专利名称：含sod基因的重组双表达家蚕多角体杆状病毒的构建方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及基因工程生产MnSOD的方法。具体地讲，本发明涉及含有 SOD基因及多角体基因的重组双表达家蚕杆状病毒的构建方法。
背景技术：
超氧化物歧化酶(SOD)能使人体内自由基保持在"自稳态"。超氧化物歧化酶清除超氧 化物自由基，防止对机体直接或间接的损伤作用；SOD使(V-成为细胞内自由基的排污漕；调
节机体内(V—的水平；调节机体内NO的水平；催化反应产物貼2的作用(《自由基生物学的理
论与应用》ppl78-180)。
现在市售SOD多数为从哺乳动物牛、猪等的肝脏中提取，随着疯牛病、口啼疫、禽流感 等流行，安全性有很大问题。家蚕重组病毒穿梭载体表达系统(Bac-to-Bac Bacnlovirus Expression System)是真核表达系统，该技术自1983年Smith等首创以来，已有千种外源 基因在该系统表达(《昆虫病毒分子生物学》，1998， pP547-178)，由于有家蚕血淋巴本身的 大量蛋白的保护作用和一些未知机理的作用，家蚕表达的蛋白质表达后修饰加工的方式与哺 乳动物接近，能识别并正确地进行信号肽切除及磷酸化、糖基化、酰基化等作用，表达产物 具有很高的生物活性，其抗原性、免疫原性和功能均与天然蛋白相似。
目前构建的重组杆状病毒大多是多角体缺失型病毒，这种病毒因为没有多角体包埋的病 毒粒子，经家蚕中肠强碱性破坏而失活，因此不能经口添食感染，需逐个个体注射接种，并 引起宿主死亡，使得每批生产时都要接种病毒，操作繁琐。注射接种就成为大规模、工业化 生产的瓶颈。
添食感染可采取重组病毒喷散到桑叶上的方法感染家蚕，结合现阶段的养蚕技术，可实 现规模化和工业化接种，操作简单，节省劳力和成本。
发明内容
为此本发明的目的是采用家蚕杆状病毒穿梭载体表达系统，构建含有SOD基因及多角 体基因的重组双表达杆状病毒，提供可以添食感染家蚕幼虫的病毒粒子。以期通过家蚕表达 目的基因MnSOD，实现规模化和工业化生产。
本发明含MnSOD基因的重组双表达家蚕多角体杆状病毒的构建方法包括以下步骤 (1)以家蚕5龄第3天幼虫以RNA抽提试剂盒提取总RNA，设计MnSOD引物，正反向引物5' 端分别引进fcoRI和A>/7l酶切位点；
(2) 以总RNA为模板，在通用引物oligo-dTw和反向转录酶(Super script II reverse transcriptase)作用下合成单链cDNA;
(3) 以单链cDNA为模板，在SOD正反向引物下PCR合成MnSOD基因，条件为94'C预变性5分 钟，再以94"C1分钟，55°C l分钟，72°C 2分钟，共35个循环，最后72'C延长10分钟；
(4) 合成的MnSOD基因经乙醇沉淀和fcdU和yf/wl双酶切，电泳并切胶回收将MnSOD基 因与pFastBacHTa以连接试剂盒连接并转化XL-Blue细胞，挑斑在含每毫升100 U g氨苄青霉 素的LB培养基中培养繁殖，提取重组供体质粒pFastBacHTa/MnSOD;
(5) 以家蚕杆状病毒DNA为模板，以多角体启动子5'端和多角体基因3'设计引物，通过 PCR方法合成家蚕部分多角体基因，并将其克隆到pFastBac Dual plasmid质粒；
(6) 以Afco工和/T/wI限制性内切酶分别酶切pFastBacHTa/MnSOD和含部分多角体基因的双 表达质粒，凝胶回收目的片段，将MnSOD基因插入双表达质粒的P10启动子下构建成双表达 载体Bm polyhedrin pFB dual/MnSOD;
(7) 将Bm polyhedrin pFB dual/MnSOD转染到￡ coh DH10Bac/BmNPV, 37. 5。C培养24 48小时，从中挑选容易分离、独立的白斑，在含有50ug/ml卡那霉素、7ug/ral庆大霉素、 10ug/ml四环素的液体培养基上培养过夜，收集并提取含有MnSOD基因和多角体基因的双表 达病毒DNA;
(8) 将上述提取的DNA，在转染试剂脂质体(Cellfectin)介导下导入转染家蚕培养细胞， 获得重组病毒。
步骤(1)所述Mn-SOD引物的序列为
正向引物5' -atcgaattcATGTTAATGTCACAAAGGATTG-3，，
反向引物5' -gatggtaccgcCTTGAGCGCTTTTTCATATCTCTG-3'。 步骤(5)所述合成家蚕部分多角体基因所用引物的序列如下 5' BM PH: GTCGACMGCTCTGTCCGT
Polyhedrin 3' Pstl: TTTTCTGCAGTTAATACGCCGGACCAGTG
本发明提供了含有提取家蚕幼虫总RNA，再经RT-PCR获得MnSOD基因的方法，经测序证 明其核苷酸序列完全正确。
本发明提供了含MnSOD基因的重组家蚕杆状病毒Bacmid。将MnSOD基因插入到Bacmid 中，获得重组的含SOD基因的BmBacmid/MnSOD。
本发明提供了经改造后的含多角体蛋白基因的双克隆位点供体质粒，重组病毒可经口添 食感染家蚕。
本发明提供了 MnSOD基因在家蚕幼虫中的表达产物。
综上所述，本发明的优点如下，通过构建含有MnSOD基因及多角体基因的重组双表达杆 状病毒，添食感染家蚕幼虫表达目的基因MnS0D;与哺乳动物组织提取的MnS0D在临床应用 中有种种不足(例如排异，疯中病等，交叉感染)相比，在家蚕幼虫的MnS0D更具有实用价 值；家蚕是可以无菌大规模生产的昆虫，可以低成本大规模的饲养。蚕体中有多种天然蛋白 质保护剂，对表达产物有保护作用，使基因表达产物十分稳定。
具体实施例方式
本发明通过以下实施例作进一步阐述。 实施例l、 Mn-SOD基因的合成
以家蚕N4蚕品种为材料，取5龄第3天幼虫以RNA抽提试剂盒(TRIzol RNA extraction reagent kit)提取总RNA，经电泳检测。
设计MnS0D引物。正向引物5' -atc卿ttcATGTTAATGTCACAAAGGATTG-3'， 反向引物 5' -gatggtaccgcCTTGAGCGCTTTTTCATATCTCTG-3'.为便于克隆正反向引物5'端分别引进5boRI 和命/ I酶切位点。
以总RNA为模板，在通用引物oligo-dT18和反向转录酶(Super script II reverse transcriptase)作用下合成单链cDNA，再以此为模板在SOD正反向引物下PCR合成MnSOD 基因，PCR合成的条件为94'C预变性5分钟，再以94'C1分钟，55°C 1分钟，72°C 2分钟， 共35个循环，最后72'C延长10分钟。
合成的MnS0D基因经乙醇沉淀和fc凍I和f/wl双酶切，电泳并切胶回收。将MnS0D基因与 pFastBacHTa以连接试剂盒连接并转化XL-Blue细胞，挑斑在含每毫升100 u g氨苄青霉素的 LB培养基中培养繁殖，提取重组供体质粒pFastBacHTa/MnSOD; 实施例2、含SOD基因的家蚕双表达重组载体构建
以家蚕杆状病毒DNA为模板，以5' BM PH: GTCGACAAGCTCTGTCCGT (for the 5' BM promoter) and Polyhedrin 3' Pstl: TTTTCTGCAGTTMTACGCCGGACCAGTG (the 3' of the Polyhedrin coding sequense)为引物，通过PCR方法合成家蚕多角体基因，并将其克隆到 pFastBac Dual plasmid质粒。
以/Ifcol和《w I限制性内切酶分别酶切pFastBacHTa/MnSOD和含家蚕多角体基因的双表 达质粒，凝胶回收目的片段，将MnS0D基因插入双表达载体的P10启动子下构建成双表达载 体Bm polyhedrin pFB dual/MnS0D。 实施例3、含MnSOD基因的家蚕双表达重组病毒构建
将Bm polyhedrin pFB dual/MnS0D转染到￡ DH10Bac/BmNPV， 37. 5。C培养24
48小时，每个培养板40小时平均产生菌斑264，白斑率4.5%，从中挑选容易分离、独立的
白斑6个，在含有50u g/ral卡那霉素、7ng/ml庆大霉素、10ug/ml四环素的液体培养基上
培养过夜，收集并提取含有MnSOD基因和多角体基因的双表达病毒DNA;
实施例4、含Mn SOD基因及多角体基因的双表达重组病毒添食感染家蚕表达目的蛋白MnSOD
的应用实例
将上述提取出的含有MnSOD基因和多角体基因的双表达病毒DNA,在转染试剂 Cellfectin (脂质体)介导下导入转染家蚕培养细胞(BraN)，获得双表达重组病毒，避光保 存于-4'C备用。
将上述双表达重组病毒DNA，与转染试剂Lipofectin—起注射到5龄起蚕，DNA 1 u g力口 入转染试剂Lipofectin 6u 1，混合均匀，放置30分，用微量注射器按每条5龄起蚕5 u 1 的剂量，在家蚕第三节间膜处注射进家蚕体腔中。
在注射混合液96小时后，调査家蚕发病情况，收集发病家蚕，对发病家蚕的血淋巴、尸 体进行400倍、600倍的显微镜检査，确定是否NPV病毒病。
对收集到的发病家蚕，经显微镜检查，确定是家蚕杆状病毒(NPV)病的家蚕，加水研碎， 涂抹桑叶，伺喂5龄起蚕二次，以后正常饲养。
添食后第2天开始收集家蚕NPV病毒病家蚕，取家蚕血淋巴进行SDS-PAGE， WESTERN BLOTTING和SOD活性测定。
测定结果注射重组杆状病毒DNA到家蚕，再将感染的家蚕磨碎液添食家蚕后96小时血 液中的MnSOD活性为125单位(U) /毫升血液(mL),比未感染重组病毒对照蚕(25 U/mL) 高5倍。 序列表
Mn-SOD引物的序列
正向引物5' -atcgaattcATGTTAATGTCACAAAGGATTG-3，, 反向引物5' -gat鹏accg cCTTGAGCGCTTTTTCATATCTCTG-3，。
合成家蚕部分多角体基因所用引物的序列
5' BM PH: GTCGACAAGCTCTGTCCGT
Polyhedrin 3' Pstl: TTTTCTGCAGTTAATACGCCGGACCAGTG
权利要求
1、含SOD基因的重组双表达家蚕多角体杆状病毒的构建方法，其特征在于以下步骤(1)取家蚕5龄第3天幼虫以RNA抽提试剂盒提取总RNA，设计MnSOD引物，正反向引物5’端分别引进EcoRI和KpnI酶切位点；(2)以总RNA为模板，在通用引物oligo-dT18和反向转录酶(Super script II reversetranscriptase)作用下合成单链cDNA；(3)以单链cDNA为模板，在SOD正反向引物下PCR合成MnSOD基因，条件为94℃预变性5分钟，再以94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟，共35个循环，最后72℃延长10分钟；(4)合成的MnSOD基因经乙醇沉淀和EcoRI和KpnI双酶切，电泳并切胶回收；将MnSOD基因与pFastBacHTa以连接试剂盒连接并转化XL-Blue细胞，挑斑在含每毫升100μg氨苄青霉素的LB培养基中培养繁殖，提取重组供体质粒pFastBacHTa/MnSOD；(5)以家蚕杆状病毒DNA为模板，以多角体启动子5’端和多角体基因3’设计引物，通过PCR方法合成家蚕多角体基因，并将其克隆到pFastBac Dual plasmid质粒；(6)以NcoI和KpnI限制性内切酶分别酶切pFastBacHTa/MnSOD和含家蚕多角体基因的双表达质粒，凝胶回收目的片段，将MnSOD基因插入双表达质粒的P10启动子下构建成双表达载体Bm polyhedrin pFB dual/MnSOD；(7)将Bm polyhedrin pFB dual/MnSOD转染到E.coli DH10Bac/BmNPV，37.5℃培养24～48小时，从中挑选独立的白斑，在每毫升含有50μg卡那霉素、7μg庆大霉素和10μg四环素的液体培养基上培养过夜，收集并提取含有MnSOD基因和多角体基因的双表达病毒DNA；(8)将上述提取的DNA，在转染试剂脂质体(Cellfectin)介导下导入转染家蚕培养细胞，获得重组病毒。
2、 如权利要求1所述含S0D基因的重组双表达家蚕多角体杆状病毒的构建方法，其特征在于 所述MnSOD引物的序列为正向引物5' -atcgaattcA TGTTAATGTCACAAAGGATTG-3'， 反向引物5' -gatggtaccg cCTTGAGCGCTTTTTCATATCTCTG-3'。
3、 如权利要求1所述含S0D基因的重组双表达家蚕多角体杆状病毒的构建方法，其特征在于 合成家蚕部分多角体基因所用引物的序列如下5' BM PH: GTCGACAAGCTCTGTCCGTPolyhedrin 3' Pstl: TTTTCTGCAGTTAATACGCCGGACCAGTG
全文摘要
含SOD基因的重组双表达家蚕多角体杆状病毒的构建方法，包括提取家蚕总RNA，设计MnSOD引物，合成单链cDNA，合成MnSOD基因，将MnSOD基因与pFastBacHTa连接并转化XL-Blue细胞，提取重组供体质粒pFastBacHTa/MnSOD；以家蚕杆状病毒DNA为模板，合成家蚕多角体基因，并将其克隆到pFastBac Dual plasmid质粒；将MnSOD基因插入双表达质粒的P10启动子下构建成双表达载体Bm polyhedrin pFB dual/MnSOD；将其转染后提取含有MnSOD基因和多角体基因的双表达病毒DNA；在转染试剂脂质体介导下导入转染家蚕培养细胞，获得重组病毒。提供可以添食感染家蚕幼虫的病毒粒子，通过家蚕表达目的基因MnSOD，实现规模化和工业化生产。
文档编号C12N15/866GK101182549SQ20071016449
公开日2008年5月21日 申请日期2007年12月5日 优先权日2007年12月5日
发明者岳万福, 缪云根 申请人:浙江大学