比 对分析结果筛选出8个siRNA片段，如表1所示，为用于siRNA的ZfycDNA模板。分别在 每个siRNA片段的5'和3'添加化〇1I和化aI酶切位点，然后合成siRNA片段并筛选 出两对shRNAi干扰片段。
[0041] 表2两对shRNAi干扰片段
[0042]
柳43] 实施例2 W44] 实施例1中所述的两对shRNAi干扰片段的筛选方法具体如下： W45] 1、构建Zfy基因的RNAi干扰载体：
[0046] 所使用的Zfy基因序列来自于NCBI基因库，根据RNAi设计原则和在NCBI上的比 对分析结果筛选出8个SiRNA片段，如表1所示，为用于SiRNA的ZfycDNA模板。分别在 每个SiRNA片段的5'和3'添加化〇1I和化aI酶切位点，然后送生物公司合成SiRNA片 段。正、反义链通过退火合为双链连接到plentilox3. 7(Addgene，美国）慢病毒包装系统载 体上，然后转化到E.coliD册α感受态细胞中灯iangen，中国）进行扩增，提取质粒-20°C 保存。
[0047] 2、Zfy基因的体外干扰试验：
[0048] 选取1岁龄的健康雄性绵羊睾丸2只，75%酒精打湿消毒，双抗PBS浸泡冲洗，细 胞培养室内，采用两步酶消化法分离出睾丸支持细胞和生精细胞。将运些分离出的细胞放 入含10 %胎牛血清的HamF12/DMEM培养液中，内添加肥PES(15mol/L)、lOOkU/L青霉素w及0.Ig/L链霉素、lug/ml表皮生长因子、lOOul口S(膜岛素，转铁蛋白，砸酸钢）{膜岛 素（10μg/ml)、转铁蛋白（10μg/mD}、3. 3X10 ^mol/L视黄酸、维生素A(；3. 3X10 ^mo/L)、 10μg/ml维生素E、104mol/L维生素C、103mol/L丙酬酸、10 7mol/L睾酬、2抓/LRF甜。约 按1X106CElVcm2的密度接种于放有盖玻片的六孔板中，在32°C、5 %C02、湿度为95 %的条 件下培养24小时，用巧离子作为转染试剂将构建好的载体转染到生精细胞中，每组重复Ξ 次。转染48小时后提取生精细胞的总RNA，用RT-PCR检测Zfy基因的mRNA表达水平。如 表3所示为目的基因引物序列及PCR条件。 W例表3目的基因引物序列及PCR条件 阳化0]
W51] 挑选出干扰效果较好的；个进行下一步的实验，如表4所示，W下简称P11A狂fyl759)、PllF(zfyl773)和P11G狂fyl888)，表 4为筛选出的带有Hpal和化〇11 酶 切位点的ZfyRNAi序列。 阳化引表4筛选出的带有化al和化oil酶切位点的ZfyRNAi序列
[0053]
[0054]3、Zfy基因的动物体内干扰试验：
[0055] 将提取的质粒加入带双抗的PBS溶液进行稀释，然后按1. 5mg/管的量稀释至8ml， 对质粒进行分装。将六只健康的湖羊公羊分为Ξ组，第一组注射pLLA，第二组注射pLLF，第 Ξ组注射pLLG，按每只羊每侧睾丸1. 5mg的剂量沿睾丸纵轴接近附睾Ξ分之一处使用12号 穿刺针注射。注射时，边注射边缓慢回抽穿刺针，注射完毕后，慢慢将穿刺针拔出，并对注射 孔严格消毒措施。间隔lOd注射一次，共注射3次。第Ξ次注射后第4d开始采集公羊精 液，随即进行人工授精，与配母羊每组200只，登记与配母羊耳号、配种日期，对后代的性别 比例数量进行统计分析。
[0056] 结果如下：
[0057] 1、RT-PCR检测生精细胞中Zfy基因mRNA的表达水平：
[0058] 如图1所示，结果显示实验组化LA，PLLF，PLLG中Zfy基因mRNA的表达水平均低于 对照组（生理盐水组）。其中化LF，PLLG与对照组比较差异显著（P< 0. 05);化LA差异极 显著（P< 0. 01)。所W初步选取化LA，PLLF，PLLG作为对zfy基因干扰效果较好的shRNA 片段，如表3所示。
[0059] 2、子一代绵羊的性别比例：如图2所示，结果显示实验组化LF，化LG，子一代绵羊 的雌黑率与对照组没有差异（P> 0. 05)，而实验组化LA的子一代绵羊的雌黑率较对照组 高，差异显著（P< 0. 05)，雌黑率可达76. 50 %，显著高于对照组48. 00 %。表5为各组后代 (子一代）公母羊数量和雌黑率。
[0060] 表5子一代黑羊雌雄数据统计表
[0061]
阳06引注：各组跟对照组比较，无上标的为差异不显著；表示差异显著巧<0. 。 阳〇6引实施例3
[0064] 一种RNAi干扰载体，包括序列为SEQIDNO. 1所示的RNAi干扰片段，其制备方法， 包括如下步骤：
[00化](1)酶切pLentiLox3. 7 载体；
[0066] (2)将所述RNAi干扰片段与酶切后的所述pLentiLox3. 7载体连接，得到连接产 物；
[0067] 其中，所述RNAi干扰片段序列为沈QIDNO. 1 ;
[0068] (3)将所述连接产物转化至感受态细胞中，W含有pLentiLox3. 7载体、酶切位点 和发夹结构来筛选并将得到的菌液进行测序鉴定，并将测序结果与所述RNAi干扰片段序 列完全一致的菌液进行扩增；
[0069] 所述酶切位点为化al和化oil;所述发夹结构序列为SEQIDNO. 3 ;
[0070] (4)从所述扩增的菌液中提取RNAi干扰载体。
[0071] 其中载体构建示意图如图3所示。 阳〇巧 实施例4
[0073] 与实施例3的不同之处在于，本实施例中的RNAi干扰载体，包括序列为SEQID NO. 2所示的RNAi干扰片段，相应的制备过程中的序列为SEQIDNO. 1所示的RNAi干扰片 段和序列为SEQIDNO. 3的发夹结构替换为序列为SEQIDNO. 2所示的RNAi干扰片段和 序列为SEQIDNO. 4的发夹结构。 阳074] 其中实施例3和实施例4中的RNAi干扰载体对绵羊子一代雌黑率的影响及其与 正常的子一代雌黑率对比的方法和结果如实施例2中的筛选过程。
[0075] W上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽 然本发明已W较佳实施例掲露如上，然而并非用W限定本发明，任何熟悉本专业的技术人 员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述掲示的技术内容作出些许更动或修 饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质 对W上的实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围 内。
【主权项】
1. 一种RNAi干扰片段，用于干扰动物Y染色体上的Zfy基因，其特征在于，所述RNAi 干扰片段序列为SEQIDNO. 1或SEQIDNO. 2所示； 所述Zfy基因负责编码的蛋白作为转录因子，与精子的发生有关。2. 权利要求1所述的RNAi干扰片段作为制备干扰动物Y精子基因的药物的应用。3. -种RNAi干扰载体，用于干扰动物Y精子基因，其特征在于，所述RNAi干扰载体克 隆有RNAi干扰片段，所述RNAi干扰片段的序列为SEQIDNO. 1或SEQIDNO. 2所示。4. 根据权利要求3所述的RNAi干扰载体，其特征在于，所述RNAi干扰载体包括 pLentiLox3. 7载体，所述pLentiLox3. 7载体与所述RNAi干扰片段连接。5. 根据权利要求4所述的RNAi干扰载体，其特征在于，所述RNAi干扰载体在在动物受 精前进行性别控制中应用。6. 根据权利要求5所述的RNAi干扰载体，其特征在于，所述RNAi干扰载体以睾丸直接 注射的方式注射至动物体内，用于干扰动物Y染色体上的Zfy基因。7. -种RNAi干扰载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 酶切pLentiLox3. 7 载体； (2) 将所述RNAi干扰片段与酶切后的所述pLentiL〇X3. 7载体连接，得到连接产物； 其中，所述RNAi干扰片段序列为SEQIDNO. 1或SEQIDNO. 2所示； (3) 将所述连接产物转化至感受态细胞中，筛选并将得到的菌液进行测序鉴定，并将测 序结果与所述RNAi干扰片段序列完全一致的菌液进行扩增； 所述酶切位点为HpaI和XhOlI;所述发夹结构序列为SEQIDN0.3或SEQIDN0.4所 示； (4) 从所述扩增的菌液中提取RNAi干扰载体。8. 根据权利要求7所述的RNAi干扰载体的制备方法，其特征在于，所述的感受态细胞 为pLentiLox3. 7载体细胞。9. 根据权利要求7所述的RNAi干扰载体的制备方法，其特征在于，所述筛选为以含有 pLentiLox3. 7载体、酶切位点和发夹结构来进行筛选。
【专利摘要】本发明提供一种RNAi干扰片段、RNAi干扰载体、及RNAi干扰载体的制备方法及其应用，涉及生物技术领域。其中，一种RNAi干扰片段，用于干扰绵羊Y染色体上的Zfy基因，其特征在于，所述RNAi干扰片段序列为SEQ？ID？NO.1或SEQ？ID？NO.2所示；所述Zfy基因负责编码的蛋白作为转录因子，与精子的发生有关。本发明RNAi干扰片段可以通过对雄性绵羊的生殖细胞Y精子中的Zfy基因进行沉默，阻碍、损伤或者破坏Y精子的正常发育和功能。
【IPC分类】C12N15/113, A61K48/00, A61P15/00, C12N15/66
【公开号】CN105255889
【申请号】CN201510639871
【发明人】贾斌, 张永生, 王绪海, 申红
【申请人】石河子大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年9月30日