专利名称：复合猪白细胞介素基因抗感染纳米分子制剂的制备和应用的制作方法
技术领域：
1.生物技术 2.分子免疫学背景技术养殖业(畜牧业和水产)为大农业的重要组成部份，是我国农业现代化和农村经济发展、社会稳定的重要根基之一，欧美先进国家养殖业均十分发达，都在大农业中占50％以上的比重。它为人类提供肉、奶、蛋、皮毛等高档食品及重要轻纺原料，畜产品是人们优质蛋白质、矿物质、维生素等营养物质的主要来源，其安全性直接关系到人类的身体健康。由于近年来畜产品引起的中毒、疾病传染等恶性事件不断发生，如欧洲的疯牛病、口蹄疫、亚洲的禽流感等，对畜牧生产和食品加工业造成了重大影响。动物疫病已成为影响畜产品安全、人类身体健康和社会稳定及广大农牧民增收致富的重要因素。在我国养殖业中，重要的动物传染性疾病多达30多种；我国现在不仅旧病未消灭，而且新病不断涌现，动物传染病的平均发病率和死亡率高达15-20％和8-10％左右，每年给我国的养殖业造成至少400多亿元的直接经济损失。现代人类正面临病原微生物感染难于控制的严峻挑战。因此高效防治传染性疾病和促进动物健康生长是保障我国养殖业提高经济效益和可持续发展的核心所在，也是保护人民食品卫生和生命健康迫切需要解决的重大科技难题；更是我国畜牧业面对世界范围的大市场，突破“绿色壁垒”，参与国际市场竞争，树立新形象的必然选择。
全新的“第三代免疫增强剂”为解决这一问题带来了新的希望。免疫增强剂能提高机体特异和非特异的免疫防御能力，增强机体识别、杀灭和清除病原及异已物质的能力，并且在机体免疫功能低下或处于抑制状态时，重建免疫功能，提升免疫水平，从而保证机体健康。第三代免疫增强剂是经历了第一代外源性化学药物分子和植物源分子的免疫增强剂，以及“细胞因子”类物质的第二代免疫增强剂，发展起来的一类新型免疫增强剂。第三代免疫增强剂利用现代生物工程技术，将免疫调节效应很强的细胞因子基因克隆入高效真核表达载体，构建重组真核质粒，将其有效转染导入机体细胞，使之持久稳定表达出所需的细胞因子，增强其浓度，从而能够特异高效而持久地增强机体免疫防御能力，达到经济防治目前难以控制的病毒，细菌性传染病和寄生虫病的目的；并且预防条件性病原造成难以控制的复杂感染和疾病。近年来，人们对于用细胞因子表达性质粒直接转染动物方面进行了研究，取得了许多结果。其特点是这些细胞因子可以在动物体内表达，达到免疫刺激增强作用，并且有容易生产，易纯化，易保存，作用持久，理化性质稳定等特点。所以，构建高效重组细胞因子表达质粒作为新型抗感染制剂是一个有经济价值和社会效益的方法。
细胞因子是体内免疫细胞或非免疫细胞产生的一组具有广泛生物学活性的异质性肽类调节因子，也是目前最有效的免疫调节分子，对各类免疫活性细胞的分化、发育、成熟和活化中均起着十分重要的调节作用；可以定向特异调节抗原疫苗的体液免疫和细胞免疫应答。其中对IL-2、IL-6、IL-4等的研究较为活跃。
白细胞介素-2(IL-2)主要由激活的T细胞产生，在免疫系统中具有十分重要的免疫生理调节效应，能激活、提高免疫细胞的多种功能，如提高它们杀伤癌细胞、病毒或细菌感染细胞、促进抗体生成和分泌的能力。自Taniguchi等1983年从人细胞中首次克隆出IL-2全长cDNA，并报道其全序列以来，目前已从30多种动物中克隆出此基因，重组IL-2也在人类医学提高免疫抗病机能、抗感染和治疗癌症等方面获得了广泛的应用。
白细胞介素4(IL-4)具有多种生物学功能，可以作用于T细胞、B细胞、胸腺细胞、肥大细胞、巨噬细胞等多种靶细胞，激活的B细胞产生的抗体主要是IgG和IgE，是机体体液免疫的重要调节因子，也在粘膜免疫中也发挥着重要作用。IL-4可以刺激肥大细胞和B细胞的增殖，促进嗜酸性的富集和浸润。IL-4还是CD4+Th幼稚前体细胞(Thp细胞)分化发育成Th2细胞的重要信号。IL-4主要由辅助T细胞(Th细胞)产生，大多数能诱导T细胞活化的因素都能诱导T细胞产生IL-4。
白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)是迄今发现的功能最为广泛的细胞因子之一，能够刺激B细胞的分化和IgG的产生，亦能刺激外周T细胞和胸腺T细胞成熟分化为细胞毒型T细胞(CTL)，诱导特异性干扰素—激活基因，刺激由SPA-Cowan-I型激活的正常B细胞分泌IgM和IgG，诱导EB病毒转化的B细胞分泌IgM和IgG，刺激肝细胞，诱导急性期蛋白的表达，在机体免疫应答、骨髓造血、自身免疫和机体防御等方面均起到重要作用。IL—6可由各种淋巴细胞和非淋巴细胞受各种刺激所分泌。成纤维细胞、单核细胞、某些T细胞系等都可以产生IL-6。值得人们注意的是，这些不同种类的组织细胞均产生白细胞介素-6，但最终都对免疫系统起各种调节作用，可以认为白细胞介素-6是联系免疫和非免疫细胞之间双向传递信息的一个重要的途径。
IL-4、IL-6均是由CD4+T Th2细胞分泌的细胞因子，可刺激B细胞激活和抗体的分泌，对增加B细胞在体液免疫方面的功能有重要作用。IL-4在许多细胞类型中是IL-6表达的潜在诱导物。IL-4和IL-6相互调节在很多文献中已有报道，在成骨细胞中IL-4可诱导IL-6的分泌，其作用是IL-13的10倍。IL-6可抑制Th2细胞炎症因子的分泌，而这种调节作用需IL-4的参与。
应用免疫基因体细胞转基因表达持续提高动物抗病防御和免疫应答能力，有选择性地增强与免疫保护密切相关的特定免疫细胞活性，使免疫动物建立起坚强而持久的特异性免疫保护力，并提高机体的整体免疫水平，达到免疫防病和治病、防制病原感染的根本目的。这种经济简便的防治传染性疾病的策略尤为适合我国的国情。
目前限于细胞因子基因在动物体内的表达活性较低，免疫增强效果不够理想，实际应用中需用大剂量的基因质粒，从而了阻碍免疫增强剂的应用和推广。如何提高基因表达产物的活性及其表达效率是广泛使用免疫增强剂的关键所在。传统的提高真核基因表达效率的方法对增加细胞因子的活性作用十分有限，远不能满足实际生产对免疫增强剂高效廉价和效应持久的要求。采用新的基因工程技术显著提高细胞因子基因表达的生物活性以及组合应用细胞因子提高免疫调节活性为解决这一难题提供了崭新的途径。
融合蛋白是利用基因工程技术构建的人工蛋白，可以优化蛋白性能，甚至产生新功能。融合蛋白可以有多种融合方式，分别在免疫反应的各个阶段发挥作用。两种细胞因子融合成一种新的蛋白，两者可以取长补短，也可兼两者之长，发挥其双因子抗癌和增强免疫的综合效应，或使其某些活性显著提高，出现双因子简单合用所不具备的生物学效应。自1986年日本的Masahara等人在大肠杆菌中表达了干扰素γ(IFN-γ)/白介素2(IL-2)融合蛋白以来，迄今国内外已陆续报道了PIXY321，IFN-γ/肿瘤坏死因子(TFN)，IL-2/IL-6，IL-3/红细胞生成素和CH925等几种有价值的细胞因子融合蛋白。
DNA Shuffling(DNA改组)是1994年由美国Affymax研究所Stemmer等发明的一种基于PCR的DNA突变、重组技术，是DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组的新技术。它通过基因的有性重组，改变基因或基因家族原有核苷酸序列，不仅可以加速积累有益突变，而且可以使蛋白质两个或多个的优化性质合为一体，赋予表达产物以更好的生物学功能。同时突变后的基因在序列、结构、功能上均显著区别于原来基因，可以获得自主知识产权，故在生物工程的各个领域均已显示出具有巨大的应用潜力。
本发明运用基因融合技术，进行了猪白细胞介素4、6融合基因的构建；利用DNA改组技术，将来源于人、藏猪、牦牛和小鼠的白细胞介素-2基因家族进行了改组，构建了猪白细胞介素4、6融合基因真核表达质粒VRIL46、改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒VRIL2S。利用离子交联法制备壳聚糖纳米颗粒，包装猪白细胞介素4、6融合基因真核表达质粒VRIL46和改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒VRIL2S组合免疫猪，并开展对疫苗免疫调节作用研究，为研制新型的高效分子免疫佐剂，提高猪的免疫应答能力，增强其抗病性奠定坚实的基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题具体包括猪白细胞介素-4、6基因的融合、融合猪白细胞介素-4、6基因真核表达质粒的构建，白细胞介素-2的改组、改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒VRIL2S的构建，壳聚糖纳米颗粒对VRIL46、VRIL2S重组真核质粒的分子包装及其增强动物免疫应答和免疫保护力的应用。该方法包括下列步骤1、猪白细胞介素-4、6基因的克隆、融合设计IL4、IL6基因的连接接头与融合PCR引物，分别扩增猪IL4和IL6基因，连接入相应的pMD18-T载体，双酶切后，先将PIL6连接到同样双酶切的pGEX4T-1质粒上，再将从载体双酶切获得的PIL4片段与重组的pGPIL6连接，转化感受态细胞，筛选阳性转化子，酶切鉴定获得融合的pGPIL46重组质粒。
2、融合猪白细胞介素-4、6基因的真核表达质粒的构建猪白细胞介素-46融合基因和真核表达载体VR1020双酶切，连接转化，筛选和酶切鉴定重组子VRIL46。
3、IL-2基因的DNA改组DNA酶切猪、牦牛、小鼠和人IL2基因，分离回收50-100bp的核苷酸片断；经无引物和有引物两步PCR重新扩增IL2基因，分离纯化获得改组的IL2基因；构建重组基因库，筛选高活性的IL2改组基因阳性克隆，改组IL2基因(shuffled IL2，SIL2)连接入PGEX4T-1原核表达载体，转化感受态细菌，构建重组基因库；免疫印迹法筛选表达IL2的阳性转化子，PCR扩增和酶切鉴定阳性克隆基因。
4、改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒的构建将改组IL2基因亚克隆入VR1020真核表达载体，转化、筛选阳性表达克隆，将构建的改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒命名为VRIL2S。
5、纳米颗粒的制备利用离子交联法，以分子量150000，脱乙酰度95％以上的壳聚糖制备纳米包装颗粒，将壳聚糖溶液(pH5.5)和VRIL46+VRIL2S质粒组合、VR1020质粒(含适当浓度三聚磷酸盐)溶液50℃水浴分别恒温20min，然后均匀混合质粒溶液和壳聚糖溶液5min，即得质粒壳聚糖纳米颗粒样品液。
6、免疫用质粒DNA的大量制备接种含有重组真核表达质粒VRIL46、VRIL2S、VR1020单菌落于含相应抗生素的LB培养基，37℃振摇过夜；离心后收集菌体；加入溶液I悬浮菌体，加入溶液II，翻转混合后，冰浴加入溶液III，翻转混合，冰浴；离心后转移上清至新的离心管，加入异丙醇，-20℃放置，离心去上清，Tris.Cl溶解DNA，加入亚精胺、异丙醇、70％乙醇纯化质粒，溶解于灭菌生理盐水，调节浓度为3pmol/μl。
7、质粒组合壳聚糖纳米颗粒抗感染制剂的应用选择3周龄小猪20只，随机分为2组，每组10只。采用肌肉注射法，每头质粒剂量0.5mg/头。所有猪按该养猪场常规免疫程序接种疫苗1周龄免疫接种蓝耳病疫苗；2周龄免疫接种伪狂犬疫苗。3周龄在免疫注射基因制剂时同时免疫接种猪瘟疫苗。
猪自免疫后第0，1，2，4，6，8周前腔静脉采血，分离血清，用以检测体液免疫反应。酶联免疫检测技术按照常规ELSA方法。
检测了各组猪的体液免疫(IgG、IgA及IgM的含量、特异性抗体的测定)和细胞免疫水平(细胞因子和外周血免疫细胞数量)的影响情况，并对不同形式的质粒作用下细胞免疫和体液免疫应答的变化，进行了较为系统地分析。
结果发现以壳聚糖纳米颗粒包装猪白细胞介素4、6融合基因真核表达质粒(CNP-VRIL46)和改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒(CNP-VRIL2S)组合作为免疫增强剂时，与猪常规疫苗联合使用，猪的IgG、IgA、IgM含量和血清IL-2、IL-4、IL-6等细胞因子水平比对照组显著升高；同时，白细胞、淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞等免疫细胞数量也明显增加；对疫苗的特异性免疫应答也显著加强。
这些结果表明CNP-VRIL46和CNP-VRIL2S组合能显著提高猪的免疫应答水平，增强体液免疫和细胞免疫反应。提示壳聚糖纳米颗粒包裹猪白细胞介素4、6融合基因真核表达质粒VRIL46和改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒VRIL2S组合可提高机体细胞免疫和体液免疫水平，增强免疫应答及免疫保护力，作为高效新型抗感染免疫调节剂，具有广泛应用前景。
图1 猪白细胞介素4、6基因cDNA的PCR扩增电泳图谱1，4posotive control2PIL-4 cDNA3PIL- 6cDNA图2 pUFPIL4重组子酶切鉴定电泳图1pUFPIL4质粒MDL 20002pUFPIL4/PmaCI3pUFPIL4/SalI+XhoI图3 pUFPIL6重组子酶切鉴定电泳图1pUFPIL6质粒MDL2000 marker2pUFPIL6/PstI3pUFPIL6/BamHI+SalI图4 FPIL-6 cDNA，FPIL-4 cDNA片段酶切回收检测电泳图谱1FPIL-4 cDNA片段酶切回收MDL20002FPIL-6 cDNA片段酶切回收图5 IL-6插入PGEX4T-1的酶切电泳图谱1pGFPIL-6/BamHI+SalIMDL20002pGFPIL-6/BamHI3pGFPIL-6/SalI4pGFPIL-6/XhoI5pGFPIL-6质粒图6 IL-4插入pGFPIL-6的酶切电泳图谱1pGFPIL-6/IL4/PstIMDL2000Marker2pGFPIL-6/IL4/BamHI+Xhol
3pGFPIL-6/IL4/SalI+XhoI4pGFPIL-6/IL4/BamHI+SalI图7 pGFPIL-6/IL4质粒PCR电泳图谱1pGEX-4T-1质粒PCR/P1+P4MDL2000Marker2pGFPIL-6/IL4质粒PCR/P3+P43pGFPIL-6/IL4质粒PCR/P1+P24pGFPIL-6/IL4质粒PCR/P1+P4图8 白细胞介素4、6融合基因真核表达质粒VRIL46的RT-PCR和酶切电泳分析1VRIL46RT-PCR结果MDL20002VRIL46酶切结果图9 IL2基因家族改组结果1Marker2无引物PCR3有引物PCR图10 改组的TPIL-2酶切电泳图1DL20002pGTPIL-2/BamHI+EcoRI双酶切3pGTPIL-2图11 VRIL2S质粒PCR电泳图1DL2,0002VRIL2S质粒PCR图12 免疫猪血清中IgG含量图13 免疫猪血清中IgA含量图14 免疫猪血清中IgM含量图15 免疫猪血清中猪瘟特异性抗体含量图16 免疫组猪血清中猪蓝耳病特异性抗体含量图17 免疫猪血清中IL-2含量图18 免疫猪血清中IL-4含量图19 免疫猪血清中IL-6含量图20 免疫猪白细胞数量变化图21 免疫猪单核细胞数量变化图22 免疫猪淋巴细胞数量变化图23 免疫猪中性粒细胞数量变化具体实施方式
1、猪白细胞介素-4、6基因的克隆、融合设计IL4、IL6基因的连接接头与融合PCR引物，分别扩增猪IL4和IL6基因，连接入相应的pMD18-T载体，双酶切后，先将PIL6连接到同样双酶切的pGEX4T-1质粒上，再将从载体双酶切获得的PIL4片段与重组的pGPIL6连接，转化感受态细胞，筛选阳性转化子，酶切鉴定获得融合的pGPIL46重组质粒。
结果见说明书附图1、2、3、4、5、6、7。图1显示使用连接引物分别以IL-6和IL-4为为模板扩增，并以pUC18空载为对照，通过PCR反应获得的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳.分别在700bp和420bp处呈现一条与预期产物相对分子质量大小相符的DNA条带，它们分别是0.7kb的猪白细胞介素-6和0.42kb的猪白细胞介素-4DNA片段。与编码IL-6模板序列相比，在其C端去除了终止密码子，引入SalI的酶切位点，与编码IL-4模板序列相比，引入SalI后，增加了Val和Asp两个氨基酸，再加引入的柔性肽序列，在其N端共增添了6个接头氨基酸。
图2、3显示回收产物与pMD18-T载体连接，16℃连接过夜，连接产物转化DH5α感受态细胞，将Amp平板的转化子点种X-gal平板，过夜培养以后，将白色菌落接种于LA，提取质粒DNA，对较空载大的质粒进行酶切分析，连IL-6的转化子用BamHI和SalI酶切，连IL-4的转化子用SalI和XhoI酶切，1.0％琼脂糖凝胶电泳观察，筛选有目的片段插入的重组质粒，再分别用IL-6和IL-4特有的酶进行酶切分析，确证为正确的重组子。重组质粒分别命名为pUFPIL6和pUFPIL4。
将克隆到pMD18-T载体上的FPIL-6，FPIL-4 cDNA片段酶切回收，结果见说明书附4。将pGEX4T-1进行BamHI，SalI酶切，同经BamHI，SalI酶切的pUFPIL-6 cDNA片段在T4DNA连接酶作用下进行连接反应。连接产物转化DH5α感受态细胞，抽提转化子质粒，进行酶切和PCR鉴定，得到含FPIL-6cDNA片段的重组质粒pGFPIL6，结果见说明书附5。
图6、7显示进一步将pGEX4T-1-IL6进行SalI、XhoI酶切，去磷酸化处理后同SalI，XhoI酶切的pUFPIL-4 cDNA片段进行连接反应，连接产物转化DH5α感受态细胞，抽提转化子质粒，方向插入正确的pUFPIL-4cDNA片段可以用SalI、XhoI酶切出420bp的片段，方向错误的片段因酶切位点改变无法酶切出小带。进一步用PCR鉴定，得到含FPIL-6 cDNA和FPIL-4cDNA片段的重组质粒，命名为pGFPIL-6/IL-4。
3、融合猪白细胞介素-4、6基因的真核表达质粒的构建猪白细胞介素-46融合基因和真核表达载体VR1020双酶切，连接转化，筛选和酶切鉴定重组子。结果见附图8。重组子质粒PCR和酶切结果显示，所构建的重组子已成功插入了融合IL-4、6基因，将融合IL-4、6基因的重组真核表达质粒命名为VRIL46。
4、IL-2基因的DNA改组将克隆得到的猪、牦牛、小鼠和人IL2基因进行DNA酶切，分离回收50-100bp的核苷酸片断；经无引物和有引物两步PCR重新扩增IL2基因，分离纯化获得改组的IL2基因；改组PCR后的片段进行2.0％琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶小分子DNA抽提试剂盒回收500bp的改组片段。然后将此DNA片段用BamHI/EcoRI进行酶切，与脱脱磷酸化、BamHI/EcoRI双酶切的pGEX 4T-1载体在T4DNA连接酶作用下16℃水浴过夜。连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，构建重组质粒，酶切鉴定阳性克隆基因。
结果见说明书附图9、10。图9显示DNaseI消化后获得的50-100bp左右的随机片段，经55个循环的无引物PCR后，这些小片段拼接为许多大小不一的改组分子，经电泳检测为主要集中在100-250bp左右的模糊条带(第二泳道)，是PCR重组配对的结果。无引物PCR的产物再经过30个循环的有引物PCR，与原模板大小相同的IL-2改组分子(约500bp)被富集(第三泳道)，电泳结果显示在500bp处出现一特异条带。图10显示将初步筛选的阳性菌落，接种于3ml含Amp的LB培养液中，37℃震荡过夜，用碱裂解法提取出所有菌落的质粒，然后用BamHI/EcoRI进行酶切，发现大部分切出小片段，大小约500bp左右。
5、改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒的构建改组的IL-2基因亚克隆到VR1020载体，PCR反应和酶切反应鉴定重组子，构建改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒，命名为VRIL2S。结果见附图11。重组子VRIL2S的质粒PCR的结果显示，所构建的重组子已成功插入了改组的IL-2基因。
6、纳米颗粒的制备以分子量150000，脱乙酰度95％以上的壳聚糖分散在1％醋酸溶液中(A液)；分别将VR1020、VRIL2S+VRIL46质粒溶解于三聚磷酸盐溶液(B液)。将A液、B液置于50℃水浴分别恒温20min，将DNA溶液按一定比例(氨基摩尔数与DNA的磷酸酯基摩尔数比)加入壳聚糖溶液，磁力搅拌使其充分混合，静置过滤得到粒径40-60nm的复合物微粒。即是各质粒壳聚糖纳米颗粒样品液。
7、实验动物的免疫选择3周龄小猪20只，随机分为2组，每组10只。采用肌肉注射法，每头质粒剂量0.5mg/头。所有猪按该养猪场常规免疫程序接种疫苗1周龄免疫接种蓝耳病疫苗；2周龄免疫接种伪狂犬疫苗。3周龄在免疫注射基因制剂时同时免疫接种猪瘟疫苗。
动物免疫分组见表1。
表1 免疫猪分组
注CNP壳聚糖纳米颗粒8、壳聚糖纳米颗粒包装VR1C+VR6C质粒组合对猪特异性免疫应答的影响猪自免疫后第0，1，2，4，6，8周前腔静脉采血，分离血清，用以检测各项免疫指标。
(1)IgG、IgA及IgM的测定含量实验猪血清分别作105(IgG)和104(IgM、IgA)稀释包被Costar酶标板，用特异性的兔抗猪IgG、IgM和IgA重链抗体(美国Bethyl公司生产)作一抗，酶标羊抗兔IgG为二抗(华美生物工程公司)，TMB(四甲基联苯胺)为底物，测定猪血清中IgG、IgM和IgA含量。
结果见说明书附图12、13、14。由图可见，猪在肌注壳聚糖纳米颗粒包装猪白细胞介素4、6融合基因真核表达质粒VRIL46和改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒VRIL2S组合后，其血清中IgG、IgA、IgM含量比对照组有显著增高；与对照组差异显著(P＜0.05)。
(2)特异性抗体的测定间接ELISA法。用猪瘟抗原、猪蓝耳病抗原包被Costar酶标板，实验猪血清100倍稀释为一抗，TMB(四甲基联苯胺)为底物，测定猪血清中猪瘟、猪蓝耳病特异性抗体含量。
结果见说明书附图15、16。图15、16显示了猪瘟疫苗、猪蓝耳病疫苗与VRIL46+VRIL2S质粒组合联合免疫动物后猪只特异性抗体变化情况。结果显示动物在免疫一周后，就检测到猪瘟、猪蓝耳病特异性抗体的产生；在同时免疫VRIL46+VRIL2S质粒组合后，实验猪只的上述特异性抗体比对照组显著提高(P＜0.05)。
(3)细胞因子的检测实验猪血清100倍稀释包被Costar酶标板，兔抗猪IL2、IL4、IL6 IgG抗体(武汉博士德生物工程公司提供)为一抗，TMB(四甲基联苯胺)为底物，SABC法检测血清中IL2、IL4及IL6含量，观测猪细胞免疫应答情况。
结果见说明书附图17、18、19。图结果显示壳聚糖纳米颗粒包装猪白细胞介素4、6融合基因真核表达质粒VRIL46和改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒VRIL2S组合与猪瘟疫苗、猪蓝耳病疫苗联合免疫猪后，猪只血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量较对照组高，对免疫猪血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量的提升作用差异显著(P＞0.05)。
(4)免疫猪外周血免疫细胞数量的动态变化常规法血球自动计数仪分类计数中性粒细胞、单核细胞核、淋巴细胞。
结果见说明书附图20、21、22、23。用猪瘟疫苗、猪蓝耳病疫苗联合壳聚糖纳米颗粒包裹VRIL46+VRIL2S质粒组合免疫猪，猪外周血免疫细胞数量的变化结果发现肌肉注射壳聚糖纳米颗粒包装VRIL46+VRIL2S质粒组合对猪只外周血免疫细胞有较好的提升能力，免疫组的白细胞、中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞比对照组显著增高。
8、数据分析上述各种数据均用方差分析进行差异显著性比较，以P＜0.05为差异显著性标准。
权利要求
1.复合猪白细胞介素基因抗感染纳米分子制剂的制备和应用，其特点包括猪白细胞介素-4、6基因的融合、融合猪白细胞介素-4、6基因真核表达质粒VRIL46的构建，白细胞介素-2基因的改组、改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒VRIL2-S的构建，壳聚糖纳米颗粒对VRIL46+VRIL2-S质粒组合进行分子包装制备纳米分子制剂，并将此纳米分子制剂应用于增强猪机体免疫应答及抗感染免疫力的应用技术。
2.根据权利要求1所述的复合猪白细胞介素基因抗感染纳米分子制剂的制备，其特征在于所述的纳米分子制剂的基质是构建的融合猪白细胞介素-4、6基因真核表达质粒VRIL46和改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒VRIL2-S质粒组合。
3.根据权利要求1所述的复合猪白细胞介素基因抗感染纳米分子制剂的制备，其特征在于所述的纳米分子制剂的包裹材料是分子量为150000，脱乙酰度95％以上的壳聚糖，用离子交联法制备壳聚糖纳米颗粒分子。
4.使用权利要求1要求的壳聚糖纳米颗粒包装融合猪白细胞介素-4、6基因真核表达质粒VRIL46和改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒VRIL2S质粒组合作为猪新型抗感染纳米分子制剂的应用，其特征在于以制备的壳聚糖纳米颗粒包装融合猪白细胞介素-4、6基因与改组猪白细胞介素2基因抗感染纳米分子制剂联合疫苗(猪瘟疫苗、猪蓝耳病疫苗)免疫猪，以壳聚糖纳米颗粒包装VR1020空质粒为对照，检测了壳聚糖包装VRIL46+VRIL2S质粒组合对猪的体液免疫(IgG、IgA及IgM的含量、特异性抗体的测定)和细胞免疫水平(细胞因子和外周血免疫细胞数量)的影响情况，结果表明壳聚糖酸纳米颗粒包裹融合猪白细胞介素-4、6基因真核表达质粒VRIL46和改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒VRIL2S质粒组合可显著提升猪对疫苗的细胞免疫和体液免疫应答反应，增强免疫保护力。
全文摘要
本发明融合猪白细胞介素－4、6基因，构建了融合猪白细胞介素－4、6基因真核表达质粒VRIL46，改组白细胞介素－2基因，构建了改组猪白细胞介素2基因真核表达质粒VRIL2－S，以分子量为150000、脱乙酰度95％以上的壳聚糖制备了壳聚糖纳米颗粒，提供了利用壳聚糖纳米颗粒对VRIL46+VRIL2－S质粒组合进行分子包装制备纳米分子制剂的方法，公开了该纳米分子制剂作为新型抗感染分子免疫增强剂的应用技术。该方法包括壳聚糖纳米颗粒包装VRIL46+VRIL2－S质粒组合，将此制备纳米分子制剂以肌肉注射方式协同疫苗免疫猪，增强猪特异细胞和体液免疫机能，提供了壳聚糖纳米颗粒包装VRIL46+VRIL2－S质粒组合作为新型复合猪白细胞介素基因抗感染纳米分子制剂的应用技术。
文档编号A61P37/00GK1954885SQ20051002195
公开日2007年5月2日 申请日期2005年10月28日 优先权日2005年10月28日
发明者高荣, 武梅, 吕学斌, 李江凌, 王泽州, 李惠, 王颖玉, 谢曌, 赵钟钟 申请人:四川大学