)TolC蛋白溶于200 μ IPBS后加入96孔ELISA板中，4°C过夜。
[0065] (2)蛋白包被孔用PBS洗涤6次后，加入200 μ 13% BSA(购自上海生工），孵育2 小时。同时，空白96孔ELISA板中加入200 μ 13% BSA37°C孵育2小时。
[0066] (3)将随机ssDNA文库（首轮用量为800pmol)溶于200 μ 11XSHCMK，95°C变性 5min。立即置于冰上lOmin，使其迅速降至室温，避免ssDNA复性成双链。
[0067] (4)将ssDNA加入PBS洗涤6次的空白ELISA孔中，37°C孵育2小时。
[0068] (5)上清转入PBS洗涤6次的蛋白包被孔中，37°C孵育2小时后PBS洗涤6次。
[0069] (6)结合了 ssDNA的酶标孔用200 μ 1洗脱缓冲液重悬，95°C加热5min，取上清，经 过乙醇沉淀DNA，溶于Millipore水中，作为下一轮筛选的模板。
[0070] (8)取5μ IPCR产物上样于5wt %琼脂糖（购自上海生工），观察条带位置是否正 确。从首轮之后，投入的ssDNA次级库的量逐渐减少，如此反复进行12个循环。
[0071] 实施例6 :核酸话配体克降
[0072] 第12轮筛选产物的扩增和纯化：将第12轮筛选得到的ssDNA序列，用引物PU 物卩2进行扩增。10(^1?0?扩增后体系加入50(^1结合液88(20臟〇1/1!1印68化!17.35)， 120mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，lmmol/L CaC12，lmmol/LMgC12，l%BSA)，充分混匀。将上一 步所得溶液加入吸附柱EC中（吸附柱放入收集管中），室温放置lmin，12000rpm离心30? 60s，倒掉收集管中的废液。加入700pmol漂洗WB (结合液ΒΒ+0. 05% Tween20)，12000rpm 离心30s，弃掉废液。加入500pmol漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃掉废液。将吸附柱EC 放回空收集管中，12000rpm离心2min。取出吸附柱EC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜 的中间部位加20pmol65°C水浴预热的洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12, OOOrpm离心lmin。 将得到的溶液重新加入吸附柱中，再次离心lmin。
[0073] PCR纯化产物的克隆：取1 μ 1扩增产物，与载体PGM-T在T4DNA连接酶的作用下连 接，再将其转化到感受态细胞，取适当体积均匀涂布于含有IPTG、x-gal、抗生素（Amp)(它 们分别购自于上海生工）的LA平板，倒置培养皿，于37°C培养12-16小时进行"蓝-白斑 筛选"。
[0074] 测序：用接种环挑取筛选平板上的单个白色菌落于含Amp的LB液体培养基，37°C 培养过夜。取菌液Iml于离心管中，封膜后送上海生工测序。测序结果发现其中有20个核 酸适配体序列与大肠杆菌外膜蛋白TolC具有非常强的亲和性，该20个序列分别是：
[0075] 5'-TGCGTGTTTACGTGTCGATGTCCGGGTACCCTCGG-3'（SEQ ID NO :1);
[0076] 5' -CTCTTAGCCATTTTGGTATGCGTATTGCTCTACAG-3'（SEQ ID NO :2);
[0077] 5' -ATATATTGCTCTGATCGTACTCTTATTAGGTTAGT-3'（SEQ ID NO :3);
[0078] 5' -ATGACGCTGTGGTATTACGTCCTCCTGTATTTGCC-3'（SEQ ID NO :4);
[0079] 5' -TCTAAGTGGAATCTACCACCAACGTATTTTTCCTC-3'（SEQ ID NO :5);
[0080] 5' -TCCGCCTATTCGGGAGGGAATATTGCTGATTTGTA-3'（SEQ ID NO :6);
[0081] 5'-CTCTTCAGTTTTAGACAATGCACGTTTCAGCGGTG-3'（SEQ ID NO :7);
[0082] 5' -TCCAGGCTATAATTTCTTGGAACTCCCTCCGTTAG-3'（SEQ ID NO :8);
[0083] 5' -CTTTCGAAGGGACTTTAACGGGTATATCCGGTTTT-3'（SEQ ID NO :9);
[0084] 5'-ATTACATGCTCTGAGCTTTTTGTATGAGAAATGAT-3'（SEQ ID NO :10);
[0085] 5'-CGCTTAGCTTGTGATTTCATCTTTCACACAAGAAT-3'（SEQ ID NO :11);
[0086] 5'-CGGAGATCTGTTACACTTCGGTACGTCTTAGTTTG-3'（SEQ ID NO :12);
[0087] 5'-CTACCATGTTCAGTGGTTTTGGGATTTTCATACAT-3'（SEQ ID NO :13);
[0088] 5'-TGAGATCGGTGAGTTAGTATCTTTTATTCAGTTTT-3'（SEQ ID NO :14);
[0089] 5'-GCATTGCGTGACATGGCCTTGCTATCCCTGTTCGT-3'（SEQ ID NO :15);
[0090] 5'-TCCTAAAAGCTAGTTATAGTAAATTGAAAACTTAG-3'（SEQ ID NO :16);
[0091] 5'-TGGAGCTTAGATTTTGAAGCAGTTACATTTCCCGA-3'（SEQ ID NO :17);
[0092] 5'-TACTGCGAGCTTCATTTTTACTTGGTAGTGTTGTG-3'（SEQ ID NO :18);
[0093] 5'-CGAACGAATATAATTATGGCGTCCCCGGGGTTTCG-3'（SEQ ID NO :19);
[0094] 5' -CTAGTTATGACATTTGTGTCATTTATCCCACGCTG-3'（SEQ ID NO :20);
[0095] 以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽 然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人 员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修 饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实 质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围 内。
【主权项】
1. 特异结合大肠杆菌外膜蛋白TolC的核酸适配体，所述核酸适配体如SEQ ID NO :3所 示序列。
2. 按权利要求1所述的适配体，其特征在于，所述大肠杆菌外膜蛋白TolC采用如下方 法纯化得到： 采用分子克隆技术，根据大肠杆菌外膜蛋白TolC的基因组序列设计特异引物，所述特 异引物之上游引物Pa为5' -CGGGATCCATGAAGAAATTGCTCCCCATTCTT - 3'，其下游引物Pb为 5' - CCGCTCGAGGTTACGGAAAGGGTTATGACCGTT - 3'，以全长 cDNA 为模板，PCR 扩增，得到目的基 因经Bam H I和Xho I双酶切，同样处理PET-30a质粒，再用T4连接酶连接制得含有TolC 基因的重组质粒；重组质粒转化感受态细胞BL21，从转化的平板挑单克隆到液体培养基中 培养，IPTG诱导表达，经固液分离，取沉淀经超声粉碎，然后电泳；再采用柱层析纯化所述 大肠杆菌外膜蛋白TolC。
3. 按权利要求1或2所述的适配体，其特征在于，所述序列为人工合成的序列，或任何 其他来源的同样的序列。
4. 一种权利要求1-3中任一项所述的适配体在制备大肠杆菌外排泵抑制剂中的应用。
5. -种权利要求1-3中任一项所述的适配体在制备检测TolC蛋白的探针或靶点中的 应用。
6. -种权利要求1所述的适配体在制备大肠杆菌外排泵抑制剂或制备检测TolC蛋白 的探针或靶点中的应用。
【专利摘要】本发明涉及大肠杆菌外膜蛋白TolC核酸适配体的序列及用途。本发明采用基因重组质粒表达大肠杆菌表面蛋白TolC，通过SELEX过程筛选与其特异性结合的核酸适配体群，测序分析适配体群的碱基序列。该序列可作为大肠杆菌表面蛋白TolC的特异性结合的探针，用于设计和制备大肠杆菌快速检测标识物及外排泵抑制剂等。
【IPC分类】C12N15-115, A61K31-7088, G01N33-68, A61P31-04
【公开号】CN104561012
【申请号】CN201410765444
【发明人】李 杰, 陈伶利, 程莉娟
【申请人】湖南中医药大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年2月28日