一种用于对虾细胞的启动子的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学重组表达技术领域，具体涉及一种用于对虾细胞的启动 子。
【背景技术】
[0002] 对虾病毒病的频繁爆发一直是困扰对虾养殖业并亟待解决的一个难题，而对虾永 生性细胞系是分离和纯化对虾病毒、研宄病毒的致病机理、发展有效的诊断试剂和防控技 术以及生产高效的病毒疫苗等的有利工具和研宄手段。尽管国内外专家学者在对虾细胞的 体外培养和建系上进行了大量的探索和不懈的努力，但目前对虾的细胞培养仍然处于原代 培养水平，永生性的细胞系一直未能成功建立。
[0003] 对虾细胞建系失败的主要原因是体外培养对虾细胞的有丝分裂相极低，甚至不分 裂。已有人尝试电离辐射和化学诱变剂处理，以及将对虾细胞与肿瘤细胞融合，向培养基中 添加各种生长因子，等等，试图诱导对虾细胞永生性转化，但都没有成功。由于在哺乳动物 细胞中，人们可以通过过表达癌基因和细胞周期调控相关基因，成功诱导细胞发生永生性 转化。因此，1995年，Tapay等首次尝试将猿猴病毒40 (SV40)大T抗原基因（SV40T)转染 到南美蓝对奸（Penaeus stylirostris)原代培养类淋巴细胞中，虽然观察到细胞变圆，贝占 壁不紧，生长速度变快等转化特征，但未能成功得到永生性对虾细胞系。随后，Claydon和 Owens (2008)又尝试将病毒（papillomavirus，HPV)癌基因 E6and E7转染到小龙奸（Chrtax quadricarinatus)血细胞中，也未获成功。Hu等（2008,2010)又利用逆转录病毒载体介导 SV40T基因在中国对虾原代培养类淋巴细胞和卵巢细胞中的基因转染。Shike等（2000)又 检测了 4种哺乳动物来源启动子在驱动荧光素酶报告基因在对虾细胞中表达上的活性，这 4个启动子包括热休克蛋白70(hsp70)、杆状病毒早期基因启动子（IE-1)、莫洛尼鼠白血病 病毒（MMLV)和鸟劳氏肉瘤病毒（RSV)长末端重复序列（LTR)启动子。
[0004] 遗憾的是，以上研宄最后都没有成功实现对虾细胞的永生性转化。失败的主要原 因可能与其采用哺乳动物来源基因和启动子，导致在对虾细胞中不亲和以及表达效率低有 关。体外培养对虾细胞难以被转染，外源基因的整合与表达效率低，是与其细胞分裂不活跃 有关（Dean等，2005)。这可能也是导致哺乳动物来源的许多强启动子在对虾细胞中活性低 甚至无活性的主要原因。由此，有必要提供一种有效的适用于对虾细胞的启动子。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种适用于对虾细胞的启动子，用于对虾细胞的转染，从而 弥补现有技术的不足。
[0006] 本发明首先提供一种用于在对虾细胞中表达的启动子，该启动子的核苷酸序列为 SEQ ID NO:1。
[0007] 为了提供在对虾细胞中的表达效率，对筛选得到的核苷酸序列为SEQ ID NO: 1对 虾细胞的启动子进行了改造，改造后的启动子的序列为SEQ ID N0:4;
[0008] 上述的启动子和改造后的启动子可插入到真核细胞启动子后面，构成了复合启动 子；
[0009] 作为实施例的优选，所述的真核细胞启动子为细胞肥大病毒CMV基因启动子；其 组成的复合启动子的序列为SEQ ID NO:3 ;或SEQ ID NO:5 ;
[0010] 本发明的启动子用于构建真核表达载体，该表达载体可使外源目的基因在对虾细 胞中高效表达。
[0011] 本发明进一步提供了一种在对虾细胞中表达外源基因的方法，是用上述表达载体 将外源目的基因导入对虾细胞中。
[0012] 因为对虾细胞不分裂，难以转染，故验证所构建表达质粒是否能正确表达存在困 难。而使用本发明的启动子构建的表达载体则可以很好地解决此问题。当此载体的外源基 因是报告基因或含有报告基因的融合蛋白时，该载体可通过在哺乳动物细胞中的报告基因 表达来验证其质粒构建的成功与否，然后将构建成功的质粒用于对虾细胞转染，提高对虾 细胞转染成功率，减少对虾细胞原代培养物的浪费，节约时间和成本，从而弥补现有技术的 不足。
【附图说明】
[0013] 图1 :凡纳滨对虾翻译控制肿瘤蛋白（TCTP)基因的启动子（Lv-Ptatp)和编码区序 列的PCR扩增及其序列测定结果；
[0014] 其中：A图为TCTP基因编码区序列的RT-PCR扩增结果；B图为Lv-Ptetl^动子的 PCR扩增结果；C图为Lv-Ptetp启动子序列（1-605)和TCTP基因编码区序列（606-1108)， 下划线标出启动子中可能的转录因子结合位点，方框标出起始密码子，星号标出终止密码 子；
[0015] 图2 :三种表达质粒的图谱；
[0016] 其中：表达质粒pcDNA3. Ι-eGFP/TCTP含有CMV单启动子和融合蛋白eGFP/TCTP ; 表达质粒pcDNA3. l-Ptetp-eGFP/TCTP含有双启动子PemJP Lv-Ptetp以及融合蛋白eGFP/TCTP ; 表达质粒pcDNA3. I-Ptetp-TCTP含有双启动子卩。"和Lv-P _以及蛋白TCTP ;
[0017] 图3 :PCR扩增eGFP和融合蛋白eGFP/TCTP的电泳结果；
[0018] 图4 :采用脂质体法，将单启动子质粒pcDNA3. Ι-eGFP/TCTP转染哺乳动物细胞 plat-GP后，可观察到强的绿色荧光蛋白表达。
[0019] 其中：图版A和Al分别是转染后48小时的光镜和荧光照片；
[0020] 图5 :采用脂质体法，将单启动子质粒PCDNA3. ι-eGFP/TCTP转染原代培养对虾类 淋巴细胞后，不能观察到绿色荧光蛋白表达；
[0021] 其中：图版A和Al分别是转染后48小时的光镜和荧光照片；
[0022] 图6 :双启动子质粒pcDNA3. l-Ptetp-eGFP/TCTP在脂质体转染后原代培养对虾类淋 巴细胞中可观察到弱的绿色荧光蛋白表达；
[0023] 其中：图版A和Al分别是对虾细胞转染后48小时的光镜和荧光照片；
[0024] 图7 :单启动子质粒pcDNA3. Ι-eGFP/TCTP转染对虾细胞96小时后，采用eGFP特异 性引物，通过PCR和RT-PCR技术检测基因的导入和mRNA转录情况；其中：M，Trans2K DNA Marker ;1，以基因组DNA为模板PCR扩增得到eGFP产物；2,以cDNA为模板RT-PCR未扩增 得到eGFP转录产物；
[0025] 图8 :双启动子质粒pcDNA3. l-Ptetp-eGFP/TCTP转染对虾细胞96小时后，采用eGFP 特异性引物，通过PCR和RT-PCR技术检测基因的导入和mRNA转录情况；
[0026] 其中：M，Trans2K DNA Marker ;1，以基因组DNA为模板PCR扩增得到eGFP产物； 2,以cDNA为模板RT-PCR扩增得到eGFP转录产物；
[0027] 图9 :逆转录病毒表达载体pMCs-GFP、pMCs-eGFP和pMCs-Ptetp-eGFP的质粒图谱；
[0028] 其中：质粒pMCs-GFP来源于Cell Biolabs公司的泛嗜性逆转录病毒基因表 达系统试剂盒(Platinum ES/EC Retrovirus Expression System, Pantropic, Cat. No. VPK-305)，含有逆转录病毒LTR启动子和GFP报告基因；质粒pMCs-eGFP含有逆转录病 毒LTR启动子和eGFP报告基因；质粒pMCs-P tc;tp-eGFP含有逆转录病毒LTR启动子、对虾Ptrtp 启动子和eGFP报告基因；
[0029] 图10 :采用脂质体转染法，逆转录病毒表达质粒pMCs - eGFP和pMCs - Ptetp - eGFP 在plat-GP包装细胞均能高效表达绿色荧光蛋白，但pMCs - eGFP表达的荧光信号比pMCs -P_ - eGFP 强；
[0030] 图11 :采用脂质体转染法，逆转录病毒表达质粒pMCs - eGFP和pMCs - Ptetp - eGFP 在对虾原代类淋巴细胞中的表达情况；
[0031] 其中：A和B为光镜照片，Al和Bl为荧光照片，在Al中未能检测明显的荧光信号， 在Bl中观察到弱的荧光信号。
[0032] 图12 :采用脂质体法，将双启动子质粒pcDNA3. l-Pmu_tetp-eGFP/TCTP转染哺乳动物 细胞Plat-GP后，可观察到强的绿色荧光蛋白表达。
[0033] 其中：图版A和Al分别是转染后48小时的光镜和荧光照片；
[0034] 图13 :采用脂质体法，将突变后双启动子质粒pcDNA3. l-Pmu_trtp-eGFP/TCTP转染原 代培养对虾类淋巴细胞后，可观察到明显的绿色荧光。突变后启动子P mlrtetp在对虾细胞中 的转染和表达效率明显提高；
[0035] 其中：图版A和Al分别是对虾细胞转染后48小时的光镜和荧光照片。
【具体实施方式】
[0036] 申请人在长期的研宄中获得对虾启动子（SEQ ID NO: 1)后构建的复合启动子可以 高效地使外源基因在对虾细胞中进行表达，从而促成了本发明。
[0037] 下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
[0038] 实施例1 :启动子的筛选及效果检测
[0039] Ptetp启动子（SEQ ID NO: 1)是以凡纳滨对虾基因组DNA为模板，以含KpnI酶切位 点的正向引物（5' -GGGGTACCGATATGCATATACTTACTC-3')和含BamHI酶切位点的反向引 物以-CGGGATCCAATCGTCGCTAAAC-3')为引物对，PCR扩增得到Lv-P tetp启动子序列（图 1)。以翻译起始位点（ATG)为+1，该序列位于-605至-1。
[0040] 以表达质粒pcDNA3. l-V5/HisA(Invitrogen产品）为基础质粒（该质粒含有细胞 肥大病毒CMV基因启动子，SEQ ID N0:2))，以eGFP(增强型绿色荧光蛋白基因）为报告基 因，以凡纳滨对虾TCTP基因为外源基因，构建以下3种表达质粒：
[0041] ① pcDNA3. Ι-eGFP/TCTP，单启动子 Pe"(SEQ ID N0:2)驱动的 eGFP/TCTP 融 合蛋白；② pcDNA3. l-Ptctp-eGFP/TCTP，双启动子 PcmJP P tctp(SEQ ID N0:3)驱动的 eGFP/TCTP 融合蛋白）；③ pcDNA3. I-Ptrtp-TCTP,双启动子 PcmJP P tctp(SEQ ID N0:3) 驱动的TCTP蛋白。质粒图谱如图2所示。表达质粒① pcDNA3. 1-eGFP/TCTP的构 建方法如下：以质粒pCX-eGFP (Invitrogen产品）为模板，以含KpnI酶切位点的 正向引物（5 ' -GGGGTACCATGGTGAGCAAG-3 ')和含BamHI酶切位点的反向引物 & -CGGGATC