CCTTGTACAGCTCG-3')为引物对，扩增得到eGFP基因编码区。以凡纳滨对虾 cDNA 为模板，以含 BamHI 酶切位点的正向引物 C -CGCGGATCCATAATGAAGGTCTTCAAG-3'、 和含EcoRI酶切位点的反向引物（5 ^ -CGGAATTCTTATAGCTTCTCCTC-3 ^ )为引物对，扩增 得到对虾TCTP基因编码区。然后先通过BamHI和EcoRI双酶切，将对虾TCTP基因编码区 定向克隆到pcDNA3. l-V5/HisA，得到质粒pcDNA3. 1-TCTP，再通过KpnI和BamHI双酶切 将eGFP基因编码区定向克隆到pcDNA3. I-TCTP中TCTP基因的N端，从而得到表达质粒 ① pcDNA3. 1-eGFP/TCTP。
[0042] 表达质粒②pcDNA3. l-Ptetp-eGFP/TCTP的构建方法如下：以凡纳滨对虾基因组DNA 为模板，以含KpnI酶切位点的正向引物（5' -GGGGTACCGATATGCATATACTTACTC-3')和含 BamHI酶切位点的反向引物（5 ^ -CGGGATCCAATCGTCGCTAAAC-3 ^ )为引物对，PCR扩增得 到Lv-Ptetp启动子序列。然后通过KpnI和BamHI双酶酶切，将启动子Lv-P tetp定向插入质 粒pcDNA3. l-V5/HisA中，启动子Pcmv之后，多克隆位点之前，得到质粒pcDNA3. I-Ptetp。以 质粒① pcDNA3. Ι-eGFP/TCTP为模板，以含EcoRI酶切位点的正向引物^ -CCGGAATTCAT AATGGTGAGCAAGG-3，）和含 NotI 酶切位点的反向引物（5，-ATAAGAATGCGGCCGCTTATAGCTT CT-3')为引物对，PCR扩增得到融合蛋白eGFP/TCTP片段（图3)，然后通过EcoRI和NotI 双酶酶切，将融合蛋白eGFP/TCTP片段定向插入质粒pcDNA3. I-Ptetp*双启动子之后，构建 得到质粒② pcDNA3. l-Ptetp-eGFP/TCTP。
[0043] 表达质粒③pcDNA3. I-Ptetp-TCTP的构建方法如下：以如前所述方法构建质粒 pcDNA3. I-Ptetp。以质粒① pcDNA3. Ι-eGFP/TCTP为模板，以含EcoRI酶切位点的正向引物 (5' -CCGGAATTCATAATGAAGGTCTTCAAG-3')和含 NotI 酶切位点的反向引物（5' -ATAAGA ATGCGGCCGCTTATAGCTTCT-3')为引物对，PCR扩增得到TCTP基因编码区，然后通过EcoRI 和NotI双酶酶切，将TCTP片段定向插入质粒pcDNA3. 14_中双启动子之后，构建得到质 粒③ pcDNA3. 1-Ptetp-TCTP。
[0044] 通过脂质体转染法，将只含有CMV单启动子的质粒① pcDNA3. 1-eGFP/TCTP转染哺 乳动物细胞Plat-GP后，可观察到强的绿色荧光蛋白表达（图4)。但是将该质粒转染体外 培养对虾类淋巴细胞后，却观察不到绿色荧光的表达（图5)。这表明CMV启动子在哺乳动 物细胞中是强启动子，但是在对奸细胞中没有活性或活性极低。
[0045] 通过脂质体转染法，将含有双启动子PemJP P tetp的质粒pcDNA3. I-P tetp-eGFP/TCTP 转染原代培养对虾类淋巴细胞后，可观察到弱的绿色荧光蛋白表达。这表明对虾来源启动 子Ptrtp可有效启动外源基因在对虾细胞中的表达（图6)。
[0046] 采用eGFP基因特异性引物，分别以转染4天后的对虾细胞的基因组DNA和总RNA 反转录得到的总cDNA为模板，进行PCR和RT-PCR扩增的检测结果表明，脂质体转染法可成 功将外源质粒导入对虾细胞中，但是只含P cw启动子的质粒①不能有效转录生成mRNA(图 7)，而含有Ptrtp启动子的双启动子质粒②和③则在对虾细胞中成功转录生成mRNA (图8)。
[0047] 将双启动子表达质粒②和③转染对虾细胞，观察TCTP基因的永生性转化效果。发 现报告基因 eGFP的存在，不影响TCTP蛋白的功能。TCTP蛋白的过表达可明显促进对虾细 胞的生长，细胞形态变得粗短。
[0048] 实施例2 :Ptetp启动子（SEQ ID ΝΟ:1)的病毒表达载体构建及其活性检测
[0049] 以病毒表达载体pMCs-GFP为基础质粒，该质粒来源于Cell Biolabs公司的 泛嗜性逆转录病毒基因表达系统试剂盒（Platinum ES/EC Retrovirus Expression System，Pantropic，Cat.No. VPK-305)，含有逆转录病毒LTR启动子。采用与前述相同 的方法，通过双酶酶切定向克隆的方法，将GFP基因替换为eGFP，构建得到表达质粒 pMCs-eGFP ；
[0050] 采用与前述相同的方法，将对虾？^^启动子插入质粒pMCs-eGFP中，构建得到表达 质粒 pMCs-Ptetp-eGFP。逆转录病毒表达载体 pMCs-GFP、pMCs-eGFP 和 pMCs-Ptetp-eGFP 的质 粒图谱如附图9所示。Ptatp启动子的插入位点位于病毒LTR启动子之后，eGFP基因之前。
[0051] 通过脂质体转染方法，分别将表达质粒pMCs-eGFP和PMCs-Ptatp-GFP转染哺乳动物 细胞Plat-GP (来源于Cell Biolabs公司的泛嗜性逆转录病毒基因表达系统试剂盒，Cat. No. VPK-305)，发现两种表达质粒都可以在哺乳动物细胞中高效表达，但是pMCs-eGFP的荧 光表达比pMCs-Ptc;tp- eGFP的强（图10)。可见，这两种表达质粒在哺乳动物细胞中的启动 活性主要来源于CMV启动子。采用同样的脂质体转染方法，当将这两个表达质粒pMCs-eGFP 和pMCS-Ptetp-eGFP转染对虾细胞后，发现，不含有对虾Ptetp启动子的表达质粒pMCs-eGFP 不能启动eGFP基因在对虾细胞中的表达，观察不到绿色荧光；而含有对虾Ptrtp启动子的表 达质粒pMC S-Ptrtp-eGFP则能够启动eGFP基因在对虾细胞中的表达，可观察到弱的绿色荧光 (图 11)。
[0052] 以上实施例的研宄结果，验证了本发明所涉及的启动子的通用性，即将其用于其 它表达载体质粒，也能驱动外源基因在对虾细胞中有效表达。
[0053] 实施例3 :启动子的改造及效果检测
[0054] 尽管本发明所分离的对虾基因启动子Ptrtp优于哺乳动物来源启动子如CMV和病毒 LTR，可有效启动外源基因在对虾细胞中的表达。但是，由于对虾细胞不分裂，难转染，导致 阳性细胞克隆少，荧光弱。因此，申请人对该启动子进行改造，以提高其在对虾细胞中的转 染和表达效率。
[0055] 改造方法：首先设计合成含KpnI酶切位点的正向突变引物：5^ -GG匹 TACCGGGAATTTCCGATATGCAAATATACTTAC-3 '，并与含 BamHI 酶切位点的反向引物 (5' -CGGGATCCAATCGTCGCTAAAC-3，）组成引物对，以质粒 pcDNA3. l_Ptetp-eGFP/TCTP 为模 板，扩增得到突变启动子Pmlrtetp片段（SEQ ID N0:5)。该突变启动子Pmlrtetl^段比突变前启 动子Ptrtp (SEQ ID NO: 1)的序列多出12个碱基，分别是在Ptatp片段的5'端增加10个碱基 (GGGAATTTCC)，在？,_片段的第7位碱基后插入了 2个碱基（AA)。改造后的启动子的核酸 序列为 SEQ ID NO:5。
[0056] 表达质粒PcDNA3. l-Pmu_trtp-eGFP/TCTP的构建方法：用双核酸内切酶（KpnI 和BamHI)分别酶切质粒pcDNA3. l-Ptetp-eGFP/TCTP和PCR扩增得到的突变启动 子Pmlrtrtp片段，回收纯化酶切后的载体质粒和P 片段，连接转化，从而将表达质 粒pcDNA3. l-Ptrtp-eGFP/TCTP中的Ptatp片段替换成P mu_tc;tp片段，构建得到表达质粒 pcDNA3. l-Pmu_tctp-eGFP/TCTP〇
[0057] 将单启动子质粒pcDNA3. I - eGFP/TCTP转染到哺乳动物细胞Plat - GP中，可观察 到强的绿色荧光表达（图4)。但是将该质粒转染体外培养对虾类淋巴细胞后，却观察不到 绿色荧光的表达（图5)。
[0058] 将双启动子质粒pcDNA3. I -Pmu_tetp -eGFP/TCTP转染到哺乳动物细胞Plat -GP中， 可观察到强的绿色荧光表达（图12)。将其转染到体外培养对虾类淋巴细胞中，可观察到 明显的绿色荧光表达（图13)。每个视野中的阳性细胞克隆数可多达15个，而且每个细胞 的荧光也更亮；而含有非突变？^ 1)启动子的表达质粒的转染后对虾细胞的视野中只有1 -2 个阳性克隆（图6和11)。可见，突变后启动子Pmu_tc;tp在对虾细胞中的转染和表达效率明 显提尚。
【主权项】
1. 一种启动子，其特征在于，所述的启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO: 1。
2. 如权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述的启动子的核苷酸序列SEQ ID N0:4〇
3. -种复合启动子，其特征在于，所述的复合启动子是将权利要求1或2所述的启动子 插入到真核细胞启动子后面构建的。
4. 如权利要求3所述的复合启动子，其特征在于，所述的真核细胞启动子为细胞肥大 病毒CMV基因启动子。
5. 如权利要求3所述的复合启动子，其特征在于，所述的复合启动子的核酸序列为SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:5。
6. -种真核表达载体，其特征在于，所述的真核表达载体的启动子为权利要求1或2所 述的启动子。
7. -种真核表达载体，其特征在于，所述的真核表达载体的启动子为权利要求3所述 的启动子。
8. -种在对虾细胞中表达外源基因的方法，其特征在于，所述的方法是用权利要求6 或7所述的真核表达载体将外源目的基因导入对虾细胞中。
【专利摘要】本发明涉及一种可同时在哺乳 动物细胞和对虾细胞中有效表达的穿梭表达载体的构建方法。构建方法：将对虾翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因启动子定向插入真核细胞表达载体中的细胞肥大 病毒(CMV)启动子之后，外源基因之前。因此该穿梭载体的特征在于含有串联排列的2个启动子：CMV启动子和对虾TCTP基因启动子。本发明所设计的穿 梭表达载体,当所插入的外源基因是报告基因或含报告基因的融合蛋白时，该载体可通过在哺乳动物细胞中的报告基因表达与检测，来验证所构建质粒的正确性。这 一优点对于难转染的对虾细胞的基因表达研究具有极大的优势。
【IPC分类】C12N15-113, C12N15-85
【公开号】CN104561005
【申请号】CN201510046128
【发明人】郭华荣, 王晶, 王雨杰
【申请人】中国海洋大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月29日