粒；重组质粒转化感受态细胞BL21，从转化的平板挑单克隆到液体培养 基中培养，IPTG诱导表达，经固液分离，取沉淀用Tris-HCl溶液吹散，超声粉碎，然后电泳； 柱层析分离纯化蛋白质。
[0032] 在一个具体实施例中，本发明之大肠杆菌外膜蛋白TolC核酸适配体序列的制备 方法是：
[0033] 采用分子克隆技术，根据大肠杆菌外膜蛋白TolC的基因组序列设计特异引物，在 一个具体实施例中，该特异引物为上游引物Pa，下游引物Pb，以全长cDNA为模板，PCR扩增。 得到目的基因经Bam H I和Xho I双酶切，同样处理PET-30a质粒，再用T4连接酶连接制 得含有TolC基因的重组质粒。
[0034] 重组质粒转化感受态细胞BL21，从转化的平板挑单克隆到I. 5ml LB液体培养基 中培养，IPTG(0. 5mM)诱导表达，取Iml诱导的菌液，12000rpm，离心lmin，弃上清，沉淀用 50-100 μ IlOmM Tris-HCl (pH8.0)溶液吹散（加入缓冲液的量视菌体量而定），超声粉碎 (500W，30 次，每次 10s，间隔 15s)。加入 50 μ 12 X loading buffer，100°C煮 5min，电泳。
[0035] 过镍柱蛋白质纯化，分别收集蛋白峰，电泳检测蛋白纯化效果（纯化结果见图2)。
[0036] 随后利用适配体的SELEX体外筛选技术，以收集纯化后的TolC为筛选靶标， 从体外合成的随机寡聚 DNA 文库（5' -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGC CCGGATC-3'）中筛选出与TolC蛋白特异结合的核酸适配体，将筛选出来的序列用引物 Pl(5' GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3'）和引物 P2(5' -GATCCGGGCCTCATGTCGAA-3'）进行扩 增。将PCR扩增产物纯化后取1 μ 1，与载体PGM-T在T4DNA连接酶的作用下连接，再将其转 化到感受态细胞，取适当体积均匀涂布于含有IPTG、x-gal、抗生素（Amp)的LA平板，12? 16小时后用接种环挑取筛选平板上的单个白色菌落于含Amp的LB液体培养基，37°C培养过 夜。取菌液Iml于离心管中，封膜后送上海生工生物技术有限公司（以下简称上海生工） 测序。
[0037] 所述序列选自天然存在或人工合成的序列，或任何其他来源的同样的序列。
[0038] 本发明进一步提供所述核酸适配体序列的用途，例如该序列在制备药物或制品中 的应用。在一个具体实施例中，本发明提供所述序列在制备大肠杆菌外排泵抑制剂中的应 用。
[0039] 本发明的另一目的在于提供所述核酸适配体序列在制备检测TolC蛋白的探针或 靶点中的应用。
[0040] 本发明还提供所述适配体在制备大肠杆菌外排泵抑制剂中的应用。
[0041] 本发明还提供所述适配体在制备检测TolC蛋白的探针或靶点中的应用。
[0042] 本发明的另一目的在于提供一种抑制大肠杆菌外排泵外排活性或减少大肠杆菌 外排泵外排的方法，包括给予有效量的所述的适配体。
[0043] 本发明中，所述的核酸序列构成的适配体可与大肠杆菌外膜蛋白TolC特异性结 合，可用于外排泵抑制剂药物的设计和制备。所述的核酸序列构成的适配体也可以作为检 测TolC蛋白的探针或靶点。本发明所提供的核酸适配体序列与作为靶标的大肠杆菌外膜 蛋白TolC具有非常强的亲和性，因而所述序列具有特异性强的优点；此外，所述序列可以 大量快速地在体外合成，且制备方法简单，因而比较容易获得。
【附图说明】
[0044] 图1为适配体抑制大肠杆菌外排泵作用机理；
[0045] 图2为大肠杆菌外膜蛋白TolC纯化电泳图；
【附图说明】 [0046] ：
[0047] 图2横坐标代表：泳道1为TolC上清；泳2为TolC沉淀；泳道M为蛋白marker ; 图2纵坐标代表：蛋白质的分子量，单位kD。
【具体实施方式】
[0048] 以下配合本发明的优选实施例，进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的 技术手段。
[0049] 本发明拟考虑将核酸适配体应用于改变TolC蛋白结构来有效阻塞大肠杆菌外排 泵外排活性，阻塞原理如图1所示。开发针对大肠杆菌外膜蛋白TolC的核酸适配体，将为 抑制大肠杆菌多重耐药提供有力支持，具有重要的临床价值。
[0050] 实施例1 :外腊蛋白TolC基闵扩增
[0051] 采用分子克隆技术，根据大肠杆菌外膜蛋白TolC的基因组序列设计特异引物（上 游引物Pa，其下游引物Pb)，以全长cDNA为模板，PCR扩增。PCR反应条件：94°C，预变性 5min，然后以94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，进行30个循环，最后72°C延伸 lOmin。PCR产物经lwt%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段。
[0052] 实施例2 :重组表汰质粒的构律
[0053] (1)得到目的基因经Bam H I和Xho I双酶切，酶切体系如下：25μ1质粒，2 μ? Bam H Ι，2μ1 Xho I，8yllOXBuffer，43yl CldH2O，混合物 37°C过夜反应，用快速胶回收 试剂盒纯化酶切产物。
[0054] (2)PET-30a质粒经Bam H I和Xho I双酶切，酶切体系如下：5μ1载体（pET-30a) 质粒，2μ1 BamH Ι，2μ1 Xho I，8yllOXBuffer，63yl CldH2O，混合物37°C过夜反应，用快 速胶回收试剂盒纯化酶切产物。
[0055] (3)用T4连接酶连接大肠杆菌外膜蛋白TolC的基因和PET_30a载体，获得重 组质粒。连接体系如下：lul载体（pET30a)，3ul PCR回收产物，4ul连接酶（Takara，DNA ligation Kit Ver2.0)，混勾，在室温下反应30min以上。
[0056] (4)重组质粒转化感受态细胞BL21。取出一 80°C温度保存的感受态细胞（BL21)， 放在冰上缓慢解冻。调2台水浴锅至水温分别为42°C和37°C。将感受态细胞BL21加入连 接产物，冰上放置30分钟。42°C热激90秒。放回冰上，2分钟后加入800ul无抗性的LB培 养基（卡那霉素）（购自上海生工）。放入37°C摇床中45分钟，8000rpm离心3分钟，弃大 部分上清，留约100-150ul重悬，选择有相应抗性的LB平板，涂板。晾干，于37°C培养箱中 倒置培养过夜。
[0057] 实施例3 :TolC蛋白在大肠杆菌中的表汰
[0058] 从转化的平板挑单克隆到I. 5ml LB液体培养基中，37 °C，200rpm培养。将 培养的菌液转接到500mL LB液体培养基混合，37 °C，200rpm，培养至OD = (λ 6-0. 8， IPTG(0.5mM)诱导4h。用400m大离心筒，6000rpm，离心5min，取上清。沉淀用20_30ml IOmM Tris-HCl (ρΗ8· 0)溶液吹散，超声粉碎（500W，30 次，每次 10s，间隔 15s)。取 100 μ I 超声后的菌悬液，12000rpm，离心lOmin，分别得TolC上清和TolC沉淀，取50 μ ITolC上清 至另一 EP 管，TolC 沉淀用 50 μ IlOmM Tris-HCl ρΗ8·0)溶液吹散，加入 50 μ 12Χ loading buffer，100°C煮5min，电泳。电泳图如图2所示。结果显示在52kD处泳道1和2即TolC 上清和TolC沉淀均有一明显增粗的蛋白质条带（如图2所示）M为电泳技术常规的标准分 子量marker，目的条带和Marker的那条带位置相同就可以确定目的条带的分子量，结果表 明目的蛋白在上清和沉淀中均有表达。
[0059] 实施例4 :蛋白质纯仆,
[0060] 用纯水洗镍柱至pH7. 0，后挂镍至pH2-3。纯水洗柱至pH7. 0， 用IOOmlTris-HCl (10mM，pH8. 0)溶液平衡镍柱，再用50ml含0. 5M氯化钠的 IOmMTris-HCl (pH8. 0)溶液平衡镍柱。将样品外膜蛋白TolC稀释上样，上样结束后用0. 5M 氯化钠的IOmM Tris-HCl pH8. 0)溶液洗柱，分别用含15mM咪唑、60mM咪唑、300mM咪唑的 IOmM Tris-HCl (ρΗ8· 0)(含0· 5M氯化钠）溶液洗脱，收集300mM咪唑洗脱的蛋白峰。
[0061] 实施例5 :核酸话配体筛诜（一轮）
[0062] 上海生工合成78个nt长度的随机ssDNA文库，上游为23个nt的引物结合位点， 下游为20个nt的引物结合位点，中间为35个nt的随机序列，库容量为4 35。ssDNA的序列 为：
[0063] 5' -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3' 筛选过程中用于 PCR扩增的DNA引物分别为：引物P1，引物P2。
[0064] (I