防止癌症的对象。从癌症部分或全部
9痊愈的对象也需要治疗。预防包括抑制或减慢癌症进展或者抑制或降低与癌症相关的一或 多种症状的发生、发展或进展。在本说明书中，术语“包含”是指包含所述的要素、整数或步骤，或者要素、整数或 步骤组，但不排除任何其它要素、整数或步骤，或者其它要素、整数或步骤组。一方面，本发明提供一种抗癌胚抗原的人源化嵌合单克隆抗体或其功能变体，其 中所述单克隆抗体的重链包含SEQ ID N0:7-9所示的CDR区，所述单克隆抗体的轻链包含 SEQ ID NO 10-12 所示的 CDR 区。一方面，本发明提供一种抗CEA抗体或其功能变体，其中该抗抗体的轻链蛋白质 氨基酸序列包含或由SEQ ID N0:1组成，重链蛋白质氨基酸序列包含或由SEQ ID NO 2组 成。在本发明优选的实施方案中，抗CEA抗体是一种重组或单克隆抗体。在另一个优选的 实施方案中，所述抗体是嵌合的或人源化抗体。在本申请中，术语“本发明的抗体”指的是本发明所述的抗CEA人源化嵌合单克隆 抗体或其功能变体，其中所述单克隆抗体的重链包含SEQ IDN0 7-9所示的⑶R区，所述单 克隆抗体的轻链包含SEQ ID NO 10-12所示的⑶R区，具体地所述抗CEA人源化嵌合抗体 的轻链蛋白质氨基酸序列包含或由SEQ ID NO :1组成，重链蛋白质氨基酸序列包含或由 SEQ ID NO 2 组成。本发明还涉及与所述人源化嵌合抗体具有相同的CDR序列的多肽，其具有与本发 明所述的人源化嵌合抗体相同或更高的生物活性。本发明术语“本发明的多肽”指与所述 人源化嵌合抗体具有相同的CDR序列的多肽，所述的多肽具有与本发明所述的人源化嵌合 抗体相同或更高的生物活性。在另一个方面，本发明涉及编码本发明的抗体的核酸，其包含编码本发明的抗体 或多肽的多核苷酸或其互补序列。所述的核酸可为DNA或RNA。本领域公知，即使改变核苷 酸的序列，只要最后按照三联密码子遗传法则可翻译出含氨基酸序列SEQ ID N0:1和氨基 酸序列SEQ ID NO 2的抗体蛋白质，均为编码该抗CEA人源化嵌合抗体的多核苷酸。在另一个方面，本发明提供了可用于制备该抗CEA人源化嵌合抗体的重组表达载 体，所述载体包含编码本发明的抗体的核酸。载体可衍生自质粒如F、Rl、RPl、Col、pBR322、 T0L、Ti 等；粘粒；噬菌体如 \、lambdoid、M13、Mu、PI、P22、Q0、T-even、T-odd、T2、T4、T7 等；植物病毒；或者动物病毒。载体可用于克隆和/或表达目的及基因治疗目的。包含与 一或多种调节表达的核酸分子可操纵地连接的编码本发明的抗体的一或多种核酸分子的 载体也包括在本发明内。载体的选择依赖于重组程序及使用的宿主。在宿主细胞中导入载 体可通过磷酸钙转染、病毒感染、DEAE-葡聚糖介导的转染、lipofectamin转染或电穿孔实 现。载体可以自主复制或者可以与其已经整合进其中的染色体一起复制。优选地，所述载 体含有一或多种选择标记。所述标记的选择可依赖于选择的宿主细胞，其对于本发明不是 关键的并且已经为本领域技术人员所熟知。所述标记包括但不限于卡那霉素、新霉素、嘌呤 霉素、潮霉素、zeocin、单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因(HSV-TK)、小鼠二氢叶酸还原酶基因 (dhfr)。具体地，本发明将编码该抗CEA人源化嵌合抗体的轻链和重链的多核苷酸分别重 组克隆入含有真核启动子的两种载体中，并将所得的表达载体导入真核宿主细胞，通过筛 选获得高产量表达本发明的抗体的真核宿主细胞，在该宿主细胞的培养上清中含有大量其 所分泌的该抗CEA人源化嵌合抗体蛋白，根据本领域公知的技术方法可以从中方便地提取并制备该抗CEA人源化嵌合抗体蛋白。一个优选的实施方案中，所述表达载体分别是含 有该抗CEA人源化嵌合抗体基因和氨甲喋呤加压扩增表达选择标志基因(dhfr)并且可在 中国仓鼠卵巢细胞中表达的载体pSRNC-CK -CEA和pSRDC-Cy 1-CEA。一个优选的实施方案 中，所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞CH0。本发明还提供了含有一或多个拷贝的上述载体的宿主。优选地，所述宿主是宿主 细胞。宿主细胞包括但不限于哺乳动物、植物、昆虫、真菌或细菌来源的细胞。使用哺乳动 物细胞如中国仓鼠卵巢(CH0)细胞的表达系统是本发明优选的。一个优选的实施方案中， 本发明提供了重组宿主细胞(RCC-24)，其是含有pSRNC-CK -CEA和pSRDC-C Y 1-CEA的中国 仓鼠卵巢细胞。所述的重组宿主细胞是经过逐步氨甲喋呤加压扩增表达，并经过亚克隆表 达产量筛选出的高表达株，最后经无血清培养驯化获得的。该宿主细胞是于2010年5月4 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No. 3803。根据本发明的一个方面，该抗CEA人源化嵌合抗体蛋白可用于制备诊断或/和治 疗人类CEA阳性肿瘤的药物。通过本发明的抗CEA人源化嵌合抗体偶联示踪分子可制备用 于诊断人类CEA阳性肿瘤的药物。所述的示踪分子可以是放射核素，(例如125I、mIn、99Te 等)或者可采用可用临床可接受的技术手段探测的其它类型的分子，如纳米荧光材料或远 红外材料等。在本发明的一个优选实施方案中，示踪分子是放射核素铼188。将示踪分子偶 联抗CEA人源化嵌合抗体后，通过Y照相机或成像仪可以准确地放射免疫显像诊断CEA阳 性肿瘤，具有较好的信噪比、靶向性和显像质量。本发明的抗体还可用于制备用于治疗肿瘤的药物组合物。此外，可以将一些治疗 性物质如放射性核素与该抗CEA人源化嵌合抗体偶联，制备用于治疗人类CEA阳性肿瘤的 药物组合物。本文中所述的“抗体偶联物”指通过本领域技术人员所公知的各种偶联方法， 将放射性核素等治疗性物质与本发明的抗体偶联所得的偶联物。其中，所述的放射性核素 包括mI、9°Y。在本发明的一个实施方案中，所述治疗性物质是放射核素碘131，将其偶联 抗CEA人源化嵌合抗体后，对CEA阳性肿瘤进行放射免疫治疗，可以非常显著地抑制肿瘤生 长，具有很好的治疗效果并基本不具有明显的毒副作用。在优选实施方案中，本发明的抗 体或抗体偶联物可用于诊断、治疗表达CEA的肿瘤，包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌、其他CEA阳 性肿瘤等。在具体优选的实施方案中，所述表达CEA的肿瘤是结直肠癌。本领域技术人员 根据现有临床诊断技术，检测病人血清中CEA的含量，辅助判断病人肿瘤是否为CEA阳性肿 瘤，完全能够选择适宜的待治疗肿瘤类型。本领域技术人员还应理解，上述的药物组合物中 还可包含药物学可接受的赋形剂。所述抗CEA人源化嵌合抗体可以作为药物通过常规给药途径给予患者，所述的 给药途径例如但不限于经胃肠外给药，例如经静脉、经输注、局部给药等。合适的剂量依 赖于若干个参数，包括给药的方法和所治疗的对象及耐受程度。可以明确的是mI标记的 抗CEA人源化嵌合抗体能明显抑制人结直肠癌的生长，并呈剂量依赖关系。优选的剂量是 12. 5mCi/kg,间隔10天进行2次治疗。本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发 明的范围或实施方式的限定。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领 域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。微生物材料保藏信息
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产生亲本鼠单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞系C24于2010年5月4日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区大屯路，中国科学院微 生物研究所)，保藏号为CGMCC No. 3802。产生人源化嵌合单克隆抗体的CH0细胞系RCC-24于2010年5月4日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区大屯路，中国科学院微 生物研究所)，保藏号为CGMCC No. 3803。
实施例实施例1嵌合抗体基因的克隆、测序采用基因克隆的方法，克隆亲本抗CEA鼠单克隆抗体的轻、重链可变区基因，并进 行核苷酸序列分析。亲本抗CEA鼠单克隆抗体可变区基因的扩增方法鼠单克隆抗体杂交瘤细胞 C24(保藏号CGMCC No. 3802)总RNA的提取按Trizol试剂(Gibco公司)说明书进行，收 集1 X 107鼠单克隆抗体杂交瘤细胞，lOOOOrpm离心lmin，吸弃上清。加入1ml Trizol充 分溶解细胞，室温静置3-5min后加入0. 2ml氯仿，颠倒混勻，4°C下12000rpm离心lOmin， 转移上清约0. 6ml在新的离心管中。加入0. 5ml异丙醇，颠倒混勻，室温静置5-10min，4°C 下12000rpm离心lOmin，弃上清，75 %乙醇洗涤一次，空气干燥，加入50iilddH20溶解沉淀 物。鼠单克隆抗体杂交瘤细胞cDNA第一条链的合成利用MMLV-反转录酶(Gibco公司) 按照厂商提供的说明书进行在20iU的体系中加入5X缓冲液4iU，10mM DDT(Promega 公司)，10 ii g 总 RNA，终浓度 0. 5mM 的 dNTP (Promega 公司)，终浓度 10 ii g/ml 的 Oligo d(T) 15 (Promega 公司)，40u RNasin (Promega 公司)，200u (U) MMLV-反转录酶(Gibco 公 司)，混勻。37°C水浴lh，沸水浴5min灭活反转录酶。鼠单克隆抗体轻重链可变区基因的扩 增使用高精度DNA聚合酶Taq (Promega公司)+Pfu DNA聚合酶(Promega公司)，在100 ill 的反应体系中含有:10X缓冲液10u l,10mM dNTP2u 1, cDNA 20 yl，扩增引物各50pmol， 混勻后表面覆盖石蜡油。95°C水浴5min后，透过石蜡油加入l_2u的Taq+Pfu DNA聚合酶， 开始以下循环，94°C lmin, 55°C lmin，72°C lmin，共30个循环，最后一个循环72°C lOmin。 PCR 引物扩增轻链可变区用的引物PVL5 -GACAT TCAGC TGACCCAGTC TCCA-3‘ (SEQ ID NO 3) ；PVL3 5' -GTTAG ATCTC CAGCT TGGTCCC-3‘ (SEQ ID NO 4)。扩增重链可变区 用的引物PVH5 5' -AGGTS MARCTGCAGS AGTCff GG-3‘ (S = C/G, M = A/C, R = A/G, W = A/T) (SEQ ID NO 5) ；PVH3 5' -TGAGG AGACG GTGAC CGTGG TCCCT TGGCC CCAG-3‘ (SEQID N0 6)。采用0. 7%非变性琼脂糖凝胶电泳分析从亲本抗CEA鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株 中提取的总RNA，18S RNA和28S RNA大小正确，亮度比约1 2，泳道清晰，说明所提总RNA 比较完整(图1)。以Oligo d(T)15为引物合成cDNA第一条链，并以此cDNA为模板，采用 轻链引物PVL5、PVL3进行PCR，扩增出320bp大小左右的轻链可变区基因片段；采用重链引 物PVH5、PVH3进行PCR，扩增出360bp大小左右的重链可变区基因片段；未加模板的空白对 照无扩增带(图2)。扩增出的可变区基因片段大小与一般抗体可变区基因的大小相符。亲本抗CEA鼠单克隆抗体的轻、重链可变区基因的克隆、测序、基因结构分析大 量扩增亲本抗CEA鼠单克隆抗体轻链可变区基因片段，采用玻璃奶吸附法分离回收后以
12Pvu II和Bgl II双酶切，并定向克隆入克隆载体pRGWL的相应位点，共有153个转化克隆， 随机挑取24个克隆筛选，获得6个重组克隆。选取3个VL基因重组克隆进行核苷酸序列 分析，核苷酸序列及推导出的氨基酸序列如图3所示，3个克隆的序列完全相同，说明所克 隆的抗体轻链可变区基因确实为真正的亲本抗CEA鼠单克隆抗体轻链可变区基因。从这3 个克隆中随机挑选一个克隆命名为PRGWH-C502。与Kabat的数据比较可知，亲本抗CEA鼠 单克隆抗体的VL属于小鼠K轻链VI亚群，轻链CDR1-3序列如图3中所示。大量扩增亲本 抗CEA鼠单克隆抗体重链可变区基因片段，采用玻璃奶法分离回收后以Pst I和BstE II 双酶切，并定向克隆入克隆载体PRGWH的相应位点，共有364个转化克隆，随机挑取24个克 隆筛选，获得18个重组克隆。选取3个VH基因重组克隆进行核苷酸序列分析，核苷酸序 列及推导出的氨基酸序列如图3，3个克隆的序列完全相同，证明所克隆的抗体重链可变区 基因确实为真正的亲本抗CEA鼠单克隆抗体重链可变区基因，从中随机挑选一个克隆命名 为PRGWL-C504。与Kabat的数据比较可知，亲本抗CEA鼠单克隆抗体的VH属于小鼠重链 11(B)亚群，重链CDR1-3序列如图3中所示(SEQ ID NO :7_9)。具体地，SEQ ID N0S :7_12 的序列为VH CDR1 (SEQ ID NO:7)His Tyr Tyr Met HisVH CDR2(SEQ ID NO :8)Trp lie Asn Pro Glu Asn Val Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Gin GlyVH CDR3(SEQ ID NO :9)Tyr Arg Tyr Ala Gly Gly Gly Ala Leu Asp TyrVL CDR1(SEQ ID NO :10)Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr lie HisVL CDR2(SEQ ID NO 11)Asp Thr Ser Lys Leu Ala SerVL CDR3(SEQ ID NO 12)Gin Gin Trp Asn Asn Asn Pro Tyr Ser实施例2抗CEA人源化嵌合抗体基因及表达载体的构建采用基因克隆、DNA重组的方法，将亲本抗CEA鼠单克隆抗体的可变区基因重组入 含有调控序列和人抗体恒定区基因的载体中，构建抗CEA人源化嵌合抗体的基因及包含所 述基因的真核表达载体。通过PCR扩增带调控序列的可变区基因片段使用高精度DNA聚合酶Taq+Pfu DNA聚合酶，其中在100 ill的反应体系中含有10X缓冲液10 iil，10mM dNTP 2yl，质 粒1 P g，扩增引物各50pmol，混勻后表面覆盖石蜡油。95°C水浴5分钟后，透过石蜡油加入 l-2u的Taq+Pfu DNA聚合酶，开始以下循环，94°C 1分钟，55°C 1分钟，72°C 1分钟，共20个 循环，最后一个循环72°C 10分钟。抗CEA人源化嵌合抗体真核表达载体的构建和鉴定以经测序鉴定过的实施例1 中所获得的重组克隆质粒PRGWL-C502和pRGWH-C504为模板，使用含两端克隆位点BamH I 和 Not I 酶切位点的引物 PVLS(SEQ IDN0 :13)(序列为5' -GGGTC CAAGC TTGCG GCCGC AACTG AGGAAGCAAA GTTTA AATTC TACTC ACGTT TGATC ACCA-3‘ )+PVNP(SEQ IDN0 :14)(序 列为5' -GCTCG GGAAT TCGGA TCCAT GGGAT GGAGCTGTAT CATCC-3 ‘)禾口 PVHS(SEQ ID NO: 15)(序列为5' -GGGTC CGAATTCGCG GCCGC TATAA ATCTC TGGCC ATGAA G_3' )+PVNP，采 用PCR技术，扩增带有引导肽和5'-端剪接位点的亲本抗CEA鼠单克隆抗体的VL和VH。 通过PCR反应从轻链的重组质粒中扩增出带有引导肽和5'-端剪接位点的亲本抗CEA鼠 单克隆抗体的VL片段，大小约500bp ；从重链的重组质粒中扩增出带有引导肽和5'-端剪接位点的亲本抗CEA鼠单克隆抗体的VH片段，大小约700bp。PCR产物采用玻璃奶法分离 回收后以BamH I和Not I酶切。按《分子克隆》所述进行常规DNA重组操作，将VL克隆入 pSRNC-C k，VH克隆入pSRDC-C y 1中的相应位点，构建成完整的抗CEA人源化嵌合抗体基 因的真核表达载体。在分别将VL和VH连入表达载体pSRNC-C k和pSRDC-C y 1后，分别挑 取12个克隆进行筛选，经酶切鉴定得到9个轻链和7个重链重组克隆。经BamH I和Not I酶切后可切出相应的VL、VH片段，证明构建成功完整的抗癌胚抗原单克隆抗体基因及其 真核表达载体。经2次重复的核苷酸序列测定证明，抗癌胚抗原单克隆抗体真核表达载体 pSRNC-C k -CEA 和 pSRDC-C y 1-CEA 中的可变区基因序列分别与 pRGWL_C502 和 pRGWH_C504 所含的可变区基因序列完全相同。抗CEA人源化嵌合抗体真核表达载体的结构抗CEA人源化嵌合抗体真 核表达载体分别采用了轻链真核表达载体(pSRNC-C k-CEA)和重链真核表达载体 (pSRDC-C y 1-CEA) 2个独立的表达载体，其结构示意图如图4，5所示。实施例3抗CEA人源化嵌合抗体的表达载体转染CH0细胞表达CHO-dhfr—细胞(本室保存)采用含10% FBS、0. 03mmol/l次黄嘌呤(H)、 0. 003mmol/l 胸腺嘧啶脱氧核苷(T)、0. lmmol/1 脯氨酸(Pro)、0. lmmol/1 甘氨酸(Gly)、 100u/ml青链霉素、2mmol/l谷氨酰胺的DMEM完全培养液在5% C02、37°C的条件下培养，常 规按1 10传代，大约3-4天传一代。上述细胞培养试剂购自Gibco公司。采用基因转染 的方法，用Lipofect AMINE试剂(Gibco公司)转染，将抗CEA人源化嵌合抗体的表达载体 转染细胞，并采用不含H、T、Gly的培养基培养进行筛选，待克隆形成后再采用含200 u g/ml 的G418(Gibco公司)的选择培养基培养进行筛选。结果，各取4 yg轻、重链嵌合抗体基因 表达载体转染CHO-dhfr-细胞，约10天后可见克隆生长，计数共约350个克隆。间接ELISA 法测得抗性克隆混合物培养上清0D490 = 1. 622，而阴性对照CH0_dhfr-上清0D490仅为 0. 063，表明转染细胞的上清中有抗CEA人源化嵌合抗体的表达。表1.通过ELISA检测转染后培养细胞上清中的抗CEA人源化嵌合抗体 a，用山羊抗人IgG多克隆抗体包被b，用山羊抗人k链多克隆抗体包被c，用人CEA抗原包被实施例4加压扩增表达，筛选抗CEA人源化嵌合抗体高表达株转染后的CH0细胞采用含10% FBS、100u/ml青链霉素、2mmol/l谷氨酰胺的 DMEM(Gibco公司)完全培养液在5%C02、37°C的条件下培养，常规按1 10传代，大约3_4 天传一代。采用氨甲喋呤(MTX)加压扩增表达筛选方法，筛选高表达株。上清中有抗CEA 人源化嵌合抗体的表达的细胞克隆依次采用含3X10_8M和10_7M的氨甲喋呤(MTX) (Sigma 公司)的完全培养基培养，进行加压扩增表达，每轮加压扩增表达后均采用有限稀释法进 行亚克隆，筛选最高产量的克隆(见图6)。将抗CEA人源化嵌合抗体表达载体转染CH0-dhfr_细胞后初次筛选获得的高效表 达抗CEA人源化嵌合抗体的克隆1C5 (嵌合抗体的产量可达0. 41 u g/ml)采用含3X 10_8M 的氨甲喋呤(MTX) (Sigma公司)的培养基培养，连续培养约30天后，观察细胞形态和生长 速度恢复正常，已适应3 X 10_8M的MTX，嵌合抗体表达产量为10. 4 u g/ml，亚克隆后筛选出 嵌合抗体产量最高的克隆2B2，其嵌合抗体的产量可达16 y g/ml。克隆2B2继续在1 5 传代后换含10_7M MTX的完全培养基培养，细胞适应后，嵌合抗体的产量可达32y g/ml，亚 克隆后筛选出嵌合抗体产量最高的克隆3B2，其嵌合抗体的产量经初步检测就可达80 yg/ ml (见图7)。实施例5可产生抗CEA人源化嵌合抗体的无血清悬浮培养适应细胞株的驯化和制 备采用递减血清的方法驯化无血清悬浮培养适应细胞株，获得高水平分泌表达抗 CEA人源化嵌合抗体的无血清悬浮培养适应型细胞株。在血清培养中贴壁生长的高效表达分泌抗CEA人源化嵌合抗体的rCHO RCC-24细 胞(即克隆3B2)首先在培养瓶中采用含5%血清的DMEM完全生长液培养(Gibco公司)， 待其适应并显示出恒定的生长速度后，已相同方法依次更换为含2%、1%、0. 5%,0. 25%血 清的完全生长液培养，待其适应并显示出恒定的生长速度后，最终更换为完全的无血清培 养基CHO-S-SFM II生长液培养(Gibco公司)。此时细胞已经大部分丧失贴壁生长的特性， 基本属于半悬浮培养。然后待其适应并显示出恒定的生长速度后，将细胞转入摇瓶培养， 80-100rpm,强制细胞悬浮生长，待其适应并显示出恒定的生长速度后，我们将所获得的无 血清悬浮生长的高效表达分泌抗CEA人源化嵌合抗体的新细胞命名为rCHO RCC-24 (SF)细 胞系(保藏号CGMCC No. 3803)。实施例6抗CEA人源化嵌合抗体的特异性、人源性和体内靶向性的鉴定一、抗CEA人源化嵌合抗体的特异性鉴定采用RT-PCR方法，细胞总RNA提取按Trizol试剂说明书进行。具体如实施例1 中所述。cDNA的第一条链的合成利用MMLV-反转录酶(Promega公司)根据厂商说明书进 行。具体如实施例1中所述。PCR扩增实验中，从细胞的cDNA中扩增可变区基因的PCR方 法如实施例中所述。结果表明，从rCHO RCC-24 (SF)细胞系中所扩增的轻重链可变区基因 (图8)经测序与原亲本抗CEA鼠单克隆抗体的轻重链可变区基因相同，故抗癌胚抗原单克 隆抗体应保持亲本抗CEA鼠单克隆抗体的特异性，与CEA特异结合。
采用ELISA方法，以1 y g/ml CEA包被酶标板，加样品反应后，再加羊抗人IgG Fc 片段-HRP酶标抗体(Sigma公司)(不与鼠Ig交叉反应)或羊抗鼠gG Fc片段-HRP酶标 抗体(Sigma公司)(不与人Ig交叉反应)孵育，显色，测0D490值。随后采用人CEA抗原 包被酶标板，羊抗人IgG Fc片段-HRP作二抗进行直接ELISA，转染细胞上清中的抗CEA人 源化嵌合抗体和蛋白A亲和层析柱纯化的抗CEA人源化嵌合抗体均可与包被的CEA抗原结 合，并被羊抗人IgG Fc片段多克隆抗体所识别，呈现强阳性反应，而未转染CHO-dhfr-细胞 培养上清和亲本鼠单克隆抗体则呈阴性反应。在以羊抗鼠IgG Fc片段-HRP作二抗时，则 未转染CHO-dhfr-细胞培养上清和纯化的抗CEA人源化嵌合抗体均呈阴性，而亲本鼠单克 隆抗体则呈阳性反应。无关抗体人IgGl均为阴性。证明所表达的抗CEA人源化嵌合抗体 可与CEA抗原特异结合，与亲本鼠单克隆抗体的抗原结合特异性相同。表2.直接ELISA分析抗CEA人源化嵌合抗体的抗原结合特异性 a，利用羊抗人IgG Fc片段-HRP作为第二抗体b，利用羊抗小鼠IgG Fc片段-HRP 作为第二抗体采用竞争抑制试验，以1 ii g/ml的CEA抗原包被酶标板(Biodesign公司)。加入 2. 5ng/孔的无关小鼠单克隆抗体(自行制备)或2. 5ng/孔的亲本抗CEA鼠单抗C50(自行 制备)与不同浓度的抗CEA人源化嵌合抗体，37°C孵育后再加入羊抗鼠IgG-HRP酶标抗体 (Sigma公司)，反应后测0D490值，并计算其竞争抑制率，竞争抑制率按以下公式计算同时 设无关抗体人IgGl对照。 竞争抑制试验结果如下表，阴性对照无关抗体人IgGl与亲本抗CEA鼠单克隆抗体 反应无竞争抑制作用(竞争抑制率为-12. 80% ) 抗CEA人源化嵌合抗体在与亲本抗CEA 鼠单克隆抗体的比例为2 1时，亲本抗CEA鼠单克隆抗体与抗原的结合即可发生较明显 的竞争抑制，随着嵌合抗体浓度的增加，亲本抗CEA鼠单克隆抗体与抗原的结合反应物减 少，其0D490值逐渐降低，竞争抑制率增加，当比例为32 1时抑制率达40. 85%。这表明 抗CEA人源化嵌合抗体和亲本抗CEA鼠单克隆抗体均可与CEA抗原的相同表位结合，从而证明该抗CEA人源化嵌合抗体与亲本抗CEA鼠单克隆抗体有相同的抗原结合特异性。表3.利用竞争抑制ELI SA检测抗CEA人源化嵌合抗体的特异性
样品_OP490_^！率(％)
2.5ng亲本抗CEA鼠单克隆抗体 CHO-dhfr—细胞上清 2.5ng亲本抗CEA鼠单克隆抗体 0+80ng 人 IgGl
2.5ng亲本抗CEA鼠单克隆抗体 +2.5ng抗CEA人源化嵌合抗体 2.5ng亲本抗CEA鼠单克隆抗体
+ 5ng抗CEA人源化嵌合抗体2.5ng亲本抗CEA鼠单克隆抗体 +1 Ong抗CEA人源化嵌合抗体0.997 + 0.00828,.522,5ng亲本抗CEA鼠单克隆抗体 +20ng抗CEA人源化嵌合抗体0.903 + 0.04135,.222.5ng亲本抗CEA鼠单克隆抗体 +40ng抗CEA人源化嵌合抗体0.884 + 0.00936,.592.5ng亲本抗CEA鼠单克隆抗体 + 8Ong抗CEA人源化嵌合抗体0.825 + 0.04740.85采用免疫荧光试验，以CEA高表达的结肠癌细胞LS180(购自ATCC)为靶细胞，加 入抗CEA人源化嵌合抗体，37°C孵育后再加入羊抗人IgG-FITC荧光二抗(Sigma公司)，反 应后荧光显微镜下观察，同时设无关抗体对照。结果如图9显示，抗CEA人源化嵌合抗体可 以识别CEA高表达的结肠癌细胞LS180上的CEA抗原。采用免疫荧光试验，以CEA表达的多种癌细胞SW1116、L0V0(购自ATCC)为靶细 胞，加入抗CEA人源化嵌合抗体，37°C孵育后再加入羊抗人IgG-Cy5荧光二抗(Chemicon公 司)，反应后荧光显微镜下观察，同时设无关抗体对照。结果(图10)显示，抗癌胚抗原单克 隆抗体可以识别表达CEA的癌细胞上的CEA抗原。二、抗CEA人源化嵌合抗体的人源性鉴定在ELISA实验中，用CEA、羊抗人k链(Sigma公司)或羊抗人IgG多克隆抗体 (Sigma公司)包被酶标板，以羊抗人IgG Fc片段-HRP (Sigma公司)作酶标抗体的ELISA
1.394 + 0.044-
0.000 + 0.0030
1,573 士 0.010-12.8
1.359 + 0.0242.5
1.166 + 0.00616.36
17结果(表4)显示，纯化抗CEA人源化嵌合抗体呈现强阳性反应，而抗CEA人源化嵌合抗体 的亲本鼠单克隆抗体则呈阴性反应。证明纯化的抗CEA人源化嵌合抗体含有人IgG的轻、 重链恒定区。表4.通过ELISA检测抗CEA人源化嵌合抗体的人源性
样品(lOOng/ml)_OD49oaOD490b_OD490C
抗 CEA 人源化嵌合抗体2.361±0.1272.870±0.204 2.570±0.169
亲本鼠单克隆抗体_0.074士0.0000.072±0.008 0.074±0.005
A IgGl 0.072±0.007 2.887±0.186 2.565±0.198 PBS_0.072±0.005 0.070±0.007 0.070±0.007a，用CEA包被b，用羊抗人IgG包被.c，用羊抗人k链包被.采用Western印迹实验，对抗CEA人源化嵌合抗体进行还原型SDS-PAGE，转膜后， 分别以羊抗人IgG Fc片段-HRP或羊抗人k链多克隆抗体进行Western印迹，结果显示 (图11)在55kD处的蛋白条带可被羊抗人IgG Fc片段-HRP识别，染出单一的特异免疫染 色带，大小位置对应于抗体的重链，鼠单克隆抗体对照在此处未出现条带，证明所表达的抗 CEA人源化嵌合抗体重链含有人的恒定区。在25kD处的蛋白条带有可被羊抗人k链多抗 所识别，出现单一的特异免疫染色带，大小位置对应于抗体轻链，鼠单克隆抗体对照在此处 呈阴性反应，表明抗CEA人源化嵌合抗体含有人的k链恒定区。采用羊抗人IgG、羊抗人IgM和羊抗人IgA免疫血清，经免疫双扩散试验测定，结果 表明抗CEA人源化嵌合抗体属于人IgG类免疫球蛋白。采用鼠抗人IgGl、鼠抗人IgG2、鼠 抗人IgG3和鼠抗人IgG4单克隆抗体进行ELISA测定，结果表明抗CEA人源化嵌合抗体为 人的IgGl。三、抗CEA人源化嵌合抗体的体内靶向性鉴定我们采用了多种体内放射免疫实验，包括体内放射免疫摄取实验、体内放射免疫 生物分布实验来检测抗CEA人源化嵌合抗体的体内特异靶向肿瘤性(以CEA阳性肿瘤结肠 癌细胞LS174T荷瘤小鼠为模型)，结果显示，注射核素1251标记的抗CEA人源化嵌合抗体 后，各组织中肿瘤摄取的标记抗体最多，远远高于其他正常组织，最高达33%，并且7d后仍 然维持在26%，能非常好地在肿瘤部位聚集并长时间滞留，正常组织摄取量少，均随着时间 迅速下降，无法滞留(图12) ；T/N比值研究结果表明标记抗体注射24小时后主要分布于肿 瘤，在血池略有分布，但96小时后仅主要分布于肿瘤，显示了核素标记的抗CEA人源化嵌合 抗体可非常特异地分布于肿瘤局部，而不分布于正常组织(图13)。以上的研究结果表明， 抗CEA人源化嵌合抗体具有优异的体内肿瘤靶向性，在动物体内也可与CEA阳性肿瘤细胞 特异地结合，从而特异浓聚并滞留在肿瘤局部，而在除血池以外的正常组织中几乎不分布， 也无滞留。实施例7抗CEA人源化嵌合抗体制备诊断药物用于体内放射免疫显像诊断
我们采用了体内放射免疫显像实验评价了利用本发明的抗CEA人源化嵌合抗体 制备的诊断药物用于体内放射免疫显像诊断的能力，结果(图14)显示，注射核素188Re标 记的本发明的抗CEA人源化嵌合抗体后24小时，即可异常清晰地显像肿瘤，在5-7d后肿瘤 更加清晰，能显示出的最小的肿瘤大小为0. 5cm，具有很好的体内诊断应用价值。实施例8抗CEA人源化嵌合抗体制备治疗药物用于体内放射免疫治疗CEA阳性的 肿瘤用核素碘131标记抗CEA人源化嵌合抗体(简称rch24，约20mCi/mg蛋白)，在荷 人CEA阳性结肠癌细胞LS180(购自美国ATCC)移植瘤的小鼠(所述小鼠右侧背部皮下注 射100万LS180，待瘤体积适宜后进行治疗)体内进行体内放射免疫治疗杀伤结肠癌肿瘤的 有效性研究，结果显示，对于已形成肿瘤(瘤体积超过0. 5cm3后进行治疗)，250 y Ci/剂量 高免疫活性和放射比活性的标记抗体单次治疗对已形成的肿瘤的抑瘤率为81. (表5， 图15)；而125 u Ci/只、以间隔lw的方式给药3次的治疗组(瘤体积约0. lcm3时进行治 疗)的抑瘤率为93% (表6，图16)，肿瘤几乎停止生长，均可显著的抑制人结肠癌的生长。 血相分析及体重变化的初步毒理学研究表明，1311标记的抗CEA人源化嵌合抗体体内放射 免疫治疗人结肠癌时，其血相各成分及小鼠体重在实验组和对照组之间均无显著差异，证 明其并无明显的毒性。
表5. 250 uCi/剂量单次治疗对已形成的肿瘤的抑瘤率为81. 1% 分组只数 平均瘤重抑制率P值
PBS 6
平均瘤重
(X 土 SD,g)
4.048 ±2.428
抑制率
(%)
lilgG 6 rch24 6
3.859±1.928 0。765 ±0.442
81.1
<0.038表6. 125 u Ci/剂量标记抗体3次治疗的抑瘤率为93%
分组
WgG rch24
剂量
SD^)
150 ixCi/只 x 3 8.18 土 6.13
肿瘤重量 抑制率 P值
土
150 (xCi/只 X 3 0.57 土 0.47 93.04 <0.05 在荷人大肠癌裸鼠模型上，观察受试品1311标记抗CEA嵌合抗体rch24的体内抗 肿瘤活性。方法BABL/c nu/nu裸小鼠皮下分别接种人大肠癌细胞LS180、LS174T和SW1116 后8 10天后，分组给药。按瘤体积大小均衡原则分成对照组、“裸”抗CEA人源化嵌合 抗体rch24 156. 2 u g/kg组、625. 0 u g/kg组、相同放射比活性标记的无关人IgG 3. lmCi/ kg 组、12. 5mCi/kg 组、1311 标记的抗 CEA 人源化嵌合抗体 rch24 3. lmCi/kg、6. 25mCi/kg、 12. 5mCi/kg组和阳性化疗药物对照组。受试品和相关对照品尾静脉注射给药，10天1次，
19共2次。定期观察动物一般状态、称体重、量瘤体积、测血清CEA水平和外周血指标、同位素 在瘤组织和非瘤组织的分布。实验结束时处置荷瘤裸鼠称瘤重量。结果受试品1311标 记抗CEA嵌合抗体rch24高剂量组和相同放射比活性标记的无关人IgG高剂量组各有1只 裸鼠死亡。给药后受试品各剂量组的肿瘤体积低于模型对照组，相对肿瘤增殖率低于模型 对照组。低剂量组三个瘤株LS180、LS174、SW1116的抑瘤率在47. 8 71. 4%，中剂量组 在52. 2 75. 0%，高剂量组在65. 2 86. 2%。受试品各剂量组裸鼠血清CEA水平明显低 于模型对照组。与同剂量的“裸”抗CEA人源化嵌合抗体组和1311标记的无关人IgG组比 较，受试品低剂量和高剂量组抑瘤效果更显著。比较三种瘤株抑瘤效果，受试品1311标记 抗CEA嵌合抗体rch24对LS180肿瘤增长抑制作用最强。首次给药48小时和96小时后同 位素在瘤组织分布明显高于非瘤组织。给药后30天，用药组裸鼠的外周血白细胞计数等指 标与模型对照组比较无明显差别。结论受试品1311标记抗CEA嵌合抗体rch24能明显抑 制荷人大肠癌的生长，呈剂量依赖关系，同时降低荷瘤裸鼠血清中CEA水平，在瘤组织中靶 向性分布显著。间隔10天给药2次，30天后用药组荷瘤裸鼠造血功能无明显的变化。表71311标记抗CEA嵌合抗体对荷瘤裸鼠瘤重和抑瘤率的影响(LS180，一批) 注与模型对照组比较，*p < 0. 05，< 0.01, _p < 0. 001 ；与rch24低剂量 组比较，#p < 0. 05，##p < 0.01 ；与rch24高剂量组比较，$$$p < 0. 001 ’与人IgG低剂量组比较，&&p < 0. 01 ；与人IgG 高剂量组比较，_@p <0. 001 ；与 6. 25mCi/kg 组比较，！! p<0.01。表81311标记抗CEA嵌合抗体对荷瘤裸鼠瘤重和抑瘤率的影响(LS180，二批) 注与模型对照组比较，***p < 0. 001 ；与rch24低剂量组比较，###p < 0. 001 ；与rch24高剂量组
比较，$$$p < 0. 001 ；与人IgG低剂量组比较，&&&p < 0. 001 ；与人IgG高剂量组比较，iiip < o. ooi；与 6. 25mCi/kg 组比较，！！！ p< 0.001。
表91311标记抗CEA嵌合抗体对荷瘤裸鼠瘤重和抑瘤專的影响(LS174T，一批)
注与模型对照组比较，***p < 0. 001 ；与rch24低剂量组比较，###p < 0. 001 ；与 rch24高剂量组比较，$$$p < 0. 001 ；与人IgG低剂量组比较，&&&p < 0. 001 ；与3. lmCi/kg 组比较，% p < 0. 05 ；与人IgG高剂量组比较，iiip < 0. 001。表101311标记抗CEA嵌合抗体对荷瘤裸鼠瘤重和抑瘤率的影响(LS174T，二批) 注与模型对照组比较，***p < 0. 001 ；与rch24低剂量组比较，###p < 0. 001 ；与 rch24高剂量组比较，$$$p < 0. 001 ；与人IgG低剂量组比较，&&&p < 0. 001 ；与3. lmCi/比 组比较，% p < 0. 05 ’与人IgG高剂量组比较，iiip < 0. 001 ；与6. 25mCi/kg组比较，！ p < 0. 05。表111311标记抗CEA嵌合抗体对荷瘤裸鼠瘤重和抑瘤率的影响(SW1116，一批) 注与模型对照组比较，***p < 0. 001 ；与rch24低剂量组比较，###p < 0. 001 ；与rch24高剂量组
比较，$$$p < 0. 001 ；与人IgG低剂量组比较，&&p < 0. 01 ；与人IgG高剂量组比较，iiip < o. 001。
表121311标记抗CEA嵌合抗体对荷瘤裸鼠瘤重和抑揭■率的影响(SW1116，二批)
注与模型对照组比较，***p < 0. 001 ；与rch24低剂量组比较，###p < 0. 001 ；与 rch24高剂量组比较，$$$p < 0. 001 ；与人IgG低剂量组比较，&&&p < 0. 001 ；与人IgG高剂 量组比较，_@p <0. 001 ；与 6. 25mCi/kg 组比较，！! p<0. 01。
权利要求
一种人源化嵌合单克隆抗体或其功能变体，其中所述单克隆抗体的重链包含SEQ ID NO7 9所示的CDR区，所述单克隆抗体的轻链包含SEQ ID NO10 12所示的CDR区。
2.权利要求1的抗体或其功能变体，所述单克隆抗体含有重链氨基酸序列SEQID NO 1和轻链氨基酸序列SEQ ID NO :2。
3.一种多肽，其具有与权利要求1或2的人源化嵌合抗体或其功能变体的CDR区相同 的CDR区，并且具有与权利要求1所述的人源化嵌合抗体相同或更高的生物活性。
4.一种核酸，其包含编码权利要求1-3之一的人源化嵌合抗体或多肽的多核苷酸或其 互补序列。
5.权利要求4所述的核酸，其为DNA或RNA。
6.表达载体，其中含有编码氨基酸序列SEQID NO :1或SEQ IDNO :2的多核苷酸，优选 所述表达载体在真核细胞具体是中国仓鼠卵巢细胞中高效表达。
7.权利要求6的载体，其为图4所示的pSRNC-Cκ -CEA或图5所示的pSRDC_C y I-CEA0
8.宿主细胞，其含有权利要求4或5所述的核酸，或含有权利要求6或7所述的载体。
9.权利要求8所述的宿主细胞，其为中国仓鼠卵巢细胞，具体是保藏号CGMCCNo. 3803 的细胞。
10.治疗有效量的权利要求1-3之一所述的抗体或多肽或权利要求4或5所述的多核 苷酸或其互补序列或权利要求6或7所述的载体或权利要求8或9所述的宿主细胞在制备 抗肿瘤药物中的用途。
11.权利要求1-3之一所述的抗体或多肽在制备肿瘤诊断剂中的用途。
12.权利要求10或11所述的用途，其中所述的肿瘤选自结直肠癌，胃癌、肺癌、乳腺癌、 胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、膀胱癌、胆囊癌和食管癌组成的组，优选为结直肠癌。
13.权利要求10所述的用途，其中所述的抗肿瘤的药物包含与放射免疫治疗剂偶联的 权利要求1-3之一所述的抗体或多肽作为活性成分，优选地所述放射免疫治疗剂是碘131。
14.根据权利要求11所述的用途，其中所述的肿瘤诊断药物包含与放射免疫显像剂偶 联的权利要求1-3之一所述的抗体或多肽作为活性成分，优选地放射免疫显像剂是铼188。
全文摘要
本发明涉及一种抗癌胚抗原(CEA)人源化嵌合抗体，编码该抗体的多核苷酸，包含该多核苷酸的表达载体以及含有所述表达载体的宿主细胞，以及它们在制备用于诊断和/或治疗肿瘤的药物中的用途。
文档编号C12N5/20GK101928347SQ20101016305
公开日2010年12月29日 申请日期2010年5月5日 优先权日2010年5月5日
发明者冉宇靓, 杨治华 申请人:上海海抗中医药科技发展有限公司