内毒素浓度测定方法及浓度测定用试剂盒的制作方法

专利名称：内毒素浓度测定方法及浓度测定用试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及样品中所含的内毒素的浓度测定方法及浓度测定用试剂盒。具体而 言，涉及利用生物发光反应的内毒素浓度测定方法及浓度测定用试剂盒。
背景技术：
“内毒素(endotoxin) ”是革兰氏阴性细菌外膜的构成成分之一，其活性主体为脂 多糖(LPS，lipopolysaccharide)。生物体内的内毒素在革兰氏阴性细菌的表层作为外膜 的一部分而存在。另外，通常在革兰氏阴性细菌死亡后，以游离内毒素的形式游离存在于血 流中。内毒素在血液中存在一定量以上时，由于该内毒素的刺激，单核细胞或粒细胞等 产生过量的炎症性细胞因子。结果引起称为内毒素血症的发热、败血症、败血症性休克或多 器官衰竭等症状。因此，注射用医药品等中的内毒素的检测极为重要，日本、美国和欧洲的 药典中都收录了内毒素试验方法。另外，在临床诊断上，认为准确测定血液中的内毒素，对 于早期诊断和治疗效果的判定是极为重要的。作为现有的内毒素测定方法，已知有将待测样品直接注射到兔体内，根据其体 温升高测定内毒素量的热原(pyrogen)试验，以及利用鲎的血细胞提取液(amebocyte lysate)因内毒素而凝胶化的现象的鲎试剂试验。其中，直接向兔体内注射的方法，在成本 方面、获得结果所需的时间及灵敏性方面存在问题，因此，目前主要采用鲎试剂试验作为内 毒素的测定方法。图1表示由内毒素引起的鲎血细胞提取液的凝胶化反应的过程。在鲎血细胞提取 液中存在与内毒素发生特异性反应的C因子途径。“C因子途径”由以下级联反应构成。首 先，内毒素与C因子(Factor C)牢固结合而使C因子活化。接着，由内毒素的结合而活化 的C因子(活化型C因子)使B因子(Factor B)活化。然后，活化的B因子(活化型B因 子)进一步使凝固酶原(proclotting enzyme)活化而生成凝固酶(clotting enzyme)。该 凝固酶使作为其底物的凝固蛋白原(coagulogen)部分水解。结果，从凝固蛋白原中游离出 C肽(p印tide C)，生成凝固蛋白(coagulin)。由于该凝固蛋白的凝固作用而产生凝胶化 (参考非专利文献1)。利用鲎试剂试验的内毒素测定方法，应用了上述的鲎血细胞提取液因内毒素而凝 胶化的过程。鲎试剂试验根据判定方法或测定方法的不同，已知有凝胶化翻转法(凝胶化 法)、合成发色底物法(比色法)以及比浊时间分析法(比浊法)等方法(参考非专利文献 2)。“凝胶化翻转法”是将待检测样品与鲎血细胞提取液在试管内混合，在一定条件下 (例如37°C下30 60分钟)使其反应后，在将该试管翻转或倾斜时，通过样品是维持液态 还是固化来进行判断的方法。前者的情况下为内毒素阴性，后者的情况下为阳性。该方法虽 然无需特别的装置，操作也较容易，但是测定结果容易因原料和制造批次的不同而改变，而 且由于由人进行判断因而与光学方法相比存在欠客观的问题，因此通常只用于粗略测定。
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“合成发色底物法”是使用合成发色肽底物作为凝固酶的底物，根据吸光度对游离 出的发色基团量进行比色定量，由此计算内毒素量的方法。合成发色肽底物是模仿天然底 物凝固蛋白原中的凝固酶水解位点的氨基酸序列的合成底物。使对硝基苯胺(PNA)等发色 基团结合在凝固酶的切割位点上，该发色基团通过酶切游离出来而发色。当发色基团为对 硝基苯胺时，随时间推移测定对硝基苯胺的最大吸收波长405nm的吸光度。另外，当发色基 团为对硝基苯胺的重氮化偶联物时，随时间推移测定545nm的吸光度。然后，对所得的随时 间推移的透光量的变化进行分析，从而测定内毒素浓度。该合成发色底物法虽然也存在试 剂价格较高、操作繁杂等问题，但定量性、灵敏性及客观性优良。“比浊时间分析法”是监测凝胶化导致的浊度增加作为透光量的变化，以反应液的 透光量比减少到一定阈值(通常为90%左右)所需的时间作为凝胶化时间，使用根据凝胶 化时间与内毒素浓度的关系而制作的标准曲线来计算内毒素值的方法。该方法的定量性和 客观性非常优良，但是测定需要专用装置。此外，有利用重组C因子和荧光底物、能以高灵敏度测定内毒素的试剂盒(商品 名PyroGene-rFc，Lonza ffalkersville, Inc.制造，第一化学药品株式会社销售)市售。非专利文献 1 :T. Miyata, M. Hiranaga et al. , Amino Acid Sequenceof the Coagulogen from Limulus polyphemus Hemocytes, The Journal ofBiological Chemistry,259，8924-8933(1984)非专利文献2 第15版修订日本药典，4. 01内毒素试验法，P70-73

发明内容
如上所述，合成发色底物法或比浊时间分析法等鲎试剂试验是定量性、客观性优 良的内毒素测定方法。然而，即使采用这些方法，在测定内毒素时仍被指出各种问题。例如 其结果与临床症状未必对应等问题。具体而言，可以列举以下情况即使采用的是鲎试剂试 验得到阴性结果的输液或透析液，但却经常出现发热等认为由内毒素引起的病例；或者虽 然临床上诊断为由于血液中革兰氏阴性细菌感染而发生的重症革兰氏阴性细菌感染症，但 是通过鲎试剂试验测定的血中内毒素浓度水平并不显示阳性。其原因认为是在目前的情况 下鲎试剂试验灵敏度尚存在问题。因此，开发灵敏度更高的内毒素测定方法成为当务之急。并且，期待开发无需使用 专用的测定装置、能够简单地实施的方法。本发明是鉴于上述问题而做出的，其目的在于提供无需使用专用的测定装置，即 可简便且快速地测定用现有内毒素测定方法无法检测的水平的内毒素的方法。本发明人为解决上述问题进行了潜心研究，结果发现，通过在现有鲎试剂试验中 应用生物发光反应，能够简便、快速且高灵敏度地测定样品中的内毒素，从而完成了本发 明。即，本发明的内毒素浓度测定方法，是测定样品中所含的内毒素的浓度的方法，其 特征在于，包括发光底物游离步骤，使样品、含有与内毒素结合而活化的C因子的试剂及 在肽上结合发光底物而形成的合成发光底物反应，从合成发光底物中游离出发光底物；发 光量测量步骤，使发光酶作用于通过发光底物游离步骤游离出的发光底物，并测定发光量; 和浓度定量步骤，根据通过发光量测量步骤得到的测定值定量样品中的内毒素浓度。
合成发光底物优选具有通过C因子活化而生成的活化型C因子、活化型B因子及 凝固酶中的任何一种的作用，使发光底物与肽之间的键被切断的结构。另外，发光底物优选 为氨基荧光素，发光酶优选为荧光素酶。荧光素酶优选来自于选自由北美萤(Photinus pyralis))、源氏萤(Luciola cruciata)、平家萤(Luciola lateralis))、小真菌虫内(Arachnocampaluminosa)、姬萤 (Hotaria parvula)、窗萤(Pyrocoelia)、北方锯角萤(Lucidinabiplagiata)、发光口口头虫 (Pyrearinus termitilluminan)禾口铁路螺虫(Phrixothrix hirtus)组成的组中的甲虫。 另外，荧光素酶优选为变异型荧光素酶，该变异型荧光素酶改变了野生型荧光素酶的氨基 酸序列，使发光强度比野生型荧光素酶增强。变异型荧光素酶优选为选自由以下(i) (V)组成的组中的一种(i)包含将序列编号13所示的野生型北美萤荧光素酶的氨基酸序列中，第423位 的异亮氨酸取代为亮氨酸，第436位的天冬氨酸取代为甘氨酸的氨基酸序列的变异型萤火 虫荧光素酶；(ii)包含将序列编号13所示的北美萤荧光素酶的氨基酸序列中，第423位的异亮 氨酸取代为亮氨酸，第530位的亮氨酸取代为精氨酸的氨基酸序列的变异型萤火虫荧光素 酶；(iii)包含将序列编号13所示的北美萤荧光素酶的氨基酸序列中，第436位的天 冬氨酸取代为甘氨酸，第530位的亮氨酸取代为精氨酸的氨基酸序列的变异型萤火虫荧光 素酶；(iv)包含将序列编号13所示的北美萤荧光素酶的氨基酸序列中，第423位的异亮 氨酸取代为亮氨酸，第436位的天冬氨酸取代为甘氨酸，第530位的亮氨酸取代为精氨酸的 氨基酸序列的变异型萤火虫荧光素酶；(v)包含将序列编号13所示的北美萤荧光素酶的氨基酸序列中，第47位的异亮 氨酸取代为苏氨酸，第50位的天冬氨酸取代为丝氨酸，第59位的蛋氨酸取代为苏氨酸，第 252位的苏氨酸取代为丝氨酸，第423位的异亮氨酸取代为亮氨酸，第530位的亮氨酸取代 为精氨酸的氨基酸序列的变异型萤火虫荧光素酶。优选含有C因子的试剂为鲎血细胞提取成分，鲎血细胞提取成分相对于反应体系 总量的蛋白质浓度为1. 5mg/mL 3. 5mg/mL。本发明的内毒素浓度测定试剂盒，其特征在于，包含含有与内毒素特异性结合而 活化的C因子的试剂、在肽上结合发光底物而形成的合成发光底物和发光酶作为构成成 分。发明效果根据本发明的内毒素浓度测定方法，由于在内毒素浓度测定中应用生物发光反 应，根据产生的发光量定量内毒素浓度，因此无需使用专用的测定装置，即可简便且快速地 测定用现有内毒素测定方法无法检测的水平的内毒素。


图1是表示由内毒素引起的鲎血细胞提取液的凝胶化反应的过程的图。图2是表示本发明的内毒素浓度测定方法的一例的图。
图3是实施例1的各样品浓度下的发光强度的散点图。图4是比较例的各样品浓度下的吸光度的散点图。图5是详细地表示图3的0. 01EU以下的浓度下的发光强度的图表。图6是实施例4的各鲎试剂浓度下的发光强度的散点图。
具体实施例方式1.内毒素浓度测定方法首先，用图1和图2说明本发明的内毒素浓度测定方法的机制。图1是表示由内 毒素引起的鲎血细胞提取液(LAL，Limulus AmebocyteLysate)的凝胶化反应的过程的图； 图2是表示本发明的内毒素浓度测定方法的一例的图。如图1所示，内毒素与C因子牢固结合而使C因子活化，活化的C因子(活化型C 因子)将B因子活化。随后，活化的B因子活化(活化型B因子)使凝固酶原活化，生成凝 固酶。凝固酶以凝固蛋白原为底物进行部分水解，生成作为凝固蛋白质的凝固蛋白。如图2所示，使含有内毒素的样品与鲎血细胞提取液接触时，鲎试剂反应系统被 样品中的内毒素活化。因此，在该反应系统中添加作为凝固酶底物的(苯甲酰基-亮氨 酸-精氨酸-精氨酸_氨基荧光素)时，精氨酸与氨基荧光素之间的键被由于鲎试剂反应系 统的活化而生成的凝固酶切断，从而游离出作为发光底物的氨基荧光素。使荧光素酶(发 光酶)作用于该氨基荧光素，由此产生光。荧光素/荧光素酶的发光反应由下述反应式(I) 表不。 本发明的内毒素浓度测定方法，是测定通过上述机制产生的光量，根据所得的测 定值(发光量)，定量样品中的内毒素浓度的方法。以下对本发明的内毒素浓度测定方法进行详细说明。本发明的内毒素浓度测定方 法优选包含(1)发光底物游离步骤，使样品、含有与内毒素结合而活化的C因子的试剂及在肽 上结合发光底物而形成的合成发光底物反应，从合成发光底物中游离出发光底物；(2)发光量测量步骤，使发光酶作用于通过发光底物游离步骤游离出的发光底物， 并测定发光量；和(3)浓度定量步骤，根据通过发光量测量步骤得到的测定值定量所述样品中的内 毒素浓度。(1)发光底物游离步骤发光底物游离步骤，是使样品、含有与内毒素结合而活化的C因子的试剂(以下称 为“含C因子试剂”)及在肽上结合发光底物而形成的合成发光底物反应，从合成发光底物 中游离出发光底物的步骤。
[样品]样品没有特别限制，可以列举例如注射剂、输液、透析液等医药品、血液(血浆)、 尿等临床样品。在临床样品中，当需要对鲎试剂反应系统的干扰因子(抑制因子或促进因 子)进行失活处理时，可以利用公知的失活处理法(例如过氯酸处理法(PCA法)或新PCA 法等)进行预处理。[含C因子试剂]含C因子试剂可以优选采用现有鲎试剂试验中使用的鲎血细胞提取成分。例如只 要是从属于美洲鲎属(Limulus)、东方鲎属(Tachypleus)或蝎鲎属(Carcinoscorpius)的 鲎的血细胞中获得的、通过与内毒素的反应可以生成凝固酶的物质，则没有特别限制。因 此，可以优选采用市售的鲎试剂(LAL试剂)或内毒素测定用试剂盒附带的鲎试剂(LAL试 剂)。此外，还可以采用来自于根据鲎的C因子的部分或全部基因而合成的重组基因的 重组c因子。重组C因子可以优选采用市售的PyroGene-rFc (Lonza ffalkersville, Inc. 制造，第一化学药品株式会社销售)附带的重组C因子。另外，也可以通过如下方法获得 按照公知的基因工程方法制作插入有鲎C因子的基因的表达载体，导入适当的宿主使之表 达重组蛋白，并进行纯化。采用现有鲎试剂试验中使用的鲎血细胞提取成分(例如，市售的鲎试剂)作为含C 因子试剂时，通过其与含有内毒素的样品的反应，生成活化型C因子、活化型B因子和凝固 酶。已知它们都是具有蛋白酶活性的蛋白质。因此，此时，可以使用具有活化型C因子识别 序列的物质、具有活化型B因子识别序列的物质以及具有凝固酶识别序列的物质作为合成 发光底物。但是，由于本发明的内毒素浓度测定方法采用活化型C因子、活化型B因子和凝 固酶中的任何一种的蛋白酶活性作为指标，因此使用与作为指标的酶对应的一种合成发光 底物。另一方面，采用重组C因子作为含C因子试剂时，由于该试剂中不存在B因子和凝 固酶原，因此通过与含有内毒素的样品的反应仅生成活化型重组C因子。因此，此时，可以 使用具有活化型C因子识别序列的物质作为合成发光底物。采用现有鲎试剂试验中使用的鲎血细胞提取成分(例如市售的鲎试剂)作为含C 因子试剂时，其使用量优选为现有使用量的约40% 约80%。这是因为，已知现有的使用 量(100%)会抑制发光反应而使发光强度降低，并且使用现有使用量的约40% 约80%时 可以获得高发光强度。现有使用量的约40% 约80%，按鲎血细胞提取成分(LAL)相对于 反应体系总量的蛋白质浓度换算，相当于1. 5mg/mL 3. 5mg/mL的范围。更优选为2. Omg/ mL 3.3mg/mL。因为可以使用比现有使用量更少的量进行高灵敏度测定，所以本发明的内 毒素浓度测定法在产业上非常有用。合成发光底物只要是在肽上结合发光底物而形成的物质即可。本说明书中所说的 “发光底物”，是指在生物发光中作为反应底物而发光的物质。发光底物可以优选采用荧光 素。其中，优选下式(II)所示的氨基荧光素。这是因为氨基荧光素的氨基能够与相邻的氨 基酸的羧基形成酰胺键。
8 与氨基荧光素结合的肽，只要包含该肽的C末端处与氨基荧光素形成的酰胺键能 被活化型C因子、活化型B因子和凝固酶中的任何一种的蛋白酶活性切断的氨基酸序列的 即可。只要满足该条件则氨基酸残基数和氨基酸序列没有特别限制，从特异性、合成成本、 操作容易性等观点考虑，优选氨基酸残基数为2个至10个。具体而言，作为具有凝固酶识别序列的肽，可以列举Aly-Val-Ile-Gly-Arg-(序 列编号 1)、Val-Leu-Gly-Arg-(序列编号 2)、Leu-Arg-Arg-(序列编号 3)、 Ile-Glu-Gly-Arg-(序列编号 4)、Leu_Gly-Arg-(序列编号 5)、Val-Ser_Gly-Arg-(序列编 号 6)、Val-Gly-Arg-(序列编号 7)等。作为具有活化型C因子识别序列的肽，可以列举dle-Glu-Ala-Arg-(序列编号 8)、Leu-Gly-Asn-Lys-Val-Ser-Arg-(序列编号 9)、Ile-Thr-Thr-Val-Gly-Arg-(序列编号 10)等。 作为具有活化型B因子识别序列的肽，可以列举Thr-Thr-Thr-Thr-Arg-(序列编 号 11)、Ser-Arg-Gln-Arg-Arg-(序列编号 12)等。肽的N末端可以由保护基保护。作为保护基，可以没有特别限制地使用通常在该 领域中使用的保护基。具体可以列举N-琥珀酰基、叔丁氧羰基、苯甲酰基、对甲苯磺酰基寸。本发明中使用的合成发光底物，例如可以参考日本特表2005-530485 (国际公 开号W02003/066611)的实施例6和实施例7所记载的方法来合成。另外，也可以使用 Promega公司销售的“Proteasome-Glo Assay Systems”所附带的合成发光底物(苯甲酰 基-Leu-Arg-Arg-氨基荧光素)。合成发光底物中含有游离的氨基荧光素时，优选预先将其 除去。通过从合成发光底物中除去游离的氨基荧光素，可以抑制背景发光。作为除去游离氨 基荧光素的方法，可以列举如下方法在含有20mMTriCine(N-三(羟甲基)甲基甘氨酸)、 8mM Mg2+、0. 13mM EDTA 的缓冲液(pH7. 8)中，混合含有 0. 8mM辅酶A、l. 5mM ATP.250 u g/ml 萤火虫荧光素酶及90mM DTT的溶液，并在室温(25°C )孵育1 6小时。[反应顺序(方法)]样品、含C因子试剂及合成发光底物的反应顺序(方法)，只要满足通过它们三者 的反应从合成发光底物中游离出发光底物(氨基荧光素)的条件，则没有特别限制。例如， 可以列举如下方法将样品与含C因子试剂充分混合并在37°C孵育约5分钟 约60分钟 后，加入合成发光底物并充分混合，在37°C孵育约1分钟 约30分钟(2)发光量测定步骤发光量测定步骤是使发光酶作用于通过前述的发光底物游离步骤游离出的发光 底物，并测定发光量的步骤。[发光酶]本发明中使用的发光酶，只要能催化从合成发光底物游离出的发光底物的生物 发光而产生光即可。发光底物为荧光素时，发光酶优选使用荧光酶。另外，发光底物为上述(II)所示的氨基荧光素时，发光酶使用来自甲虫的荧光酶。作为来自甲虫的荧光 酶，可以优选使用来自北美萤、源氏萤、平家萤、小真菌蚋、姬萤、窗萤、北方锯角萤、发光 叩头虫、铁路蠕虫等甲虫的荧光酶。这些来自甲虫的荧光酶的氨基酸序列及编码它们 的基因的碱基序列，以表1所示的收录号收录在公知的数据库(例如EMBL Nucleotide SequenceDatabase (http://ebi.ac.uk/embl))中。另外，荧光素酶可以是天然蛋白质，也可 以是重组蛋白质。本发明中可使用的荧光素酶，以试剂形式购自各公司。
另外，荧光素酶不限于具有野生型氨基酸序列的荧光素酶，只要具有催化发光底 物的生物发光的功能，则可以是具有与野生型氨基酸序列不同的氨基酸序列的变异型荧光 素酶。作为与野生型氨基酸序列不同的氨基酸序列，可以列举例如在野生型氨基酸序列中 缺失、插入、取代或添加一个或数个氨基酸而得到的氨基酸序列。在此所说的“缺失、插入、 取代或添加一个或数个氨基酸”，是指通过定点突变诱导法等公知的变异多肽制作方法，缺 失、插入、取代或添加能够缺失、插入、取代或添加的程度的数目(优选10个以下、更优选7 个以下、最优选5个以下)的氨基酸。变异型荧光素酶中，优选使用改变后发光强度增大的变异型荧光素酶。这是因为 能够高灵敏度地测定超微量的内毒素。作为改变后发光强度增大的变异型荧光素酶，可以列举例如以下的变异型荧光素酶(i)包含将野生型北美萤荧光素酶的氨基酸序列(序列编号13)中，第423位的异 亮氨酸(lie)取代为亮氨酸(leu)，第436位的天冬氨酸(Asp)取代为甘氨酸(Gly)的氨基 酸序列的变异型萤火虫荧光素酶；(ii)包含将北美萤荧光素酶的氨基酸序列中，第423位的异亮氨酸(lie)取代为 亮氨酸(leu)，第530位的亮氨酸(leu)取代为精氨酸(Arg)的氨基酸序列的变异型萤火虫 荧光素酶；(iii)包含将北美萤荧光素酶的氨基酸序列中，第436位的天冬氨酸(Asp)取代为 甘氨酸(Gly)，第530位的亮氨酸(leu)取代为精氨酸(Arg)的氨基酸序列的变异型萤火虫 荧光素酶；(iv)包含将北美萤荧光素酶的氨基酸序列中，第423位的异亮氨酸(lie)取代为 亮氨酸(leu)，第436位的天冬氨酸(Asp)取代为甘氨酸(Gly)，第530位的亮氨酸(leu) 取代为精氨酸(Arg)的氨基酸序列的变异型萤火虫荧光素酶；(v)包含将北美萤荧光素酶的氨基酸序列中，第423位的异亮氨酸(lie)取代为亮 氨酸(leu)，第530位的亮氨酸(leu)取代为精氨酸(Arg)，并且，第47位的异亮氨酸(lie) 取代为苏氨酸(Thr)，第50位的天冬氨酸(Asn)取代为丝氨酸(Ser)，第59位的蛋氨酸 (Met)取代为苏氨酸(Thr)，第252位的苏氨酸(Thr)取代为丝氨酸(Ser)的氨基酸序列的 变异型萤火虫荧光素酶。已经确认，上述(i) (v)的各变异型萤火虫荧光素酶的发光强度，与北美萤荧光 素酶(野生型)的发光强度相比，分别增大至(i)18倍、(ii)18倍、(iii)8倍、(iv)20倍和 (v)21倍(参考日本特开2007-97577号公报)上述变异型萤火虫荧光素酶可以通过将改变野生型萤火虫荧光素酶的基因而获 得的变异型萤火虫荧光素酶基因利用公知的方法插入到表达载体中，并导入适当的宿主细 胞，以重组蛋白质的形式表达、纯化而得到。基因的改变可以通过定点突变、随机突变或有 机合成等本领域人员公知的方法进行。另外，北美萤荧光素酶基因(cDNA)的碱基序列，以 收录号 M15077 收录在数据库(例如 EMBL Nucleiotide SequenceDatabase (http //ebi. ac.uk/embl)]中。另外，上述(i) (v)中所述的变异型萤火虫荧光素酶可以参考日本特 开第2007-97577号公报的实施例来制备。另外，对于源氏萤、平家萤、姬萤、窗萤、发光叩头虫及铁路蠕虫，本领域技术人员 根据公知的数据库中收录的它们的荧光素酶基因的碱基序列(参考表1)，通过公知的方法 也可以容易地获得变异型荧光素酶。并且，如果参考上述(i) (v)中所述的来自北美萤 的变异型萤火虫荧光素酶的取代氨基酸，通过对来自其它甲虫的荧光素酶中相同位置的氨 基酸进行取代，本领域技术人员可以容易地获得发光强度增大的变异型荧光素酶。[反应及测定顺序(方法)]在通过前述发光底物游离步骤得到的反应液、即含有游离发光底物(氨基荧光 素)的反应液中，加入发光酶(荧光素酶)。如上述反应式(I)所示，由于荧光素/荧光素 酶的发光反应中需要ATP和二价金属离子，因此，例如优选将荧光素酶溶解在含有ATP和镁 离子的缓冲液中，并添加该荧光素酶溶液。具体可以列举例如在室温(25°C)下进行反应， 从添加荧光素酶溶液后2秒钟开始测量10秒钟的发光值的方法。
发光量的测定可以使用市售的光度计(发光测定装置)。对于制造商和性能没有 特别限制，优选能够在相对光量测定值为0 1千万的范围内进行测定的装置。具体而言， 优选 kikkoman 公司的 Lumintestor C1000 或 Perkin Elmer 公司的 ARVO Light 等型号的 仪器。测定按所使用的装置的说明书进行即可。(3)浓度定量步骤浓度定量步骤是根据通过发光量测定步骤所得到的测定值，定量样品中的内毒素 浓度的步骤。使用已知浓度的内毒素溶液，事先制作表示内毒素浓度与该浓度下的发光值 的关系的标准曲线，将由上述发光量测定步骤所得到的测定对象样品的测定值代入该标准 曲线，由此可以求出样品中的内毒素浓度。2.内毒素浓度测定用试剂盒本发明的内毒素浓度测定用试剂盒，只要含有含C因子试剂、合成发光底物和发 光酶作为构成成分即可。这些成分的详细内容已经进行了说明，因此在此省略其说明。这 些成分以外的具体的试剂盒的构成没有特别限制，适当选择其它必要的试剂或器具等构成 试剂盒即可。通过使用本发明的试剂盒，可以简便且迅速地内实施上述本发明的内毒素浓 度测定方法。本说明书中，“试剂盒”是指具备内含特定材料的容器(例如瓶、板、管、碟等)的包 装。优选具备便于使用该材料的使用说明书。使用说明书可以书写或印刷在纸或其它介质 上，或者也可以记载在磁带、计算机可读的盘或带、CD-ROM等电子介质上。3.实施例以下，通过实施例详细说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。另外，以下的 实施例中使用的器具、试剂和水等不含有内毒素，或者含有不影响内毒素测定结果的极微
量的内毒素。[实施例1利用生物发光法的内毒素测定]< 方法 >使用内毒素测定试剂QCL_1000(Lonza ffalkiersville Inc.)附带的鲎试剂 (LAL)、内毒素标准液(来自大肠杆菌0111 :B4的内毒素)和无热原的水。合成发光底物使 用 Proteasome-Glo Assay Systems (Promega)附带的苯甲酰基-Leu-Arg-Arg-氨基荧光 素。荧光素酶使用本发明人利用大肠杆菌表达、纯化的野生型北美萤荧光素酶。具体而言， 是将从PicaGene盒式载体(东洋油墨公司制造)中切出的北美萤荧光素酶(野生型)基 因重组到大肠杆菌用表达载体pET28a (Novagen)中，并将其导入大肠杆菌中表达并进行纯 化。首先，用无热原的水稀释内毒素标准液，由此在0. 0001 0. 1内毒素单位(EU)/mL 的范围内制备9个梯度浓度的内毒素溶液，将其作为样品。另外，用不含内毒素的无热原的 水作为空白对照。然后取出50 yL各样品和空白对照，分别转移到装有50 yL鲎试剂的反 应试管中后，用涡流混合器混合数秒钟。混合后，在37士 1. 0°C的保温器内准确加温10分 钟。具体操作按照QCL-1000所附的操作规程进行。然后，加入溶解在含有ImM MgCl2的100mM Tris_Cl(pH8. 0)中的150yM的合成 发光底物(苯甲酰基-Leu-Arg-Arg-氨基荧光素)50 y L，在37士 1. 0°C的保温器内准确加 温5分钟。加温后，将反应液转移到生物发光测定专用试管(Lumitube，kikkoman株式会
12社)中，然后加入溶解在含10-5M ATPUmM MgCl2&100mM Tris-Cl (pH8. 0)中的荧光素酶 50 u L，并放置到Lumintestor C1000 (kikkoman株式会社)中测定样品的发光量。作为比较例，对同一样品使用QCL-1000附带的发色底物代替上述合成发光底物， 通过终点比色法进行测定。操作方法按照QCL-1000所附的操作规程进行。< 结果 >实施例1的结果如图3所示。另外，比较例的结果如图4所示。图3是实施例1的 各样品浓度下的发光强度的散点图，图4是比较例的各样品浓度下的吸光度的散点图。如 图4所示，使用现有发色底物的终点比色法，对于0. 025EU/mL以下的内毒素由于测定值过 低而不能进行定量评价。另一方面，如图3所示，使用合成发光底物测定发光强度的方法， 即使是0. 01EU/mL以下的浓度也能够测定。另外，图5详细地表示了图3的0. 01EU/ml以下的浓度下的发光强度。由图5可 知，通过利用生物发光法测定发光强度，可以测定0. 0005EU/mL的内毒素。[实施例2利用使用变异型荧光素酶的生物发光法的内毒素测定]本发明的内毒素浓度测定方法中，尝试使用了确认发光强度比野生型荧光素酶的 发光强度高的变异型荧光素酶。〈方法〉本实施例中使用的变异型荧光素酶，包含将北美萤荧光素酶的氨基酸序列中，第 423位的异亮氨酸取代为亮氨酸、第530位的亮氨酸取代为精氨酸，并且，第47位的异亮氨 酸取代为苏氨酸、第50位的天冬氨酸取代为丝氨酸、第59位的蛋氨酸取代为苏氨酸、第252 位的苏氨酸取代为丝氨酸的氨基酸序列，是本发明人根据日本特开第2007-97577号公报 的实施例14所述的方法自行制备的。样品是与实施例1同样地，通过用无热原的水稀释内毒素标准液，在0.0001 0. lEU/mL的范围内制备12个梯度浓度的内毒素溶液。另外，用不含内毒素的无热原的水作 为空白对照。除了使用实施例1中所用的荧光素酶(野生型荧光素酶)与上述变异性荧光 素酶两种荧光素酶以外，与实施例1同样进行。另外，本实施例中未通过终点比色法设置对 照。〈结果〉结果如表2所示。由表2可知，内毒素浓度为0. 000lEU/mL时的发光强度为约 400RLU，是使用野生型荧光素酶时的10倍以上。由该结果显示，如果使用变异型荧光素酶， 则可以高灵敏度地测定微量的内毒素。由于生物发光测定中的背景值为20-30RLU，这说明 通过使用变异型荧光素酶连0. 000lEU/mL以下的超微量的内毒素也能够测定。表2 [实施例3利用使用野生型荧光素酶和变异型荧光素酶的生物发光法的内毒素 测定]使用与实施例2相同的材料和方法，测定内毒素浓度。另外，实施例2中以减去空 白值的数值表示测定值(参考表2)，本实施例3中以未减去空白值的实测值表示测定值。结果如表3所示。由表3可知，使用野生型荧光素酶进行测定时的检出极限为 0. 005EU/mL。与此相对，使用变异型荧光素酶时，连0. 0005EU/mL的内毒素浓度也能够测 定。与实施例2的结果同样地，由实施例3的结果也表明，如果使用变异型荧光素酶，可以 高灵敏度地测定微量的内毒素。另外，变异型荧光素酶在内毒素浓度为0. 0001EU/mL时的 发光强度为约5500RLU，是使用野生型荧光素酶时的10倍以上。由于生物发光测定中的背 景值为20-30RLU，这说明通过使用变异型荧光素酶连0. 0001EU/mL以下的超微量的内毒素 也能够测定。表3 [实施例4鲎试剂(LAL)浓度对发光强度的影响的研究]〈方法〉用无热原的水稀释内毒素标准液，制备含0.05内毒素单位(EU)/mL的样品。向鲎 试剂(LAL)中添加无热原的水，制备90% (LAL 水=9 1) 10% (LAL 水=1 9) 的9个梯度浓度的LAL。作为鲎试剂(LAL)，使用包括原液(100% )和不含鲎试剂(LAL)的 试剂(0%，仅含无热原水)在内的11个梯度浓度的试剂。荧光素酶使用实施例2和3中使用的变异型荧光素酶，其它试剂使用与实施例1 相同的试剂。测定方法与实施例1相同。测定体系的总量是将样品50 yL、各浓度的鲎试剂 (LAL)50iiL、合成发光底物溶液50iiL以及荧光素酶溶液50iiL相力口，为200iiL。另外，通 过280nm波长下的吸光度测定求出11个梯度浓度的鲎试剂(LAL)的蛋白质浓度(0D28CI = 1 时为 lmg/mL) 0结果如表4及表6所示。图4的LAL浓度表示测定体系(200 y L)中LAL的终浓 度。由表4和表6可知，使用100% LAL(未稀释)和90% LAL时，发光反应受到抑制，发光 强度降低，即灵敏度降低。另一方面，也表明在40% LAL 80% LAL的范围内，可以得到高 发光强度。该范围相当于LAL相对于测定体系总量的蛋白质浓度为1. 67mg/mL 3. 33mg/ mL的范围。由该结果表明，通过使用比现有的常用量少的LAL，可以进行高灵敏度的测定。
表 4 由以上结果表明，根据本发明，能够以比现有鲎试剂试验中可与本发明在相同时 间内进行测定的终点比色法的检出下限值(0.025EU/mL)更微量的0. 0005EU/mL的内毒素 作为终点进行测定。此外还判断出，可测定0.001EU/mL内毒素的比浊时间法其测定需要 180分钟以上的时间，与此相对，根据本发明可以在15分钟之内进行测定。另外还说明，如 果使用发光强度比野生型荧光素酶的发光强度更强的变异型荧光素酶，则连0. 0001EU/mL 以下的超微量的内毒素可以测定。另外还表明，通过将鲎试剂(LAL)的使用量从现有使用 量减少到0. 4 0. 8体积(终浓度为1. 5 3. 5mg/mL)来使用，可以增强发光强度，进行高 灵敏度的内毒素测定。由这些结果可知，通过使用本发明，可以防止发生由于注射用医药品等中混入用 现有方法不能检出的量的内毒素而引起的副作用。另外，由于能够测定临床样品中极微量 的内毒素，因而可以明确体内内毒素浓度与各种病理状态的相关性。此外，使内毒素血症的 早期诊断和早期治疗成为可能，可以期待对医疗现场作出很大的贡献。而且还可以低成本 地提供高灵敏度的内毒素测定试剂。另外，本发明不限于上述各实施方式和实施例，可以在权利要求书所示的范围内 进行各种变更，将不同实施方式中分别公开的技术手段适当组合而得到的实施方式也包含 在本发明的技术范围内。另外，本说明书中记载的学术文献及专利文献均作为参考文献引 入本说明书中。
产业实用性本发明可以应用于医疗领域、特别是医药品制造及临床检验等领域。
权利要求
一种内毒素浓度测定方法，用于测定样品中所含的内毒素的浓度，其特征在于，包括；发光底物游离步骤，使样品、含有与内毒素结合而活化的C因子的试剂及在肽上结合发光底物而形成的合成发光底物反应，从该合成发光底物中游离出所述发光底物；发光量测量步骤，使发光酶作用于通过所述发光底物游离步骤游离出的发光底物，并测定发光量；和浓度定量步骤，根据通过所述发光量测量步骤得到的测定值定量所述样品中的内毒素浓度。
2.如权利要求1所述的内毒素浓度测定方法，其特征在于，所述合成发光底物具有通 过所述C因子活化而生成的活化型C因子、活化型B因子及凝固酶中的任何一种的作用使 所述发光底物与所述肽之间的键被切断的结构。
3.如权利要求2所述的内毒素浓度测定方法，其特征在于，所述发光底物是氨基荧光 素，所述发光酶是荧光素酶。
4.如权利要求3所述的内毒素浓度测定方法，其特征在于，所述荧光素酶来自于选自 由北美萤、源氏萤、平家萤、小真菌蚋、姬萤、窗萤、北方锯角萤、发光叩头虫和铁路蠕虫组成 的组中的甲虫。
5.如权利要求3或4所述的内毒素浓度测定方法，其特征在于，所述荧光素酶是变异型 荧光素酶，该变异型荧光素酶改变了野生型荧光素酶的氨基酸序列，使发光强度比野生型 荧光素酶增强。
6.如权利要求5所述的内毒素浓度测定方法，其特征在于，所述变异型荧光素酶为选 自由以下(i) (ν)组成的组中的一种(i)包含将序列编号13所示的野生型北美萤荧光素酶的氨基酸序列中，第423位的异 亮氨酸取代为亮氨酸，第436位的天冬氨酸取代为甘氨酸的氨基酸序列的变异型萤火虫荧 光素酶；( )包含将序列编号13所示的北美萤荧光素酶的氨基酸序列中，第423位的异亮氨酸 取代为亮氨酸，第530位的亮氨酸取代为精氨酸的氨基酸序列的变异型萤火虫荧光素酶；(iii)包含将序列编号13所示的北美萤荧光素酶的氨基酸序列中，第436位的天冬 氨酸取代为甘氨酸，第530位的亮氨酸取代为精氨酸的氨基酸序列的变异型萤火虫荧光素 酶；(iv)包含将序列编号13所示的北美萤荧光素酶的氨基酸序列中，第423位的异亮氨酸 取代为亮氨酸，第436位的天冬氨酸取代为甘氨酸，第530位的亮氨酸取代为精氨酸的氨基 酸序列的变异型萤火虫荧光素酶；(ν)包含将序列编号13所示的北美萤荧光素酶的氨基酸序列中，第47位的异亮氨酸取 代为苏氨酸，第50位的天冬氨酸取代为丝氨酸，第59位的蛋氨酸取代为苏氨酸，第252位 的苏氨酸取代为丝氨酸，第423位的异亮氨酸取代为亮氨酸，第530位的亮氨酸取代为精氨 酸的氨基酸序列的变异型萤火虫荧光素酶。
7.如权利要求1 6中任一项所述的内毒素浓度测定方法，其特征在于，所述含有C因 子的试剂为鲎血细胞提取成分，该鲎血细胞提取成分相对于反应体系总量的蛋白质浓度为 1. 5mg/mL 3. 5mg/mL0
8. 一种内毒素浓度测定用试剂盒，其特征在于，包含含有与内毒素特异性结合而活化 的C因子的试剂、在肽上结合发光底物而形成的合成发光底物和发光酶作为构成成分。
全文摘要
本发明提供一种方法，通过使待测样品、含有与内毒素结合而活化的C因子的试剂、在肽上结合发光底物而形成的合成发光底物反应，从合成发光底物中游离出发光底物，使发光酶作用于游离的发光底物并测定发光量，根据所得的测定值定量样品中的内毒素浓度，由此，无需使用专用的测定装置，即可简便且快速地测定用现有内毒素测定方法无法检测的水平的内毒素。
文档编号C12N15/09GK101855539SQ20088011578
公开日2010年10月6日 申请日期2008年11月11日 优先权日2007年11月12日
发明者野田健一, 黑田章夫 申请人:国立大学法人广岛大学