专利名称：在植物中表达蛋白质的制作方法
在植物中表达蛋白质本发明是国际申请号PCT/ZA2006/000063，国际申请日为2006年5月2日，进入中国国家阶段日期为2007年10月26日，中国国家申请号为200680014202. 5，发明名称为“在植物中表达蛋白质”的分案申请。
背景技术：
本发明涉及在植物中表达蛋白。特别地，本发明涉及转基因蛋白表达和高产量蛋白生产的细胞内定位的方法。本发明还涉及在植物中生产人乳头瘤病毒(HPV)蛋白和/或流感病毒H5蛋白。本发明还涉及评估蛋白在植物内表达的快速机制。应用转基因植物进行异源蛋白的大规模生产正逐渐获得广泛的接受，并且可能成为疫苗蛋白节约成本生产的平台。产生转基因植物研究一大类蛋白和/或表达载体的表达特征并不总是可行的，原因在于这一程序费时的本质。相反，瞬时表达系统能够快速评估各种不同的蛋白在各种植物物种中的蛋白表达。关于应用转基因植物进行大规模蛋白生产的另一个问题通常是生产的异源蛋白的令人失望的低水平。植物质体，特别是叶绿体，已经成功地被表达异源蛋白的重组载体转化，以显著地增加植物中由每份总可溶蛋白所产生的蛋白水平(参见，例如，W02005/011367和W02004/005467A2)。质体还能够输入各种分子，包括蛋白。存在不同的方法，通过这些方法发生分子输入，一个这样的方法涉及与质体的类囊体膜相互作用。异源蛋白靶向质体是一种显著增加蛋白在植物细胞内的积聚的机制。许多年来一直应用农杆菌(Agrobacterium)介导的基因转移来产生稳定的转化植物。这种方法包括将T-复合物(一种由农杆菌T-DNA和毒力基因产物形成的复合物)从农杆菌菌株转移到植物细胞(Zupan等.，2000)。将位于限定单链T-DNA的25bp同向重复序列(左和右边界)之间的任何DNA转运到植物细胞核中(Zupan等.，2000)，在这里它通过不正常重组而整合到植物染色体上(Somers和Makarevitch, 2004)。在所述核内存在的许多T-DNA拷贝没有结合，但是得到转录，这引起瞬时表达。瞬时表达不受位置效应的影响，并且可以产生比稳定转化显著更高的外源蛋白水平(Kapila等.，1997)。通常应用两种农杆菌侵入(农杆菌侵入法)方法注射和真空侵入。农杆菌注射包括直接注射到叶片的远轴气室，而叶片仍然附着在植物上(Voinnet等.，2003)。在真空侵入过程中，对农杆菌混悬液应用真空，叶片浸没在所述混悬液中(Kapila等.，1997)。尽管通常只在少数叶片上进行，但是这一技术可以规模化Medicago Inc. (Quebec, Canada)的研究者每周能够进行农杆菌侵入多达7500片苜蓿叶片，并且Stefan Schillberg及同事(Institute for Molecular Biotechnology,RffTH Aachen,Germany)已经进行了农杆菌侵入了多达100kg的烟草叶片(Twyman 2004)。农杆菌介导的瞬时表达在侵入后60到72小时达到最大,然后由于转录后基因沉默(PTGS)而迅速下降(Voinnet等.，2003)。PTGS或RNA干扰是一种适应性抗病毒抵御反应，其限制病毒在植物中 的复制和传播。这一过程包括在胞质中识别靶点RNA和起始序列-特异性RNA降解途径(Voinnet，2001)。某些植物病毒编码具有抑制PTGS能力的沉默阻抑制子。这些沉默抑制蛋白中的一些，诸如番茄斑萎病毒(TSWV)的NSs (Takeda等，2002)，和番爺丛矮病毒的pl9 (Voinnet等.，2003)已经用来延长和扩增农杆菌介导的瞬时表达，其通过包含沉默抑制基因的农杆菌的共同侵入而进行。对于将商购蛋白在植物中的表达优化以达到使植物成为可行平台的水平存在需求。具体地，存在对于在植物中生产HPV蛋白和/或流感病毒H5蛋白的方法的需求。还存在对载体、转基因植物或其部分和这样的植物的子代的需求以实现如前文所述的需要。发明概述按照本发明的第一方面，提供一种在植物中生产HPV多肽和/或流感病毒H5多肽的方法，其包括步骤1.将HPV基因和/或流感病毒H5基因或编码它们的功能等价物的核酸克隆到适于靶向植物中存在的成分的载体中；2.用所述载体侵入至少植物的部分，或者用所述载体转化植物组织，以瞬时表达HPV多肽和/或流感病毒H5多肽，和/或产生转基因植物；和3.回收由植 物表达的HPV多肽和/或流感病毒H5多肽。术语‘植物’意欲包括缺少专门的感觉器官和自主运动能力的所有生命有机体。同样地，所述定义包括单子叶植物和双子叶植物以及所有的光合生物。术语‘HPV多肽’意欲包括HPV LI蛋白；与另一 HPV抗原肽融合的嵌合HPV LI肽；与衍生于任何抗原表位、B细胞或T细胞特异性的异源肽融合的嵌合HPV LI肽以及HPVL2蛋白或它们的功能等价物。已作必要的修正，同样的意思适用于术语‘HPV基因’。术语‘植物成分’意欲包括质体、内质网、细胞质和质外体。优选地所述植物成分是质体。靶向意指载体中可以包含靶向序列。这样的靶向序列可被翻译成肽，所述肽将载体或其产物导向植物中需要的成分，诸如质体。按照本发明的载体优选地包括可操作性地连接到编码序列上的启动子和其它必需调节子，诸如终止子等。应该理解用载体侵入植物的至少一部分可以引起蛋白的瞬时表达，并且用载体转化植物组织以产生转基因植物可以引起蛋白的转基因表达，意欲这两种形式的表达都属于本申请的范围。在本说明书中，提及蛋白、肽或基因或它们的功能等价物包括提及其变体，所述变体能够很大程度上行使与蛋白、肽、多肽或基因相同的功能。优选地，本发明涉及HPV-16L1蛋白的生产；与另一 HPV抗原肽融合的嵌合HPV LI肽；与衍生于任何抗原表位、B细胞或T细胞特异性的异源肽融合的嵌合HPV LI肽；HPV L2蛋白；或流感病毒H5蛋白。优选地，所述载体是二元载体，更优选地为根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens) 二兀载体。所述载体可以适于靶向质体，其通过使得所表达的多肽包括能够与质体的类囊体膜特别是类囊体膜的转运结构相互作用的部分而进行。这一相互作用可以使得多肽从其所表达的细胞质输入到质体中。输入到细胞质的机制对于蛋白的正确折叠可能是重要的。然而，应该理解所述载体可以适于靶向要转化的质体本身，并且多肽的表达可以完全在质体内发生。
不希望受到理论局限，本申请人认为进入到质体的多肽以其一级结构进入，并且在质体内进行折叠成其二级和三级结构，即，远离细胞的细胞质。同样地，本申请人认为通过载体表达多肽可以发生在质体内，然后在其中它采用其二级和三级结构是发明原理的合理外延。换句话说，本申请人认为发明原理延伸到质体的转化。在这样的条件下，蛋白的表达完全发生在质体内，并且不与细胞的细胞质接触。优选地，所述HPV LI基因；与另一 HPV抗原基因融合的嵌合的HPVLl基因；与衍生于任何抗原表位、B细胞或T细胞特异性的异源基因融合的嵌合HPV LI基因；HPV L2基因；或流感病毒H5基因是优化的基因，例如，人密码子优化的，BCG密码子优化的或植物密码子优化的。HPV LI基因或HPV LI嵌合体的基因还可以以另一种方式修饰，例如，核定位信号缺失。按照本发明的方法还可以包括用抑制蛋白共同侵入植物的步骤，所述抑制蛋白适于抑制植物中的转录后基因沉默。优选地所述抑制蛋白是番茄斑萎病毒的NSs蛋白或番茄丛矮病毒的pl9。最优选地所述抑制蛋白是NSs。在本发明的一个优选的实施方案中，所述质体选自叶绿体、色质体和白色体。所述质体优选地是叶绿体。侵入可以通过直接注射或通过真空进行。按照本发明的一个方面，完整植物可以进行真空侵入。在本说明书中，‘完整植物’应该认为包括这样的植物，即，去除根的植物以及部分落叶的植物和很大程度上完整的植物。提及植物应该包括提及植物部分，其包括但不限于种子、叶片、根、茎、花、果实、胚、分生组织、下胚轴、上胚轴、子叶、花粉和组织。在按照本发明的方法中，植物的侵入和转化可以用被转化接受了所述载体的根癌农杆囷来完成。植物还可以选自Nicotiana benthamiana和烟草(N. tabacum)。然而，应该理解支持瞬时蛋白表达或者被转基因的任何植物应该都适用于本发明的目的。侵入优选地在植物叶片上进行。直接注射侵入优选地在叶片的远轴区域进行。按照本发明的第二方面，提供在植物中生产HPV多肽和/或流感病毒H5多肽的方法，其中基本上通过真空侵入方法用适当的载体侵入完整的植物。按照本发明的第三方面，提供HPV多肽和/或流感病毒H5多肽，其按照上述方法随时产生。按照本发明的第四方面，提供其中已经克隆了 HPV基因和/或流感病毒H5基因的载体的应用，所述载体适于靶向植物中存在的成分，以产生能够表达HPV多肽和/或流感病毒H5多肽的转基因植物。按照本发明的第五方面，提供其中已经克隆了 HPV基因和/或流感病毒H5基因的载体，所述载体适于靶向植物中存在的成分，以产生能够表达HPV多肽和/或流感病毒H5多肽的转基因植物。按照本发明的第六方面，提供预防性或治疗性疫苗，其由能够在适当宿主内诱导免疫原性反应的由上文所述的方法随时产生的HPV多肽或流感病毒H5多肽组成。按照本发明的第七方面，提供一种转基因植物，其部分或其子代，其包含能够表达HPV多肽和/或流感病毒H5多肽的细胞。在本发明的这些后续方面中，已经做了必要的修正，应用第一方面的选择和优选。
对于将商购蛋白在植物中的表达优化以达到使植物成为可行平台的水平存在需求。一个实例是生产HPV LI主要衣壳蛋白，作为用于人疫苗或试剂目的的病毒壳粒和/或作为病毒样颗粒(VLPs)。通过按照本发明的教导，通过农杆菌侵入法进行瞬时表达可以比较许多抗原性蛋白的表达，以及植物细胞区室靶向蛋白的效果。所述方法包括通过直接注射或者通过在浸没或浸泡在农杆菌培养物中的叶片上产生真空，而将携带表达载体的根癌农杆菌重组子侵入到植物中。人密码子优化的或BCG密码子优化的HPV LI以比其它LI序列显著更高的水平进行表达，并且人密码子优化作用还导致流感H5蛋白的高表达。叶绿体靶向导致比细胞质或内质网(ER)-靶向显著更高的积聚。HPV LI完整植物提取物的电子显微镜检揭示LI在植物中组装成病毒样颗粒(VLPs)。产生的蛋白还与适当的HPV L1-特异性单克隆抗体(MAbs)反应，所述单克隆抗体识别构象-特异的表位。通过在植物中瞬时表达获得的LI在小鼠中诱导了高水平的L1-特异性抗体，并且发现在体外中和检测中这些抗体被中和。在植物叶绿体中促进高瞬时LI表达的表达载体用来产生转基因植物，所示转基因植物还表达如上文所述的高水平的其它多肽。农杆菌真空侵入典型地包括从茎上去除的叶片的侵入。本发明描述了完整植物或完整的无根植物的新型真空侵入。具有小根系的完整植物可以从土壤中移出，被侵入并且重新植入，而不丧失活力。大根系可以移出，植物被侵入，然后重新植入种植泡沫中培养至少3天而不丧失活力。具有复杂根系的植物还可以水栽生长，这允许不移出根进行侵入。侵入方法之后，完整植物比松散叶片更容易培育，并且它们存活更长，因此增加外源基因的表达。侵入完整植物的优点在于可能通过瞬时表达将外源蛋白生产规模化到商业可行的水平。
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本发明还教导了通过农杆菌侵入法或者在转基因植物中HPV LI蛋白靶向特定的植物细胞亚区室(ER和叶绿体)。与ER-靶向和细胞质积聚相比，叶绿体靶向显著增加了LI的积聚。叶绿体积聚可以通过细胞质中存在的蛋白酶而防止LI蛋白降解，和/或允许其积聚到更高的浓度，而并不影响植物细胞的功能。如上文所述，同样的考虑也适用于其它多肽。
实施例现在将参考下述非限制性实施例对本发明进行描述。实施例1高水平表汰HPV LI蛋白表汰构津体3 个农杆菌载体pTRAc, pTRAkc-rbcsl-cTP 和 pTRAkc_ERH(
图1)从 RainerFischer (Fraunhofer Institute, Aachen,德国)获得。pTRAc载体由下列各项组成花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子(P35SS)，重复转录增强子，查耳酮合酶5'未翻译区(CHS)和CaMV 35S多腺苷酸化信号(pA35S)用于外源基因表达；用于烟草RB7基因的2个支架附着区(SAR);用于T-DNA整合的左和右边界；用于大肠杆菌(E.coli)和根癌农杆菌的复制起点；以及用于抗生素选择的bla基因。pTRAkc-rbcsl-cTP是pTRAc的衍生物，具有附加的rbcs-cTP序列(来自爺属(Solanum)核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基的叶绿体革巴向信号)，与外源基因形成3'融合。pTRAkc-ERH也是pTRAc的衍生物，并且包括KDEL和his6序列，与外源基因形成5'融合。pTRAkc-rbcsl-cTP和pTRAkc-ERH载体还包括nptll基因，用于在植物中的卡那霉素抗性。将4种HPV-16L1基因变体克隆到上文提及的农杆菌载体中(I)南非分离体，SALl (GenBank登记号AY177679)；⑵人密码子优化的LI (HLl，图2) ； (3)植物密码子优化的LI (SYNL1,图3)，和(4)核定位信号缺陷，HLl的22个氨基酸平截物，HLl Δ C22。为了促进定向克隆，通过PCR扩增将限制酶位点添加到LI基因的终点。SALl用有义引物5 ' -GGACGCGTTAGGTACATGTCTCTTTGGCTGCCT (SEQ.1D NO.1)和反义引物5' -TCTAGACTCGAGTTACAGCTT ACGTTTTTTGCGTTT(SEQ.1D NO. 2)进行扩增，用 AfI III 和Xho I消化，并且克隆到pTRAc的相同位点，形成pTRA-SALl ;或者用Mlu I和Xho I消化，并且克隆到pTRAkc-rbcsl-cTP的相同位点，形成pTRACTP-SALl。SALl也用上述有义引物和反义引物5' -AGCGGCCGC CAGCTTACGTTTTTTGCG(SEQ.1D NO. 3)进行扩增，用 AfI III 和Not I消化，并且克隆到pTRAkc-ERH的Nco I和Not I位点，形成pTRAERH-SALl。SYNLl 用有义引物5' -GGACGCGTGA GATTCATGAGCCTTTGGCTC CCT(SEQ.1D NO. 4)和反义引物5' -ATCTAGACTCGAGTTAGAGCTTCCTCTTCTTCCTCTT(SEQ.1D NO. 5)进行扩增，用Bsp HI和Xho I消化，并且克隆到pTRAc的Afl III和Xho I位点，形成pTRA-SYNLl ;或者用Mlu I和Xho I消化，并且克隆到pTRAkc-rbcsl-cTP的相同位点，形成pTRACTP-SYNLl。SYNLl 还用上述有义引物和反义引物5' -AGCGGCCGCGAGCTTCCTCTTCTTCCTCTT(SEQ.1DNO. 6)进行扩增，用Bsp HI和Not I消化，并且克隆到pTRAkc-ERH的Nco I和Not I位点，形成 pTRAERH-SYNLl。HLl 用有义引物5' -GGACGCGTGAGGTTCATGAGCCTGTGGCTGCCC(SEQ.1D NO. 7)和反义引物5' -ATCTAGACTCGAGTCACAGCTTGCGCTTCT TCCG(SEQ.1D NO. 8)进行扩增，用 Bsp HI和Xho I消化，并且克隆到 pTRAc的Afl III和Xho I位点，形成pTRA_HLl ;或者用MluI和Xho I消化，并且克隆到pTRAkc-rbcsl-cTP的相同位点中，形成pTRACTP-HLUHLl还用上述有义引物和反义引物5' -AGCGGCCGCCAGCTTGCGCTTCTTCCGC(SEQ.1D NO. 9)进行扩增，用Bsp HI和Not I消化，并且克隆到pTRAkc-ERH的Nco I和Not I位点，形成pTRAERH-HLl。HLl Λ C22通过PCR扩增HLl形成，其使用上述有义引物和反义引物5' TCTAGACTCG AGTCAGCCCA GGGTGAACTT AGG(SEQ.1D NO. 10)进行，以促进在 NLS 之前终止(Zhou等· 1991)。将PCR产物用Mlu I和Xho I消化，并且克隆到pTRAkc-rbcsl-cTP的相同位点，形成pTRACTP-HLl Δ C22。使用有义引物5' GGACGCGTT A GGTCCATGGCTAGCAAAGGAGAAG(SEQ.1D NO. 11)和反义引物5 ' ATCTAGATTATTTGTAGAGCTCATCCATG(SEQ.1D NO. 12)从pBSG1057(BiosourceTechnologies Inc, Vacaville, USA)扩增 30B-GFPC3 突变体(GeneBank登记号U62637) gfp基因，用Nco I和XbaI消化，并且克隆到pTRAc的相同位点，形成 pTRA-GFP。农杆菌转化按照(Shen和 Forde，1989)所述，将农杆菌 GV3101: :pMP90RK(从 RainerFischer, fraunhofer Institute, Aachen 获得)制成电感受:态。将 50-200ng 上述 HPV-16 LI/农杆菌载体与100 μ I电感受态细胞混合在O.1cm电隙杯(BioRad)中。将所述细胞在 设定为1. 8kV, 25 μ F 和 200 Ω 的 GenePulser (BioRad)中进行转化。
在涂布到含有50μ g · ml—1羧苄西林，50 μ g · ml-1利福平和30 · ml-1卡那霉素的 LB上之前，将电穿孔的细胞在Iml LB中培养2小时。通过从重组农杆菌菌落分离质粒DNA， 并且将质粒DNA重新转化到大肠杆菌DH5 α细胞中，并且在100 μ g/ml氨苄青霉素上选择 而验证阳性克隆。表A.使用的农杆菌重组子的总结
权利要求
1.在植物中生产流感病毒H5多肽的方法，所述方法包括下列步骤 i)将流感病毒H5基因或编码其功能等价物的核酸克隆到适于靶向植物中存在的组分的载体中，其中所述植物组分选自由内质网和质外体组成的组； )用所述载体侵入所述植物的至少一部分，或者用所述载体转化植物组织，从而瞬时表达所述流感病毒H5多肽，和/或产生转基因植物；和 iii)回收由所述植物表达的流感病毒H5多肽。
2.权利要求1的方法，其中一个或多个靶向序列包含于所述载体中，所述靶向序列编码将所述流感病毒H5多肽从细胞质导向所述植物组分的多肽。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述载体包括可操作地与所述载体的编码序列连接的启动子和其它调节子等。
4.前述权利要求任一项的方法，其中所述载体是二元载体，优选根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 二兀载体。
5.前述权利要求任一项的方法，其中所述流感病毒H5基因是密码子使用优化的基因，优选人密码子使用优化的基因、BCG密码子使用优化的基因或植物密码子使用优化的基因。
6.前述权利要求任一项的方法，其还包括用在植物中适于抑制转录后基因沉默的抑制蛋白共同侵入所述植物的步骤，所述抑制蛋白如番茄斑萎病毒的NSs蛋白或番茄丛矮病毒的 P19。
7.前述权利要求任一项的方法，其中所述侵入通过直接注射或通过真空进行。
8.前述权利要求任一项的方法，其中所述植物的侵入和/或转化用根癌农杆菌完成，所述根癌农杆菌已经被转化接受了所述载体。
9.前述权利要求任一项的方法,其中所述植物选自Nicotianabenthamiana和烟草(N. tabacum)。
10.前述权利要求任一项的方法，其中所述流感病毒H5基因或编码其功能等价物的核酸选自
图10和11所示的序列。
11.前述权利要求任一项的方法，其中所述侵入是在所述植物叶片上进行的，优选其中所述侵入是通过在所述叶片的远轴区上直接注射进行的。
12.权利要求1-10任一项的方法，其中基本上将完整的植物通过真空侵入方式用适当的载体侵入。
13.已经在其中克隆了流感病毒H5基因的载体的应用，所述载体适于靶向植物中存在的内质网和质外体组分，从而在细胞质中瞬时表达所述流感病毒H5多肽，然后将所述流感病毒H5多肽输入到所述植物组分中，和/或产生转基因植物，在所述转基因植物中，所述流感病毒H5多肽在细胞质中表达，然后被输入到所述植物组分中。
14.已经在其中克隆了流感病毒H5基因的载体，所述载体适于靶向植物中存在的内质网和质外体组分，从而在细胞质中瞬时表达所述流感病毒H5多肽，然后将所述流感病毒H5多肽输入到所述植物组分中，和/或产生转基因植物，在所述转基因植物中，所述流感病毒H5多肽在细胞质中表达，然后被输入到所述植物组分中。
15.权利要求1-13任一项的方法产生的转基因植物、其部分或其子代，其包含能够表达流感病毒H5多肽的细胞。
全文摘要
在植物中表达蛋白质本发明涉及在植物中生产流感病毒H5多肽的方法，所述方法包括下列步骤将流感H5基因或编码其功能等价物的核酸克隆到适于靶向植物中存在的组分的载体中，用所述载体侵入植物的至少一部分，或者用所述载体转化植物组织，以瞬时表达所述流感病毒H5多肽和/或产生转基因植物；和回收由所述植物表达的流感病毒H5多肽。本发明还涉及在所述方法中使用的或者作为所述方法的结果产生的载体、转基因植物或其部分和这样的植物的子代。
文档编号A01H5/00GK103031310SQ20121048832
公开日2013年4月10日 申请日期2006年5月2日 优先权日2005年4月29日
发明者安娜-莉泽·威廉森, 爱德华·彼德·雷比茨基, 詹姆斯·马尔科姆·麦克莱恩, 因加·伊莎贝尔·贝克尔-希策尔奥特 申请人:开普敦大学