舞毒蛾CYP6B53基因dsRNA及其在无公害防治中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物技术领域，涉及亚洲型舞毒蛾的细胞色素 P450 CYP6B53基因 dsRNA及其在防治亚洲型舞毒蛾中的应用。
【背景技术】
[0002] 舞毒蛾Linnaeus)是世界性的害虫，分布广，食性杂，据国外 报道可危害300多种植物，国内报道可危害杨、柳、苹果、樟子松、落叶松等500余种植物。舞 毒蛾传播快、繁殖量和取食量大，给林业生产造成重大经济损失，目前对亚洲型舞毒蛾的防 治，仍然是以化学杀虫剂为主，但这些化合物容易引起害虫抗药性的形成和环境污染问题。 尽管一些害虫天敌、致病微生物等生物防治在舞毒蛾防治上起到一定的作用，但这些防治 技术存在天敌饲养难、受气候环境影响大、见效慢、效果不明显等弊病，严重制约了舞毒蛾 防治的发展。然而，随着生物技术的迅猛发展，利用RNAi技术控制害虫的危害已成为植物 保护工作者研宄的重点和热点。Napoli (1990)首次发现RNAi现象，将外源基因引入矮牵 牛内引起内源基因的沉默，当时把这种现象称为"共抑制"。1998年，华盛顿Carnegine研 宄所的Andrew Fire和马萨诸塞大学癌症研宄中心的Craig C. Mello阐述了基因沉默现 象的本质，并定义了 RNAi。由于RNAi具有高特异性的沉默技术，因而展示出了很大的潜力， 并且作为一种新的方法来防治农业害虫，已在农业害虫防治中得到应用。一方面通过基因 工程手段将害虫靶标基因 dsRNA转入植物体内，当有害生物取食转基因植物时，引发害虫 体内发生基因沉默失去功能，降低害虫的取食能力，例如：Baum等（2007)通过转基因玉米 防治玉米根部害虫玉米根叶甲仍'aAroiica 饲喂表达ATP酶dsRNA的转基因植 物，导致玉米根叶甲发育迟缓和死亡率升高；Mao等（2007)研宄发现棉铃虫（你 供ira)取食表达CYP6AE14的dsRNA转基因棉花后，棉铃虫的P450基因表达量明显降 低，害虫的食欲降低，生长发育迟缓，最后死亡。另一方面，通过筛选具有致死效应的siRNA (一般来源于生物体内参与重要生物化学途径的候选基因），并用化学方法合成，可应用于 新型的杀虫剂生物农药。基于RNAi技术具有特异性强、对人畜安全、对非靶标生物安全、无 害虫抗药性等特点，解决了化学农药长期施用导致"3R"这一难题。因此，RNAi技术将为害 虫防治开辟一条新途径。
[0003] 昆虫在杀虫剂胁迫下，通过诱导高表达酯酶、谷胱甘肽S转移酶、细胞色素 P450等 方式来进行自身的保护。细胞色素 P450酶系是广泛存在于生物体中的一类代谢酶系，是一 种多功能氧化酶，具有底物广普性和功能多样性的特点，而细胞色素 P450是多功能氧化酶 的重要组成部分，起着与底物结合以末端氧化酶的作用，可以代谢多种内源性化合物(保幼 激素及其类似物和脂肪酸等）和外源性化合物(药物、植物次生物质及其毒素等)，对杀虫剂 的代谢是昆虫产生抗药性的主要机制。
[0004] 目前，有关通过抑制细胞色素 CYPB53基因转录水平来防治林木重要害虫舞毒蛾 及提高其对有机磷类杀虫剂的敏感性未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种舞毒蛾CYP6B53基因 dsRNA及其在无公害防治中的应 用，利用分子生物学手段干扰舞毒蛾细胞色素 CYP6B53基因，降低了昆虫的生存能力，使其 生长发育缓慢，提高了舞毒蛾对有机磷类杀虫剂的敏感性，在舞毒蛾无公害防治中的应用 具有广阔的前景并为其他鳞翅目害虫防治提供了理论依据。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 一种亚洲型舞毒蛾细胞色素 P450 CYP6B53基因，其核酸序列如SEQ ID No. 1所示，编 码氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，获得方法如下： 根据NCBI数据库中登陆号为KF853194. 1的细胞色素 P450序列，设计编码区设计上 游引物 LdCYP6B53F:5' ATGTTGTCAATTTATTTACCTATATTTCTCATAGTAGC 3'； LdCYP6B53R: 5' ATTTGAAGATTTCCTCGGAACAAGTCTTACGTG 3'，通过PCR法扩增获得如 SEQ ID NO. 1 所示序列。
[0007] 本发明以亚洲型舞毒蛾CYP6B53基因片段为模板，并设计特异的dsRNA引物对，通 过 MEGAscript RNAi 试剂盒合成 CYP6B53 基因 dsRNA，dsRNA 序列如 SEQ ID NO. 3 所示。
[0008] 上述CYP6B53 dsRNA在无公害防治中的应用，主要表现在以下两方面： 一、 在抑制舞毒蛾生长发育中的应用； 二、 在提高舞毒蛾对有机磷类杀虫剂(氧化乐果）的敏感性中的应用。
[0009] 微量注射dsRNA到昆虫体腔，结果表明：CYP6B53基因沉默舞毒蛾幼虫8 d内体重 增加量大于对照CldH2O和GFP，且从第5d起体重增加量显著大于dsRNAGFP和CldH 2O处理组， 且有40%的致死效果，与对照组dsRNAGFP、CldH2O相比致死效果明显；同时提高了舞毒蛾对 有机磷类杀虫剂的敏感性；并且显著影响舞毒蛾营养利用指标，导致食物转化率、食物利用 率显著低于对照（Z 7〈 0.05)。dsRNA可以在特定时间内高效特异的沉默昆虫体内CYP6B53 基因的mRNA表达。
[0010] 本发明中所述的舞毒蛾细胞色素 CYP6B53基因的方法是本领域中所常采用的方 法。本发明中所述的提取舞毒蛾幼虫总RNA、合成cDNA第一条链、合成dsRNA、实时荧光定 量RT-PCR等方法都是本领域成熟的技术，试剂盒RNeasy Mini动物组织总RNA提取试剂盒 (Qiagen)，PrimeScriptTMRT reagent Kit (TaKaRa)、MEGAscript RNAi Kit (Ambion)、SYBR Green Real-time PCR Master Mix (Toyobo)等都可以从生产商家购买。
[0011] 本发明具有如下有益效果： 1、本发明公开了亚洲型舞毒蛾细胞色素基因 CYP6B53全长核苷酸序列，目前关于其抑 制表达可显著影响舞毒蛾生长发育的功能、具有致死作用、提高其对有机磷类杀虫剂的敏 感性未见相关报道。
[0012] 2、本发明能使舞毒蛾细胞色素 CYP6B53基因有效的沉默，显著影响舞毒蛾幼虫的 生长发育和生理代谢，并且有40%的致死效应为无公害、可持续防治舞毒蛾提供了新思路 和新材料。
[0013] 3、实验结果表明：当舞毒蛾幼虫注射CYP6B53基因 dsRNA后，与对照(注射CldH2O和 GFP基因 dsRNA)相比均有较强的沉默效果，致使舞毒蛾幼虫生长发育受到抑制，进而死亡。 因此，本发明提出可利用CYP6B53的沉默技术来防治林木重要害虫舞毒