专利名称：豆天蛾杆状病毒及其在防治豆天蛾幼虫方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物病毒领域，涉及新型杆状病毒的新毒株及其生物杀虫剂用途，特指豆天蛾杆状病毒及其在防治豆天蛾幼虫方面的应用。
背景技术：
杆状病毒(baculovirus)是主要以鳞翅目昆虫为宿主的双链DNA病毒。鳞翅目昆虫是为害农作物、森林树木最严重的一类害虫，约占农作物损失中的70％。目前已记载有600余株杆状病毒，病毒的命名主要根据分离到杆状病毒的宿主命名，比如家蚕杆状病毒，柞蚕杆状病毒，茶尺蠖杆状病毒，舞毒蛾杆状病毒，美国白蛾杆状病毒等。杆状病毒的结构特征为病毒粒子呈杆状，外面包被着一层蛋白质膜，外观有一定规则，称为多角体。杆状病毒的感染过程是这样实现的病毒多角体散布在环境中，粘附在植物表面的病毒多角体通过昆虫进食植物进入到虫体的中肠部位，病毒外膜被肠液溶解，释放出病毒粒子，病毒粒子进入中肠细胞进行繁殖并形成病毒粒子进入其他组织感染，此时的病毒称为出芽病毒，至感染后期，病毒粒子包被到多角体中，随昆虫死亡崩解释放到环境中。杆状病毒作为杀虫剂具备以下几个优点①具备高度特异性的寄主范围，不引起生态平衡的破坏，对昆虫捕食者和一些经济昆虫无致病性。②杆状病毒形成包涵体，在环境中比较稳定。③持久性好，并不完全杀灭昆虫，而是控制在一定的阈值之下，不会造成小种间的突变而引起它种昆虫的暴发。④对农作物无药害，对人、家畜、家禽及水生生物无害等。因此，杆状病毒作为生物杀虫剂的应用将越来越普及。但杆状病毒的防治昆虫的范围比较小，一种杆状病毒只能防治一种和数种昆虫。因此在生产上，通常采用多种杆状病毒或与其他生物杀虫剂混合使用的方法综合防治害虫。
豆天蛾是农业生产中的主要害虫之一，特别是对豆类植物危害极大，在我国多数的大豆产地都有发生。目前主要是化学农药防治，但有些地区以此虫为食，不采取防治措施。为控制豆天蛾田间发生数量，采用生物防治是安全的措施。
发明内容
本发明的目的是提供一种豆天蛾杆状病毒及其在防治豆天蛾幼虫方面的应用，提高豆科作物产量和安全性，减少使用化学农药对环境的污染。
本发明的病毒特征为所述的豆天蛾杆状病毒外形为多角体，呈四方体形，病毒的遗传物质为双链DNA，其中病毒DNA提纯后，可以被EcoR I，EcoR V，Hind III，Sal I等限制性内切酶酶解，形成的大于564个核苷酸的DNA片段分别为17条，6条，21条，18条，这些片段中具有杆状病毒的基因p26，ubiquitin，egt，DNA polymerase和ieO等，并具有自己独特的序列特征，见后文。
本发明所述的豆天蛾杆状病毒在防治豆天蛾幼虫方面的应用其特征是通过豆天蛾杆状病毒添食豆天蛾幼虫，造成其死亡；从尸体中通过分离、纯化豆天蛾杆状病毒多角体而获得；收集感染这种病毒的豆天蛾幼虫尸体，研磨后，加灭菌水反复洗涤、过滤后，通过离心法收集病毒的多角体；病毒多角体的保存方式是存储温度为0℃至零下90℃，保存液为20％的醇试剂；且豆天蛾杆状病毒以每毫升大于500个多角体的浓度制成生物杀虫剂，适时喷施到农田中，防治豆天蛾幼虫危害。
本发明的优点在于利用豆天蛾杆状病毒防治豆天蛾幼虫，可以提高豆科作物产量和安全性，减少使用化学农药对环境的污染。
图1 6000倍放大的豆天蛾杆状病毒的外形2 豆天蛾杆状病毒DNA的EcoR I、EcoR V、Hind III酶切图具体实施方式
实现防治豆天蛾幼虫的技术方案为(1)在野外收集到的豆天蛾幼虫尸体，显微镜下观察到大量的多角体。如图1所示，从感病的豆天蛾幼虫体内分离并纯化到豆天蛾杆状病毒，其多角体呈四方体，直径大小约为1-2微米。
(2)豆天蛾杆状病毒的繁殖，以豆天蛾杆状病毒多角体人工添食幼虫，发病后收集病毒多角体。
(3)豆天蛾杆状病毒多角体的保存在特定的温度和佐剂配合下，保存豆天蛾杆状病毒颗粒，保证其活性。温度为0℃至零下90℃，佐剂为20％的醇试剂。
(4)豆天蛾杆状病毒粒子的纯化豆天蛾幼虫尸体经研磨后，加灭菌的去离子水进行稀释。稀释液用3层丝棉纸过滤，除去大颗粒杂质。然后用50mmol/L的Tris溶液(pH 7.0)稀释，3000rpm离心沉淀，反复数次，逐渐洗去小分子杂质。沉淀用50mmol/L的Tris悬浮后加SDS至终浓度为0.2％，室温放置30分钟，用上述Tris溶液反复洗涤数次。最后沉淀用50mmol/L的Tris溶液(pH 7.0)悬浮，4℃保存备用。
(5)豆天蛾杆状病毒DNA的分离将纯化的病毒粒子悬于裂解液(0.1mol/L Na2CO3，0.15mol/L NaCl，0.01mol/L EDTA，pH 10.8)，于室温放置至溶液清亮，再将溶液的pH值用10％ HAc调至8.0，加入SDS和蛋白酶K至终浓度分别为0.5％和50mg/L，37℃下酶解过夜。酶解液经酚、酚/氯仿、氯仿抽提后，加入2.5倍体积的无水乙醇，用灭菌牙签挑出絮状沉淀，经75％的乙醇洗涤，3000rpm离心10min，吸去乙醇溶液，在37℃下稍稍干燥数分钟，沉淀溶于2mmol/L Tris(pH 8.0)缓冲液中。
(6)病毒DNA的酶切鉴定分别取10μL豆天蛾杆状病毒DNA液，加入过量的限制性内切酶，补足灭菌水至反应总体积为20μL，37℃下酶解过夜。取10μL进行电泳，琼脂糖的浓度为1％。在紫外灯下观察酶切形成的DNA片段。如图2所示，用EcoR I、EcoR V、Hind III、Sal I酶切的DNA产生的大于564个核苷酸的DNA片段分别为17条、6条、21条、18条。图中M为标准核酸分子量，1为EcoR I，2为EcoR V，3为Hind III，4为Sal I。这些片段分别克隆进测序质粒pUC18后，进行测序。结果表明，这些序列在GenBank中没有完全相同的序列，只是与其他杆状病毒的一些基因有一定的同源性，如p26，ubiquitin，egt，DNA polymerase和ieO等。
(7)以病毒多角体制成生物杀虫剂，以每毫升500-1000个多角体适时喷施到农田中，防治豆天蛾幼虫危害。
豆天蛾杆状病毒的p26基因DNA和蛋白质的部分序列DNA的特征序列为GACGCCAAGTTTCATTCGACTTGTACGGTAGCTGGCGTCGACCGTATACAGAAAGCCCTGGCTTAAGCTGTTGTACTGTAACATTGTCGTCGTAATTAATTTGACCAGACACTAGACCGGCTGCTCTCAGGCCTGTTAAAGGAAATATCACTTGTTGGTTAGTGTAGTCATCAAAGCGGCAAGTAATTACAGATATTAATCGTTTCTCTTTGAACACGGGCGCACCAATGTAGATTTGATCGGCAAGTGTGAAATCTTTGACAACAACGGCTCGCAATTGACCAAACACTATACGATTTTTATGTGTGTGATAATTGGTAAAAACGTTTGCATCCACGCCAGTCCGCCACAAAACGTGATCACTCAACAGTATTTCAACCATATCATTAGCTTGTATTGACGGTAGAATAATATCGGTTGCCACGCCCGGAAAGTGATGCAACATGTCCAACCGGTCGTCATTGTTAGTGTTGGAATGAGGCGGAATCACCACAACCTGTGCCTCTTTACCATCGACCATTTGTATATTGATCGCGCGCTGTACATCGTTGACAGTATAAATTACATTATGTATAATGTGTGTACCATGCGCTCGCGGTATCACGTTTGTATCATGCGCTTGCGATGATGCAATCATTGTTAAAGAATGT蛋白质的特征序列为MIASSQAHDT NVIPRAHGTH IIHNVIYTVN DVQRAINIQM VDGKEAQVVV IPPHSNTNNDDRLDMLHHFP GVATDIILPS IQANDMVEIL LSDHVLWRTG VDANVFTNYH THKNRIVFGQLRAVVVKDFT LADQIYIGAP VFKEKRLISV ITCRFDDYTN QQVIFPLTGL RAAGLVSGQINYDDNVTVQQ LKPGLSVYGR RQLPYKSNET WR豆天蛾杆状病毒的Ubiquitin基因DNA和蛋白质的部分序列DNA的特征序列为ACTAAATGTAGCGTGGATTCTTTTTGAATGTTGTAATCGCCCACAGTGCGATCATCTTCTAATTGTTTGCCGGCAAAAATAATCCGCTGTTGGTCAGGCGGAATCCCTTCTTTGTCTGTGATTTTTTGCTTTAGTAACTCGATAGTGTCCAGCGACTCCACTTCGACTGTGATGGATTTACCGGTCAAAGTCTTTACAAATTGCAT蛋白质的特征序列为MQFVKTLTGK SITVEVESLD TIELLKQKIT DKEGIPPDQQ RIIFAGKQLE DDRTVGDYNIQKESTLHL豆天蛾杆状病毒的ieO基因DNA和蛋白质的部分序列DNA的特征序列为TCGCTAATAAACTTAATAGCCTCTAAATACTTTGTAGAGCGTTGCATAAGCGAATCCACGCTTTGTATACACTTTTGGACTACAGAACTACAACAATAATCGTTAACAAAATTACTTAACATCTGTTTAAGCTGGCGCAAATAGGGTAAAAATATATACACGTTATGCACGTACATCTCCTGTTGCACCACAAACAATAGCACTTGAACTATTCTATTCAATTTTGCTATAAGATGGTGAACGCATTCAGTTTTAGA
AAATACCACATCGTCTTCGTGCTCACGCAACGCCAATATATCGTCTATTTTTACGTTAAACATTTGTAGATGATATCTA蛋白质的特征序列为MFNVKIDDIL ALREHEDDVV FSKTECVHHL IAKLNRIVQV LLFVVQQEMY VHNVYIFLPYLRQLKQMLSN FVNDYCCSSV VQKCIQSVDS LMQRSTKYLE AIKFIS豆天蛾杆状病毒的DNA polymerase基因DNA和蛋白质的部分序列DNA的特征序列为GTAATATTTGATCATCAAGTCTGCCAAAGTGTTTAAACCACATGCTACTGAATGATCGCGCAAATAGCTATCAACCACCGCTCTAAAAGTTTTACGCATAAACAACGGCATGTCTTTTTTTACTAACCACCCTTTGTATTTGATTCGATCATCAGTATTCAAATAACAATATTTTTTTTTCTTCAAAAGAATCAAACTCGGTATTATATTCTCAAGAGCCATTTTGTAGCCAACCCAACCGCCATTCAATTGTTTCAGTAACATAATTATT蛋白质的特征序列为MLLKQLNGGW VGYKMALENI IPSLILLKKK KYCYLNTDDR IKYKGWLVKK DMPLFMRKTFRAVVDSYLRD HSVACGLNTL ADLMIKYY豆天蛾杆状病毒的egt基因DNA和蛋白质的部分序列DNA的特征序列为TGTTGACACAGAAACCGTATCCGCTTCGCAGCTGACGCAAGCCATCAAGAATGCGGTTGAATCACCAATGATACGCAAAAATTTAAGAGATTTACGTCATTTGATGCGTCATCGAGCTATGTCTGTAGAGCACACTGCCGTTTGGTATACTGAGCGCGTGATCGAGCAAAAAAACTTTTCAAAGTCCTTGTATATGAACACAAAAGCGGCCAACACAAGTCTTAGTGAT蛋白质的特征序列为VDTETVSASQ LTQAIKNAVE SPMIRKNLRD LRHLMRHRAM SVEHTAVWYT ERVIEQKNFSKSLYMNTKAA NTSLSD
权利要求
1.豆天蛾杆状病毒，其特征在于所述的豆天蛾杆状病毒外形为多角体，呈四方体形，病毒的遗传物质为双链DNA，其中病毒DNA提纯后，可以被EcoR I，EcoR V，Hind III，SalI等限制性内切酶酶解，形成的大于564个核苷酸的DNA片段分别为17条，6条，21条，18条，这些片段中具有杆状病毒的基因p26，ubiquitin，egt，DNA polymerase和ie0，并具有自己独特的序列特征；具体的基因和蛋白质特征序列为豆天蛾杆状病毒的p26基因DNA和蛋白质的部分序列DNA的特征序列为GACGCCAAGTTTCATTCGACTTGTACGGTAGCTGGCGTCGACCGTATACAGAAAGCCCTGGCTTAAGCTGTTGTACTGTAACATTGTCGTCGTAATTAATTTGACCAGACACTAGACCGGCTGCTCTCAGGCCTGTTAAAGGAAATATCACTTGTTGGTTAGTGTAGTCATCAAAGCGGCAAGTAATTACAGATATTAATCGTTTCTCTTTGAACACGGGCGCACCAATGTAGATTTGATCGGCAAGTGTGAAATCTTTGACAACAACGGCTCGCAATTGACCAAACACTATACGATTTTTATGTGTGTGATAATTGGTAAAAACGTTTGCATCCACGCCAGTCCGCCACAAAACGTGATCACTCAACAGTATTTCAACCATATCATTAGCTTGTATTGACGGTAGAATAATATCGGTTGCCACGCCCGGAAAGTGATGCAACATGTCCAACCGGTCGTCATTGTTAGTGTTGGAATGAGGCGGAATCACCACAACCTGTGCCTCTTTACCATCGACCATTTGTATATTGATCGCGCGCTGTACATCGTTGACAGTATAAATTACATTATGTATAATGTGTGTACCATGCGCTCGCGGTATCACGTTTGTATCATGCGCTTGCGATGATGCAATCATTGTTAAAGAATGT蛋白质的特征序列为MIASSQAHDT NVIPRAHGTH IIHNVIYTVN DVQRAINIQM VDGKEAQVVV IPPHSNTNNDDRLDMLHHFP GVATDIILPS IQANDMVEIL LSDHVLWRTG VDANVFTNYH THKNRIVFGQLRAVVVKDFT LADQIYIGAP VFKEKRLISV ITCRFDDYTN QQVIFPLTGL RAAGLVSGQINYDDNVTVQQ LKPGLSVYGR RQLPYKSNET WR豆天蛾杆状病毒的Ubiquitin基因DNA和蛋白质的部分序列DNA的特征序列为ACTAAATGTAGCGTGGATTCTTTTTGAATGTTGTAATCGCCCACAGTGCGATCATCTTCTAATTGTTTGCCGGCAAAAATAATCCGCTGTTGGTCAGGCGGAATCCCTTCTTTGTCTGTGATTTTTTGCTTTAGTAACTCGATAGTGTCCAGCGACTCCACTTCGACTGTGATGGATTTACCGGTCAAAGTCTTTACAAATTGCAT蛋白质的特征序列为MQFVKTLTGK SITVEVESLD TIELLKQKIT DKEGIPPDQQ RIIFAGKQLE DDRTVGDYNIQKESTLHL豆天蛾杆状病毒的ie0基因DNA和蛋白质的部分序列DNA的特征序列为TCGCTAATAAACTTAATAGCCTCTAAATACTTTGTAGAGCGTTGCATAAGCGAATCCACGCTTTGTATACACTTTTGGACTACAGAACTACAACAATAATCGTTAACAAAATTACTTAACATCTGTTTAAGCTGGCGCAAATAGGGTAAAAATATATACACGTTATGCACGTACATCTCCTGTTGCACCACAAACAATAGCACTTGAACTATTCTATTCAATTTTGCTATAAGATGGTGAACGCATTCAGTTTTAGAAAATACCACATCGTCTTCGTGCTCACGCAACGCCAATATATCGTCTATTTTTACGTTAAACATTTGTAGATGATATCTA蛋白质的特征序列为MFNVKIDDIL ALREHEDDVV FSKTECVHHL IAKLNRIVQV LLFVVQQEMY VHNVYIFLPYLRQLKQMLSN FVNDYCCSSV VQKCIQSVDS LMQRSTKYLE AIKFIS豆天蛾杆状病毒的DNA polymerase基因DNA和蛋白质的部分序列DNA的特征序列为GTAATATTTGATCATCAAGTCTGCCAAAGTGTTTAAACCACATGCTACTGAATGATCGCGCAAATAGCTATCAACCACCGCTCTAAAAGTTTTACGCATAAACAACGGCATGTCTTTTTTTACTAACCACCCTTTGTATTTGATTCGATCATCAGTATTCAAATAACAATATTTTTTTTTCTTCAAAAGAATCAAACTCGGTATTATATTCTCAAGAGCCATTTTGTAGCCAACCCAACCGCCATTCAATTGTTTCAGTAACATAATTATT蛋白质的特征序列为MLLKQLNGGW VGYKMALENI IPSLILLKKK KYCYLNTDDR IKYKGWLVKK DMPLFMRKTFRAVVDSYLRD HSVACGLNTL ADLMIKYY豆天蛾杆状病毒的egt基因DNA和蛋白质的部分序列DNA的特征序列为TGTTGACACAGAAACCGTATCCGCTTCGCAGCTGACGCAAGCCATCAAGAATGCGGTTGAATCACCAATGATACGCAAAAATTTAAGAGATTTACGTCATTTGATGCGTCATCGAGCTATGTCTGTAGAGCACACTGCCGTTTGGTATACTGAGCGCGTGATCGAGCAAAAAAACTTTTCAAAGTCCTTGTATATGAACACAAAAGCGGCCAACACAAGTCTTAGTGAT蛋白质的特征序列为VDTETVSASQ LTQAIKNAVE SPMIRKNLRD LRHLMRHRAM SVEHTAVWYT ERVIEQKNFSKSLYMNTKAA NTSLSD
2.根据权利要求1所述的豆天蛾杆状病毒在防治豆天蛾幼虫方面的应用，其特征是通过豆天蛾杆状病毒添食豆天蛾幼虫，造成其死亡；从尸体中通过分离、纯化豆天蛾杆状病毒多角体而获得；收集感染这种病毒的豆天蛾幼虫尸体，研磨后，加灭菌水反复洗涤、过滤后，通过离心法收集病毒的多角体；病毒多角体的保存方式是存储温度为0℃至零下90℃，保存液为20％的醇试剂；且豆天蛾杆状病毒以每毫升大于500个多角体的浓度制成生物杀虫剂，适时喷施到农田中，防治豆天蛾幼虫危害。
全文摘要
本发明提供一种新发现的豆天蛾杆状病毒，以及利用豆天蛾杆状病毒防治豆天蛾幼虫为害豆科作物的方法，包括豆天蛾杆状病毒的提取与保存，繁殖和使用等。针对豆天蛾为害比较严重和民间以幼虫为食的习惯，采用豆天蛾杆状病毒防治豆天蛾既可以减少化学农药对环境的污染，也提高食品的安全性。
文档编号C07K14/01GK1637139SQ20041006614
公开日2005年7月13日 申请日期2004年12月9日 优先权日2004年12月9日
发明者王文兵, 王利群, 乌慧玲, 于峰, 宋志秀, 朱姗颖 申请人:江苏大学