专利名称：具有粘孢子虫孢子壁降解能力的几丁质酶及其编码基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有粘孢子虫孢子壁降解能力的几丁质酶及其编码基因。
背景技术：
粘孢子虫(Myxosporidia)，粘孢子虫纲的通称，是变温动物体内常见的原生动物类寄生虫，种类很多，现在报道的有近千种，除极少数寄生于两栖动物、爬行类动物体内外，其中绝大多数是专性鱼类寄生虫，寄生在鱼类体内外组织或腔隙器官中。粘孢子虫的寄生引起的粘孢子虫病给水产养殖业造成了巨大的经济损失(章晋勇，吴英松，鲁义善，汪建国.鱼类微孢子虫的研究进展.水生生物学报.2004，5545-568)。
粘孢子虫种类繁多，几乎每年都有新种发现，其中每一种都会对它的寄主鱼类产生不同程度的影响，因此粘孢子虫病对渔业生产的危害极大。在粘孢子虫病防治方面，由于粘孢子虫的成熟孢子外有一层几丁质壳瓣，具有强耐药力，至今也未筛选出一种低廉、安全、高效的药物，使粘孢子虫病的防治成为一个难题。目前对于粘孢子虫病的防治，主要存在两种意见一是以免疫预防为主，这种方法有一定效果，但由于粘孢子虫抗原成分复杂且抗原性弱，较难制成高效的疫苗；另一种意见认为以药物防治为主是比较好的防治方法，但因为很难找到对粘孢子虫孢子具有专一性杀伤作用的药物，而且药物防治对水环境副作用大，不利于水产养殖的可持续发展。我们注意到有研究证明粘孢子虫孢子的壳瓣由几丁质构成(Julius Luke，PetrVolf，Jiri Lom.Detection of chitin in spores of Myxobolus muelleri and M.subepitheliMis(Myxosporea，Myxozoa).Parasitol Res.1993.79439-440)由于几丁质的稳定性使其具有很强的耐药性，因此拟从几丁质降解酶入手寻找鱼类粘孢子虫防治的新途径。
几丁质酶(Chitinase)广泛存在于病毒、细菌、真菌、昆虫、高等植物和动物中(ParkJ.K.，Morita K.，Fukumoto I.，Yamasaki Y.，Nakagawa T.，Kawamukai M.，MatsudaH.Purification and characterization of the Chitinase(ChiA)fromEnterobacter sp.G-1.Biosci Biotechnol Biochem，1997，61684-689)。并且发挥着不同的作用。目前，几丁质酶作为几丁质降解的主要生物酶，已经进行了大量的研究，并建立了完整的酶学研究方法，但尚未见到将其应用于粘孢子虫几丁质壳瓣降解的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有粘孢子虫孢子壁降解能力的几丁质酶及其编码基因。由于粘孢子虫的主要抗药能力集中在其几丁质壳瓣上，因此本试验的目的是从这一环境中分离得到具有降解其壳瓣能力的微生物，并对相关的几丁质酶基因进行克隆、表达和性质研究，以期找到粘孢子虫病防治的新思路。
本发明所提供的几丁质酶，来源于气单胞菌(Aeromonas sp.)，名称为ChiCD3，是如下(a)或(b)的蛋白质 (a)由序列表中SEQ ID №2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
(b)将SEQ ID №2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与几丁质酶相关的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。
序列表中的SEQ ID №2由1017个氨基酸残基组成。
所述一个或数几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
为了使(a)中的ChiCD3便于纯化，可在由序列表中SEQ ID №2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列 上述(b)中的ChiCD3的编码基因可通过将序列表中SEQ ID №1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
所述几丁质酶(ChiCD3)的编码基因也属于本发明的保护范围。
所述几丁质酶(ChiCD3)的编码基因为如下1)或2)或3)的DNA分子 1)序列表中SEQ ID №1所示的DNA分子； 2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述几丁质酶的DNA分子； 3)与序列表中SEQ ID №2的核苷酸序列具有80％以上的同源性的且编码蛋白具有与几丁质酶相关功能的核苷酸序列。
序列表中的SEQ ID №2由3685个核苷酸组成。自SEQ ID №2的5′端第325-3378位核苷酸为编码序列。
所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。
含有所述几丁质酶的编码基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
本发明还提供一种含有上述基因的可降解粘孢子虫孢子壁的菌株，即气单胞菌(Aeromonas sp.)CD3 CGMCC NO.3169。该气单胞菌(Aeromonas sp.)CD3，已于2009年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC №.3169。
实验证明，本发明的几丁质酶具有降解几丁质的活性，并且可以破坏粘孢子虫孢子壁，因此，本发明的几丁质酶及其编码基因可以用于防治粘孢子虫病，特别是鱼类的粘孢子虫病。
图1为菌株分离筛选结果；A为未与细菌共培养的完整粘孢子虫孢子；B为CD3菌株对粘孢子虫孢子降解情况，比例尺＝2μm。
图2为TAIL-PCR引物设计图示 图3为chiCD3基因全长PCR扩增产物的电泳分析 图4为Smart预测几丁质酶蛋白质保守结构域 图5为大肠杆菌表达载体pET30a(+)/chiCD3的构建过程示意图 图6为DNS法葡萄糖浓度标准曲线 图7为本发明的几丁质酶ChiCD3的最适反应pH测定结果 图8为本发明的几丁质酶ChiCD3的最适反应温度测定结果 图9为BL21-pET30a(+)/chiCD3表达ChiCD3的SDS-PAGE分析 图10为粘孢子虫基因组DNA琼脂糖凝胶电泳 图11为粘孢子虫18S rDNA片段电泳图 图12为本发明的几丁质酶对粘孢子虫的作用检测结果
具体实施例方式 下面结合具体实例对本发明做详细说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、粘孢子虫孢子壁降解能力的几丁质酶及其编码基因的获得 一、产几丁质酶菌株的筛选及几丁质酶基因片段的克隆 1、实验材料 1)材料 DNA分子量Marker购自天根生化科技(北京)有限公司。
几丁质酶底物几丁质为Sigma公司产品。酵母提取物和蛋白胨购自Oxford公司。其余化学试剂均为国产分析纯。
2)溶液 (1)PBS缓冲液NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L，pH 7.2。
(2)50×TAE242g Tris碱，57.1mL冰乙酸，100mL EDTA(0.5mol/L，pH 8.0)，用去离子水溶解并定容至1000mL。
(3)溶菌酶混合液2mg/mL溶菌酶，50μg/mL RNaseA，0.3mol/L蔗糖，25mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，25mmol/L EDTA(pH 8.0)。
(4)裂解缓冲液100mm Tris-HCl，100mm Na2EDTA，1.5M NaCl，10g/L CTAB，20g/L SDS，pH 8.0。
3)培养基 (1)LB培养基蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，自然pH(固体培养基含1.8％琼脂)。
(2)胶体几丁质培养基NaNO3 1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 3g/L，琼脂18g/L，FeSO4·7H2O 0.15g/L，胶体几丁质2g/L，pH 7.0。
(3)几丁质酶产生菌筛选培养基NaNO3 1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 3g/L，FeSO4·7H2O 0.15g/L，胶体几丁质2g/L，pH 7.0。
(4)培养基离子溶液NaNO3 1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 3g/L，FeSO4·7H2O0.15g/L，pH 7.0。
以上培养基按比例配制溶解后，121℃高压湿热灭菌20min。
2、实验方法和结果 1)几丁质酶产生菌株的分离 (1)几丁质酶产生菌株的筛选 称取池塘底泥样1g，加入100ml PBS缓冲液，即成10-2菌液；制成10-2～10-7各种稀释度的溶液，选取10-5、10-6、10-7的3个浓度各100μL分别涂布在几丁质酶产生菌筛选培养基上，28℃下培养48h。挑取单菌落再划线分离纯菌。将得到的单菌株接入LB培养基，37℃过夜培养。菌种采用500μL菌液和500μL 40％甘油混合，-70℃保藏。
(2)对粘孢子虫孢子有降解作用菌株的筛选 将收集到粘孢子虫孢子(采自天津淡水鲤鱼鳃丝的孢囊，并按照实施例二中的步骤二的步骤2所示方法鉴定，鲁义善，聂品.淡水鱼类粘孢子虫的18S rDNA分子系统学研究.水生生物学报，2004，654-591，中国农业科学院饲料研究所)用70％乙醇反复冲洗，用灭菌水重悬后加入到灭菌的培养基离子溶液中，作为细菌生长的唯一碳源；再向培养基中接入步骤(1)筛选得到的几丁质酶产生菌，20℃，220r/min摇床培养3d得到诱导培养液。
吸取菌液进行光镜检测，观察细菌对粘孢子虫孢子降解情况。将诱导培养液8,000r/min离心5min，上清液直接测定几丁质酶活力；菌体用20mmol/LTris-HCl(pH 8.0)重悬，然后用超声波破碎仪(4℃，每次超声4sec，共20次)进行裂解，裂解液测定几丁质酶活力。几丁质酶活力测定方法如下所述 底物制备胶体几丁质的制备在4℃下，将几丁质(SIGMA公司生产，分析纯)10g放入研钵中，加丙酮40mL研磨10min；边研磨边缓缓加入冷浓HCl 400mL，充分研磨，使呈糊状.于4℃放置24h，之后用玻璃棉过滤，将滤液缓缓加入到盛有2,000ml体积分数50％乙醇的烧杯中，边加边剧烈搅拌，然后静置，待胶态几丁质析出后去除清液，收集胶态几丁质；用蒸馏水冲洗胶态几丁质至pH 7.0，以蒸馏水定容至1,000ml得到10g/L的胶体几丁质，冷藏备用。
几丁质酶酶活力单位定义在上述酶反应体系中，酶活以每小时分解胶体几丁质释放出1μg的还原糖定义为一个酶活力单位(U)。反应产物中还原糖的浓度对照下述标准曲线(图6)确定。
标准曲线的绘制 将0.01g的分析纯葡萄糖准确配制成100μg/mL，用此再稀释成6种质量浓度0，20，40，60，80，100μg/mL。然后取几支干净的试管，分别加入6种不同质量浓度的葡萄糖溶液1mL，加入1mL DNS溶液，置于100℃水浴10min，冷却至室温，以蒸馏水为空白对照，在540nm处测吸光度，以吸光度的减少量(各浓度吸光度与0浓度的吸光度之差)为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线，图6。
DNS法(Berger I.R.，Reynolds D.M.The chitinase system of a strain ofstreptomyces griseus.Biochim Biophys Acta，1958，29522-534)测定培养液和菌体中的几丁质酶活力采用DNS比色法测还原糖。取4支试管，分别加入0.5mL酶液(诱导培养液上清液和菌体裂解液)和0.5mL上述制备的1％几丁质胶体，其中三支试管于40℃水浴60min(实验样品)，另外一支于4℃放置(作为对照)；水浴2h后，在样品和对照中均加入1.5mL DNS，沸水浴10min，离心取上清液在540nm测定其OD值。根据标准曲线的结果，得出其酶活单位计算公式 酶活(y)＝(454.3x+1.4508)×50×N/2 x540nm处的光吸收。
N酶液稀释倍数。
50将20uL酶液中的酶活折算为1mL的酶活性。
2反应2h。
凡是能够在培养液或菌体破碎液中能够测到几丁质酶活力的菌株即确认为产几丁质酶菌。同时能够在诱导培养基中生长的菌株也具有侵蚀、利用粘孢子虫孢子几丁质壳瓣生长的潜力。光镜检测细菌对粘孢子虫降解情况(部分结果如图1所示)。步骤1)中几丁质酶产生菌株的筛选平板共分离到4株菌CD1、CD2、CD3、CD4。按照上述步骤2)的方法以粘孢子虫孢子做唯一碳源，对四株菌进行诱导培养。按照上述DNS法测定几丁质酶活结果如表2所示，四株菌中CD3号几丁质酶活性最高。
表2.产几丁质酶微生物16S rDNA基因序列BLAST比对分析结果及几丁质酶产酶情况 2)几丁质酶产生菌株的种属鉴定 采用溶菌酶裂解法提取了产几丁质酶细菌CD1、CD2、CD3和CD4的基因组DNA，并以其为模板PCR扩增16S rDNA序列。细菌16S rDNA扩增选用16S rDNA通用引物27F和1492R，以分离菌株的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。
27F5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 1492R5’-TACCTTGTTACGACTT-3’ 反应体系 10×PCR buffer 5μL； dNTP mixture(2.5mmol/L each) 4μL； Taq酶(5U/μL)0.5μL； 27F(20μmol/L) 1μL； 1492R(20μmol/L) 1μL； 基因组DNA(30ng/uL)1μL； ddH2O 37.5μL； 总体积50μL。
PCR反应参数为 95℃5min；94℃30sec，60℃30sec，72℃1min 30sec，25个循环；72℃延伸5min。
PCR产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出的16S rDNA片段为1,500bp左右； 扩增得到的16S rDNA的PCR产物由北京擎科生物技术有限公司进行测序。测序引物为16S rDNA扩增用引物。测序得到的rDNA序列与NCBI GenBank数据库中的序列进行BLAST比对分析，根据比对结果相似性鉴定rDNA序列所对应菌种的种属关系。比对结果如表2所示，结果将4株菌分别归类于4个属，包括Enterobacter sp.(肠杆菌属)，Acinetobacter sp.(不动杆菌属)，Aeromonas sp.(气单胞菌属)，Pseudomonas sp.(假单胞菌属)。其中CD3属于Aeromonas sp.(气单胞菌属)，将其命名为气单胞菌(Aeromonas sp.)CD3。该气单胞菌(Aeromonas sp.)CD3，已于2009年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC №.3169。气单胞菌(Aeromonassp.)CD3 16S rDNA序列如序列表中序列3所示。
3)几丁质酶基因片段的克隆 简并引物的设计简并引物的设计主要参考CODEHAP primer引物设计的原理。其设计的基本原理大体上是5’端保守3’端简并(Rose T.M.，Schultz E.R.，Henikoff J.G.，Pietrokovski S.，McCallum C.M.，Henikoff S.Consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers for amplification ofdistantly related sequences.Nucleic Acids Res.1998，261628-1635)。对糖苷水解酶第18家族微生物来源的几丁质酶蛋白序列进行分析。利用找到的一对保守区域的氨基酸序列，根据上述原理和密码子的简并性设计简并引物GH18F和GH18R。其序列如下 GH18F5’-GGIGG ITGGA CIYTI WSICC-3’ (I表示次黄嘌呤，Y表示C或T，W表示A或T，S表示C或G) GH18R5’-ATGCA ITAYG AYTTY CAYGG-3’ (I表示次黄嘌呤，Y表示C或T) 以Aeromonas sp.CD3菌的DNA做为模板，用GH18F和GH18R引物进行PCR扩增。其中，PCR反应体系为10×PCR buffer 5μL，dNTP mix(2.5mmol/L each) 4μL，Taq酶(5U/μL) 0.5μL，GH18F(100μmol/L) 2μL，GH18R(100μmol/L) 2μL，基因组DNA(30ng/μL)1μL，ddH2O 35.5μL，总体积 50μL。
PCR反应参数为94℃5min；94℃30sec，55℃30sec(每个循环后复性温度下降1.0℃)，72℃30sec，5个循环；然后94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，30个循环；72℃5min。
PCR产物连接T载体测序，得到405bp片段，得到的序列与NCBI GenBank数据库中的序列进行BLASTx比对分析，比对结果证明扩增得到的为几丁质酶基因片段。自序列表中序列1的第1556到第1961位核苷酸。
二、几丁质酶基因(chiCD3)全长的克隆及其分析 1、实验材料 1)菌株，载体，工具酶，试剂 DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒和DNA纯化试剂盒为TakaRa公司产品；实验所用的DNA聚合酶购自TakaRa公司；各种限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自NEB公司。DNA分子量Marker购自天根生化科技(北京)有限公司。
几丁质酶底物几丁质为Sigma公司产品。酵母提取物和蛋白胨购自Oxford公司。其余化学试剂均为国产分析纯。
2、几丁质酶基因全长的克隆 1)使用TAIL-PCR技术扩增几丁质酶基因侧翼序列 根据步骤一所获得的气单胞菌(Aeromonas sp.)CD3的基因片段DNA序列，分别设计三条特异性引物设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，长度一般22-40nt，退火温度在60-65℃。并将它们分别命名为CD3usp1，CD3usp2，CD3usp3(上游特异性引物)，CD3dsp1，CD3dsp2，CD3dsp3(下游特异性引物)(表3)。引物由上海生工生物工程有限公司和北京英骏生物技术有限公司合成。
表3.所用引物序列 (表中，I表示次黄嘌呤，Y表示C或T，W表示A或T，S表示C或G，N表示A、T、C或G) 以已经扩增到的chiCD3基因片段为基础，设计特异性sp引物(表3)，以基因组DNA为模板，使用TAIL-PCR方法克隆几丁质酶基因全长。引物设计图示见图2； 以CD3基因组DNA为模板，每条sp引物(CD3usp1、CD3usp2、CD3usp3)分别与11条AD引物(表3中所示的AD1-AD11)两两配对，进行三轮嵌套PCR反应。
第一轮TAIL-PCR扩增 反应体系 2×GC PCR buffer10μL dNTP mix(2.5mmol/L each)1.6μL TakaRa LA Taq酶(2.5U/μL) 0.2μL CD3uSp1(20μmol/L) 0.5μL AD引物(100μmol/L) 1.0μL 基因组DNA(30ng/μL) 1.0μL ddH2O 5.7μL 总体积 20μL PCR反应程序为先95℃2min，进行1个循环；再94℃30sec，60℃30sec，72℃2min，进行5个循环；再94℃30sec，30℃3min，(0.2℃/sec)，72℃2min，进行1个循环；再94℃30sec，44℃30sec，72℃2min，进行5个循环；再94℃30sec，60℃30sec，72℃2min，94℃30sec，60℃30sec，72℃2min，94℃30sec，44℃30sec，72℃2min，进行12个循环；最后72℃5min，进行1个循环。
第二轮TAIL-PCR扩增 将第一轮TAIL-PCR的产物稀释100倍后作为第二轮TAIL-PCR的模板。
反应体系2×GC PCR buffer 10μLdNTP mix(2.5mmol/L each) 1.6μLTakaRa LA Taq(2.5U/μL)0.2μLCD3usp2(20μmol/L) 0.5μLAD引物(100μmol/L) 1.0μL第一轮TAIL-PCR产物稀释100倍1.0μLddH2O 5.7μL 总体积 20μL PCR反应程序为先95℃2min，进行1个循环；再94℃30sec，60℃30sec，72℃2min，94℃30sec，60℃30sec，72℃2min，94℃30sec，44℃30sec，72℃2min，进行12个循环；最后72℃5min，进行1个循环。
第三轮TAIL-PCR扩增 将第二轮TAIL-PCR的产物稀释100倍后作为第三轮TAIL-PCR的模板。
反应体系 2×GC PCR buffer 25μL dNTP mix(2.5mmol/L each) 4μL TakaRa LA Taq酶(2.5U/μL) 0.4μL CD3usp3(20μmol/L) 1μL AD引物(100μmol/L) 2μL 第二轮TAIL-PCR产物稀释100倍1μL ddH2O 16.6μL 总体积 50μL PCR反应程序为先95℃2min，进行1个循环；再94℃30sec，57℃30sec，72℃2min，94℃30sec，57℃30sec，72℃2min，94℃30sec，44℃30sec，72℃2min，进行12个循环；最后72℃5min，进行1个循环。
三轮TAIL-PCR全部扩增完成后，第二、三轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析(每条AD引物对应的第二，第三轮的产物并排点样)。电泳缓冲液为1×TAE，电压1-5V/cm，时间约30min。EB染色，紫外灯下观察。
结果表明，使用TAIL-PCR技术从气单胞菌(Aeromonas sp.)CD3中克隆几丁质酶基因片段chiCD3的侧翼序列(图2)。
2)几丁质酶基因序列的分析 将步骤1)获得的侧翼序列与几丁质酶基因片段拼接，最终得到共3,685个碱基，使用NCBI提供的BLAST工具和ORF finding工具进行分析，结果显示扩增得到的序列中包括上游324bp、下游307bp的序列以及一个完整的几丁质酶基因开放阅读框，命名为chiCD3。基因全长约为3,054bp。
经菌液PCR鉴定含有外源片段的重组质粒由北京三博远志生物技术有限公司进行测序，测序引物为T载体通用M13F和M13R引物。测序得到的序列与同源克隆得到的几丁质酶基因片段序列采用VectorNTI suite7软件包的Contigexpress程序进行序列装配。装配后的序列通过BLAST工具与GenBank中已有几丁质酶序列进行比对，同时使用NCBI网站提供的ORF finder预测可能的几丁质酶基因完整ORF。结合BLAST和ORF finder的结果确认几丁质酶基因全长序列。
结果表明，从几丁质酶微生物中克隆到一个几丁质酶基因chiCD3，基因全长为3,054bp，其序列如序列表中序列1所示，自序列1的第325-3378位核苷酸为编码序列，编码1,017个残基(序列如序列表中序列2所示)和一个终止密码子。通过BLASTx比对，与该蛋白序列一致性最高的有功能验证的蛋白序列是来源于Pseudoalteromonas sp.S9的几丁质酶，一致性为45％。
3)几丁质酶氨基酸序列的分析 应用在线的smart软件进行氨基酸的序列分析，推导出的前体蛋白质包含有四个保守的功能域。Glyco_18为糖苷水解酶第18家族的催化结构域(318-766残基)，其e值为7.46e-108；ChtBD3为两个底物结合结构域(37-88残基；972-1014残基)e值分别为2.80e-08和2.98e-03；PfamChiC为一个几丁质酶C催化结构域(775-951残基)e值为2.40e-67。
应用在线软件SignalP 3.0 Server进行信号肤序列分析。Neuralnetworks(NN)法分析表明最有可能的裂解点位于第33和第34个氨基酸之间；HiddcnMarkovmodels(HMM)法分析，分析表明具有信号肽的可能性为0.754，最有可能的成熟加工剪切位点在第33和第34个氨基酸之间，其概率为0.998。两种分析方法的结果一致。综上所述，几丁质酶ChiCD3具有一长33氨基酸的信号肽，属于分泌型蛋白。
应用VectorNTI suite7软件翻译氨基酸序列并预测蛋白分子量和等电点。结果表明该基因所编码成熟蛋白的理论分子量为110kD，预测等电点为5.5。
实施例2、本发明的几丁质酶及其编码基因的粘孢子虫孢子壁降解能力的功能验证 一、几丁质酶基因ChiCD3在大肠杆菌中的表达 1实验材料 1)菌株，载体，工具酶，试剂 大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司。pET-30a(+)载体为Novagen公司产品。
DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒和DNA纯化试剂盒为TakaRa公司产品，实验所用的Taq DNA聚合酶购自TakaRa公司，各种限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自NEB公司，DNA分子量标准购自天根生化科技(北京)有限公司。
底物几丁质为Sigma公司产品，蛋白低分子量标准购自中国科学院上海生化研究所，丙烯酰胺和N，N’-甲叉双丙烯酰胺购自Sigma公司，酵母提取物和蛋白胨购自Oxford公司，其余化学试剂为国产分析纯试剂。
2)引物合成 引物由上海生工生物工程有限公司和北京英骏生物技术有限公司合成。
3)溶液 (2)5×蛋白上样缓冲液100mmol/L Tris-HCl(pH 6.8)，200mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，40g/L SDS，2g/L溴酚蓝，100g/L甘油。
(3)30％丙烯酰胺溶液29g丙烯酰胺，1g N，N′-亚甲叉丙烯酰胺，加去离子水定容至100mL。
(4)考马斯亮蓝染液0.24g考马斯亮蓝R250溶于90mL甲醇∶水(1∶1，v/v)，再加入10mL冰乙酸。
(5)乙酸钠溶液配制3mol/L乙酸钠，用冰乙酸调节pH为5.2。
4)培养基 LB培养基蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，自然pH(固体培养基含1.8％琼脂)。
2、大肠杆菌表达载体及其重组菌的构建 大肠杆菌表达载体pET30a(+)/chiCD3的构建过程示意图如图5所示，具体方法如下所示 1)chiCD3基因全长的扩增 根据已克隆的chiCD3几丁质酶全基因序列设计引物pETCD3F和pETCD3R，在引物pETF的末端引入酶切位点Hind III，在引物pETR的末端引入Xho I酶切位点，以气单胞菌(Aeromonas sp.)CD3CGMCC NO.3169基因组DNA为模板，进行PCR扩增。
pETCD3F Hind III 5’CCC
GCCAGGCCGCTTATCCCGCC pETCD3R Xho I 5’CCG
TAAATAGCTACAGGCAGACTT 反应体系10×PCR buffer 5μLdNTP mix(2.5mmol/L each)4μLpfu聚合酶(5U/μL) 0.5μLpETF(10μmol/L) 1μLpETR(10μmol/L) 1μL DB5基因组DNA(30ng/μL)1μL ddH2O 37.5μL 总体积50μL PCR反应参数为94℃5min；94℃30sec，60℃30sec，72℃2.5min，32个循环；72℃10min。PCR产物使用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化并测序表明得到ChiCD3基因全长序列(序列表中序列1)。
2)大肠杆菌表达载体pET30a(+)/chiCD3的构建 将步骤1)获得的chiCD3基因用Hind III和Xho I双酶切后插入到质粒pET-30a(+)的Hind III和Xho I酶切位点之间得到重组载体，将该重组载体进行酶切和测序鉴定，将鉴定正确的含有chiCD3基因的重组载体命名为pET30a(+)/chiCD3。
3)pET30a(+)/chiCD3重组载体的转化 将pET30a(+)/chiCD3转化大肠杆菌BL21(DE3)。以培养的菌液直接作为模板进行菌液PCR鉴定引物为表达引物pETCD3F和pETCD3R，PCR反应体系如下 10×PCR buffer 2μL dNTP mix(2.5mmol/L each)1.5μL Taq酶(5U/μL) 0.2μL F primer(10μmol/L) 0.4μL R primer(10μmol/L) 0.4μL 菌液1μL ddH2O 14.5μL 总体积 20μL PCR反应参数为94℃10min；94℃30sec，60℃30sec，72℃1.5min，33个循环；72℃10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析。
然后由北京三博远志生物技术有限公司进行测序，测序引物为pET载体通用测序引物。PCR扩增和测序结果均表明重组质粒pET30a(+)/chiCD3已转化入宿主大肠杆菌BL21(DE3)。
3、重组几丁质酶在大肠杆菌中的诱导表达 (1)将含有几丁质酶重组质粒pET-30a(+)/chiCD3的大肠杆菌BL21(DE3)菌株接种于3mL含100μg/mL Kan LB培养基中，37℃，220r/min摇床培养过夜活化菌种； (2)取100μL活化菌种接种至含100μg/mL Kan的10mL LB培养基，37℃，220r/min摇床培养约2h，直至OD600为0.6左右。
(3)加入10μL 1mol/L的IPTG，20℃，220r/min摇床培养进行诱导表达48h。
4、重组几丁质酶在大肠杆菌中的检测 (1)酶活性检测 取步骤3诱导后的培养液500μL，10,000r/min离心5min。分别取上清液直接检测几丁质酶活性；离心后的菌体用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 4.0)洗一次，然后用500μL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 4.0)重悬菌体，超声波细胞破碎仪破碎细胞，每次工作时间6s，间隔15s，超声10次。超声破碎过程中样品置于冰浴保持低温。超声破碎后的液体12,000r/min离心5min，上清检测几丁质酶活性。几丁质酶活力测定方法按照实施例1中步骤一的步骤2所示DNS法进行，菌体破碎液酶活为3.45U/mL诱导培养液。
(2)最适pH值和最适温度 40℃下、在不同pH的缓冲体系(pH 2～8)中测定粗酶液的活性。重组几丁质酶最适pH值的测定结果如图7，ChiCD3的最适pH值为4，在pH 7.0时，仍有66％的酶活。
在pH 4.0条件下，分别在不同温度(20℃～70℃)测定重组几丁质酶的活性。最适温度测定结果表明，ChiCD3的最适反应温度为60℃。将最适反应温度下的酶活力定义为100％，反应温度在20℃到30℃之间时，ChiCD3的相对酶活在50％以上(图8)。
(3)SDS-PAGE分析 将上述菌体超声破碎后的上清液用丙酮浓缩10倍，此浓缩液进行SDS-PAGE分析。同时以含有pET-30a(+)空载体、经IPTG诱导的菌株和未经IPTG诱导的、含有几丁质酶重组质粒pET-30a(+)/chiCD3的大肠杆菌BL21(DE3)菌株做对照。SDS-PAGE分析表明，经IPTG诱导的含有重组质粒pET-30a(+)-chiCD3的大肠杆菌BL21在约110kD的位置有一条明显的蛋白带(图9，泳道1，箭头示)，而作为对照的两菌株在此处无蛋白带(图9，泳道2、3)。说明几丁质酶基因在大肠杆菌中得到表达，几丁质酶理论分子量为110kD，表达蛋白的分子量与理论分子量相符。
二、本发明的几丁质酶ChiCD3对粘孢子虫的作用 1、实验材料 粘孢子虫孢子采自天津淡水鲤鱼鳃丝的粘孢子虫孢囊；吴英松，汪建国.圆形碘泡虫和关桥碘泡虫孢子的光镜及扫描电镜观察.水生生物学报，2003，27264-268；中国农业科学院饲料研究所。
裂解缓冲液500mm NaCl、50mm Tris-HCl、pH 8.0、50mm EDTA、4％SDS，灭菌121℃、20min。
2、本发明几丁质酶对粘孢子虫孢子的作用检测 1)粘孢子虫基因组DNA的提取 总DNA提取方法参照文献(Zhongtang Yu and Mark Morrison.Improvedextraction of PCR-quality community DNA from digesta and fecal samples.BioTechniques，2004，36808-812)，在无菌操作台称取约0.25g粘孢子虫孢子样品置于2mL裂解管，加入1mL裂解缓冲液，再加入0.3g直径0.1mm和0.1g直径0.5mm氧化锆珠；珠磨仪(Mini-BeadbeaterTM，USA)振荡3min；70℃水浴15min；4℃16,000g离心5min，将上清倒入2mL离心管中；加入300μL新鲜裂解液到裂解管中，重复以上步骤，合并两次上清。
在合并的上清中加入260μL 10M(NH4)Ac溶解产物，混匀，冰浴5min。4℃16,000g离心10min。将上清移入两个1.5mL离心管中，每个管中加等体积异丙醇沉淀，冰浴30min。4℃16,000g离心15min，吸取上清，加入70％乙醇洗DNA沉淀，真空干燥3min。最后用100μL TE(pH 8.5)溶解DNA，并合并两管中DNA。
在DNA样品中加12μL RNA酶(浓度10mg/mL)，37℃水浴15min。再加20μL蛋白酶K 70℃水浴10min。加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合液(酚、氯仿和异戊醇体积比为25∶24∶1)混匀，离心5min，将上清液转入另一只离心管中，加入1∶1的氯仿和异戊醇的混合液(氯仿和异戊醇的体积比为24∶1)抽提上清液，9,000r/min离心5min，在上清液中加入0.6倍体积异丙醇，4℃过夜沉淀，12,000r/min离心15min，弃上清液，70％冰乙醇清洗两次，无菌风吹干，用100μL TE缓冲液溶解沉淀得到总DNA。琼脂糖凝胶电泳分析所提取的基因组DNA长度大于10kb(图10)。提取的基因组DNA用于后期的18S rDNA扩增。图10中，泳道1为得到的粘孢子虫总DNA，泳道M为分子量maker。
2)粘孢子虫18s rDNA的PCR扩增和测序 粘孢子虫18S rDNA扩增选用18S rDNA通用引物myxoF和myxoR，以上述获得的粘孢子虫的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。
myxoF5′-CGCGGTAATTCCAGCTCCAGTAG-3′； myxoR5′-ACCAGGTAAGTTTTCCCGTGTTGA-3′。
反应体系 10×PCR buffer 5μL， dNTP mixture(2.5mmol/L each)4μL， Taq酶(5U/μL) 0.5μL， myxoF(20μmol/L)1μL， myxoR(20μmol/L)1μL， 基因组DNA(30ng/μL) 1μL， ddH2O 37.5μL， 总体积 50μL。
PCR反应参数为 95℃5min；94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，25个循环；72℃延伸5min。
PCR产物用(1％)琼脂糖凝胶电泳分析，电泳缓冲液为1×TAE，电压1-5V/cm，时间约30min。EB染色，紫外灯下观察。PCR产物连接pEASY-T3载体，转化大肠杆菌Top10感受态细胞，阳性克隆被挑选测序。
粘孢子虫样品18s rDNA PCR扩增产物电泳检测结果如图11所示，图11中泳道1为粘孢子虫18S rDNA片段，泳道M为分子量Marker。
18s rDNA测序结果进行BLAST分析。粘孢子虫样品18s rDNA序列与粘孢子虫纲、双壳目、碘泡虫属、单极虫、Thelohanellus hovorkai具有96％的相似性。
3)几丁质酶对粘孢子虫的作用 取诱导表达后的培养液，10,000r/min离心5min。离心后的菌体用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 7.0)重悬，超声波细胞破碎仪破碎细胞。超声破碎过程中样品置于冰浴保持低温。超声破碎后的液体12,000r/min离心5min，上清为几丁质酶粗酶液。
取500μL过滤除菌的几丁质酶粗酶液与离心收集到的粘孢子虫混合，调节pH值为7.0，20℃水浴2h。取出粘孢子虫孢子进行镜检。
结果如图12所示，结果表明粘孢子虫孢子经几丁质酶处理2h后能够检测到孢子被不同程度的侵蚀破坏(图12)，证明本试验中克隆到的几丁质酶基因chiCD3在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达产物能够侵蚀破坏粘孢子虫孢子。图12中A为未经几丁质酶作用的完整粘孢子虫孢子；B，C，D均为被本发明的几丁质酶不同程度降解的粘孢子虫孢子。比例尺＝2μm。
序列表
<160>3
<210>1
<211>3685
<212>DNA
<213>气单胞菌(Aeromonas sp.)
<400>1
ttactgatta agcagctctc tggagcttgt ggccattcgc cagcctgttc tgctgtttgc 60
caatcagcca cttcatgtta atgataattc tccttgagaa taaagattga ggggatcttg 120
tcgccttcct atactgggtt cgttcctcac agaacccagg taaagggcaa accggcagtg 180
atgtcggggc gcaatgcttc cggtctcgat cgtggatcca gatagcgggg tttccctggg 240
tgaggggtgg tttttgtggc aggtccattg ccagttgtct gcgcccatca tgcaggttgc 300
gattgttctt tgccgtggtg accaatgcca agacaaaaca aggaagataa cgatatgcaa 360
cagctcttca gacccagcag gcttgccatg ctggtcgccc ttgcggctgc gcccgcctgg 420
gcccaggccg cttatcccgc ctataaatcc ggtactgcct acaaggctgg cgatatagtc 480
agcaacgtcg gtgccctcta cgagtgcaaa gaattcccct attcaggctg gtgcggggca 540
tccccctatc actacgagcc gggggtaggc gtggtctggg cagatgcctg gaagccctat 600
ggtggcgagg tacctcctcc tgcattcggt gtggcagtca gctcaccggc tgccggtgcc 660
agctacaacg aaggagccag catggcgctg gcagtgaccc tgagcggccc ggtaacggcc 720
ttggcccggg tggaatatct tgtcgacggc acgctggccg ccacggcgag cgcctcgcca 780
tggagtgcca gctggagcgc cgccggagtg ggggcccata ccctcaaggc tcgcgcgctg 840
gataaagatg gcaaggtact gagcggggcg gattcgagct tcaacgtcgc cgccgtggtc 900
gcgcccgagg cacccaaggt gagcatcagc agcccggcca gcggcgccaa ggtgacgctg 960
ggtcgcagtg tggcggtgag cggtaacgtc accgatgcca acaacgatgt ggccaaagtc1020
gagctctatg tcgacggcaa gaaggtgggc gaagatacca ctgccccctg gcaggtgaac1080
tggacaccgg atgccaaagg cagtgccgcc ctcaagctgg tggccactga caagaccaat1140
ctgagcgacg agtcggcggc ggtgaccgtc aatgtcgagg aggccgcgct gccgcccacc1200
ggtggcaacc tctcttgtga cattcgccag gtctatcgcc cggatggcta cgagtgcatg1260
ggggatgacc atgcccgccg ggtcatcggc tacttcacct cctggcgcac cggcaagaac1320
ggcctgcccg cctatctggt gagcgatatt ccatggaaca agatcaccca catcaactac1380
gccttcgcgg cggtggatga gcagagccac accatcaagg tggacgatgc agccaccaag1440
atgacctggg atggcgtgcc gggtgccgag atggatcctg aattcgccta caagggccac1500
ttcaacctgc tgtcgaaata caagaagcag tatccggacg tgaagaccct catctcggtc1560
gggggctggg ccgatacccg cggcttctac actgccacta ccaagggtga ctgctcggtc1620
aatactgccg gtatcaacac cctggctgac tcggcagtga gctttatccg ccagtacggc1680
tttgacgggg tcgatatcga ctacgaatac cccacctcga tgaaggatgc gggcaacccc1740
aacgacttcc cgctctccaa ccagtgccgg gccaagctgt ttgccaacta cgaggtgctg1800
atgaagacct tgcgggcgcg gctcgacaac gccggtaacg aagatggtcg caagtatatg1860
ctgaccatcg cctcaccggc ctcggcctat ctgctgcgcg ggatggagaa cttccaggtc1920
acccagtacc tcgattacgt caacctgatg acctatgact tccacggtgc ctggaaccac1980
tttgtcggtc acaacgctgc cctgttcgac aacaatgccg accccgagct ctcccattgg2040
ggcgtctata cccagaccca gtttggcggt atcggttacc tcaacgcggc ctggtctgcc2100
cactacttcc gcggtgcgct ggcggctggc aagatcaacg ttggcgtgcc tatacacccg2160
cggttggcag ggtgaacgtg cagtcatggg ctgggtggca aggcagccct gccgagccag2220
aacgagtgcc agccgggcac aggtggcagc accattccgt gcggcaacgg ggcggtcggc2280
atcgacaaca tctggcatga tctcgacaag aacggcaaag agatcggcgg aggcgccgtg2340
cccatgtggc atgccaaaaa cctggagcat gcagccagcc tcggcatcac cacgctgccg2400
agttatggca ctgcctgggg tctggatccc aacaatccgg ctcacgtgat gcagggcaag2460
tatgtgcgtt actacgatga caaggcccac gcgccctggc tgtggaacga agagaagaag2520
gtgttcctct caaccgaaga tgaagagtcc atgggccaca agctcgacta catcatcaag2580
cgcggtctgg gtggcgtgat gttctgggag atggcgggtg attacgcctt cgatccggcc2640
aagaacgagt acggcatggg cagtactctg accaccctgg cttatgagaa gtttgccaag2700
gcaactctgt acaacaccaa gcaaaacgat ctggccgcgc cgagcgccca gctcgacatc2760
cagctcagcc tctccggctt caaggaaggg gactctaact atccgatcaa cccgaaactc2820
aagctggtca acaagtcgac ccagaccatt ccgggcggcg cgcgcatcga gtttctggtg2880
cccacctcaa cctctgacac catcacggat cagagtggca tgggcctgaa agtggtggag2940
agcggtggca acgacaactc ggaaggtatt gccaatgaga aggacttcca caaggtcgcc3000
atgagcctgc cgggatggca gactctggca ccgggggccg agattgaagt cgccatgacc3060
tactacctgc ccgccgctgg cgtgccgagc ggtatgcgca tcatcagcgg cagccagacc3120
attggtctca aggccgagtt cccgaccctg ccggaggccg tgctgggctc gggtggtggc3180
gagaatccgg gtaccatctg cagcagccag aacgtcaatc cggcggccta caaggcctat3240
ccgagctggc cacaggggga tcatgccaat ggcggcgatc gcattaccca taacaaggta3300
gtgtggcagg ccaactggtg gaccagcagc gagcccaagg caaccgatgg cagctggaag3360
tctgcctgta gctattgatg attttaaaat caatgagata agtgaggctt cggcctcact3420
ttttttgtct gattggtcgc tctggttgaa aatgcgcctg cctttcctgg cgggcagcct3480
ctataataga gtcgattaat aatcagatgg atatcagcgt atggcgagta tattggattc3540
cgttgatcaa cgaactcaac tggtgggtga aaaccgcctc gagttgttga tgtttcgtct3600
cggcacccgt cagatgttcg ccatcaacgt cttcaaggta cgggaagtgg tcaagttgcc3660
ccatctgagc tggatgtcga gctgg 3685
<210>2
<211>1017
<212>PRT
<213>气单胞菌(Aeromonas sp.)
<400>2
Met Pro Arg Gln Asn Lys Glu Asp Asn Asp Met Gln Gln Leu Phe Arg
1 5 10 15
Pro Ser Arg Leu Ala Met Leu Val Ala Leu Ala Ala Ala Pro Ala Trp
20 25 30
Ala Gln Ala Ala Tyr Pro Ala Tyr Lys Ser Gly Thr Ala Tyr Lys Ala
35 40 45
Gly Asp Ile Val Ser Asn Val Gly Ala Leu Tyr Glu Cys Lys Glu Phe
50 55 60
Pro Tyr Ser Gly Trp Cys Gly Ala Ser Pro Tyr His Tyr Glu Pro Gly
65 70 75 80
Val Gly Val Val Trp Ala Asp Ala Trp Lys Pro Tyr Gly Gly Glu Val
85 90 95
Pro Pro Pro Ala Phe Gly Val Ala Val Ser Ser Pro Ala Ala Gly Ala
100 105 110
Ser Tyr Asn Glu Gly Ala Ser Met Ala Leu Ala Val Thr Leu Ser Gly
115 120 125
Pro Val Thr Ala Leu Ala Arg Val Glu Tyr Leu Val Asp Gly Thr Leu
130 135 140
Ala Ala Thr Ala Ser Ala Ser Pro Trp Ser Ala Ser Trp Ser Ala Ala
145 150 155 160
Gly Val Gly Ala His Thr Leu Lys Ala Arg Ala Leu Asp Lys Asp Gly
165 170 175
Lys Val Leu Ser Gly Ala Asp Ser Ser Phe Asn Val Ala Ala Val Val
180 185 190
Ala Pro Glu Ala Pro Lys Val Ser Ile Ser Ser Pro Ala Ser Gly Ala
195 200 205
Lys Val Thr Leu Gly Arg Ser Val Ala Val Ser Gly Asn Val Thr Asp
210 215 220
Ala Asn Asn Asp Val Ala Lys Val Glu Leu Tyr Val Asp Gly Lys Lys
225 230 235 240
Val Gly Glu Asp Thr Thr Ala Pro Trp Gln Val Asn Trp Thr Pro Asp
245 250 255
Ala Lys Gly Ser Ala Ala Leu Lys Leu Val Ala Thr Asp Lys Thr Asn
260 265 270
Leu Ser Asp Glu Ser Ala Ala Val Thr Val Asn Val Glu Glu Ala Ala
275 280 285
Leu Pro Pro Thr Gly Gly Asn Leu Ser Cys Asp Ile Arg Gln Val Tyr
290 295 300
Arg Pro Asp Gly Tyr Glu Cys Met Gly Asp Asp His Ala Arg Arg Val
305 310 315 320
Ile Gly Tyr Phe Thr Ser Trp Arg Thr Gly Lys Asn Gly Leu Pro Ala
325 330 335
Tyr Leu Val Ser Asp Ile Pro Trp Asn Lys Ile Thr His Ile Asn Tyr
340 345 350
Ala Phe Ala Ala Val Asp Glu Gln Ser His Thr Ile Lys Val Asp Asp
355 360 365
Ala Ala Thr Lys Met Thr Trp Asp Gly Val Pro Gly Ala Glu Met Asp
370 375 380
Pro Glu Phe Ala Tyr Lys Gly His Phe Asn Leu Leu Ser Lys Tyr Lys
385 390 395 400
Lys Gln Tyr Pro Asp Val Lys Thr Leu Ile Ser Val Gly Gly Trp Ala
405 410 415
Asp Thr Arg Gly Phe Tyr Thr Ala Thr Thr Lys Gly Asp Cys Ser Val
420 425 430
Asn Thr Ala Gly Ile Asn Thr Leu Ala Asp Ser Ala Val Ser Phe Ile
435 440 445
Arg Gln Tyr Gly Phe Asp Gly Val Asp Ile Asp Tyr Glu Tyr Pro Thr
450 455 460
Ser Met Lys Asp Ala Gly Asn Pro Asn Asp Phe Pro Leu Ser Asn Gln
465 470 475 480
Cys Arg Ala Lys Leu Phe Ala Asn Tyr Glu Val Leu Met Lys Thr Leu
485 490 495
Arg Ala Arg Leu Asp Asn Ala Gly Asn Glu Asp Gly Arg Lys Tyr Met
500 505 510
Leu Thr Ile Ala Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Leu Leu Arg Gly Met Glu
515 520 525
Asn Phe Gln Val Thr Gln Tyr Leu Asp Tyr Val Asn Leu Met Thr Tyr
530 535 540
Asp Phe His Gly Ala Trp Asn His Phe Val Gly His Asn Ala Ala Leu
545 550 555 560
Phe Asp Asn Asn Ala Asp Pro Glu Leu Ser His Trp Gly Val Tyr Thr
565 570 575
Gln Thr Gln Phe Gly Gly Ile Gly Tyr Leu Asn Ala Ala Trp Ser Ala
580 585 590
His Tyr Phe Arg Gly Ala Leu Ala Ala Gly Lys Ile Asn Val Gly Val
595 600 605
Pro Ile His Pro Arg Leu Ala Gly Cys Thr Cys Ser His Gly Leu Gly
610 615 620
Gly Lys Ala Ala Leu Pro Ser Gln Asn Glu Cys Gln Pro Gly Thr Gly
625 630 635 640
Gly Ser Thr Ile Pro Cys Gly Asn Gly Ala Val Gly Ile Asp Asn Ile
645 650 655
Trp His Asp Leu Asp Lys Asn Gly Lys Glu Ile Gly Gly Gly Ala Val
660 665 670
Pro Met Trp His Ala Lys Asn Leu Glu His Ala Ala Ser Leu Gly Ile
675 680 685
Thr Thr Leu Pro Ser Tyr Gly Thr Ala Trp Gly Leu Asp Pro Asn Asn
690 695 700
Pro Ala His Val Met Gln Gly Lys Tyr Val Arg Tyr Tyr Asp Asp Lys
705 710 715 720
Ala His Ala Pro Trp Leu Trp Asn Glu Glu Lys Lys Val Phe Leu Ser
725 730 735
Thr Glu Asp Glu Glu Ser Met Gly His Lys Leu Asp Tyr Ile Ile Lys
740 745 750
Arg Gly Leu Gly Gly Val Met Phe Trp Glu Met Ala Gly Asp Tyr Ala
755 760 765
Phe Asp Pro Ala Lys Asn Glu Tyr Gly Met Gly Ser Thr Leu Thr Thr
770 775 780
Leu Ala Tyr Glu Lys Phe Ala Lys Ala Thr Leu Tyr Asn Thr Lys Gln
785 790 795 800
Asn Asp Leu Ala Ala Pro Ser Ala Gln Leu Asp Ile Gln Leu Ser Leu
805 810 815
Ser Gly Phe Lys Glu Gly Asp Ser Asn Tyr Pro Ile Asn Pro Lys Leu
820 825 830
Lys Leu Val Asn Lys Ser Thr Gln Thr Ile Pro Gly Gly Ala Arg Ile
835 840 845
Glu Phe Leu Val Pro Thr Ser Thr Ser Asp Thr Ile Thr Asp Gln Ser
850 855 860
Gly Met Gly Leu Lys Val Val Glu Ser Gly Gly Asn Asp Asn Ser Glu
865 870 875 880
Gly Ile Ala Asn Glu Lys Asp Phe His Lys Val Ala Met Ser Leu Pro
885 890 895
Gly Trp Gln Thr Leu Ala Pro Gly Ala Glu Ile Glu Val Ala Met Thr
900 905 910
Tyr Tyr Leu Pro Ala Ala Gly Val Pro Ser Gly Met Arg Ile Ile Ser
915 920 925
Gly Ser Gln Thr Ile Gly Leu Lys Ala Glu Phe Pro Thr Leu Pro Glu
930 935 940
Ala Val Leu Gly Ser Gly Gly Gly Glu Asn Pro Gly Thr Ile Cys Ser
945 950 955 960
Ser Gln Asn Val Asn Pro Ala Ala Tyr Lys Ala Tyr Pro Ser Trp Pro
965 970 975
Gln Gly Asp His Ala Asn Gly Gly Asp Arg Ile Thr His Asn Lys Val
980 985 990
Val Trp Gln Ala Asn Trp Trp Thr Ser Ser Glu Pro Lys Ala Thr Asp
995 10001005
Gly Ser Trp Lys Ser Ala Cys Ser Tyr
10101015
<210>3
<211>1503
<212>DNA
<213>气单胞菌(Aeromonas sp.)
<400>3
agagtttgat cctggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc 60
ggcagcggga gagtagcttg ctacttttgc cggcgagcgg cggacgggtg agtaatgcct120
ggggatctgc ccagtcgagg gggataacta ctggagacgg tagctaatac cgcatacgcc180
ctacggggga aagcagggga ccttcgggcc ttgcgcgatt ggatgaaccc aggtgggatt240
agctagttgg tgaggtaatg gctcaccaag gcgacgatcc ctagctggtc tgagaggatg300
atcagccaca ctggaactga gacacggtcc agactcctac gggaggcagc agtggggaat360
attgcacaat gggggaaacc ctgatgcagc catgccgcgt gtgtgaagaa ggccttcggg420
ttgtaaagca ctttcagcga ggaggaaagg ttggtagcta ataactgcca gctgtgacgt480
tactcgcaga agaagcaccg gctaactccg tgccagcagc cgtggtaata cggagggtgc540
aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag cgcacgcagg cggttggata agttagatgt600
gaaagccccg ggctcaacct gggaattgca tttaaaactg tccagctaga gtcttgtaga 660
ggggggtaga attccaggtg tagcggtgaa atgcgtagag atctggagga ataccggtgg 720
cgaaggcggc cccctggaca aagactgacg ctcaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag 780
gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgtcga tttggaggct gtgtccttga 840
gacgtggctt ccggagctaa cgcgttaaat cgaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt 900
aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgat 960
gcaacgcgaa gaaccttacc tggccttgac atgtctggaa tcctgcagag atgcgggagt1020
gccttcggga atcagaacac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt1080
tgggttaagt cccgcaacga gcgcaacccc tgtcctttgt tgccagcacg taatggtggg1140
aactcaaggg agactgccgg tgataaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca1200
tggcccttac ggccagggct acacacgtgc tacaatggcg cgtacagagg gctgcaagct1260
agcgatagtg agcgaatccc aaaaagcgcg tcgtagtccg gatcggagtc tgcaactcga1320
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taaccttcgg gagggcgttt accacggtgt gattcatgac tggggtgaag tcgtaacaag1500
gta 150权利要求
1、一种几丁质酶，是如下述1)或2)的蛋白质
1)氨基酸序列是序列表中的SEQ ID №.2的蛋白质；
2)将序列表中的SEQ ID №.2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有几丁质酶活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。
2、权利要求1所述的几丁质酶的编码基因。
3、根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述几丁质酶的编码基因的核苷酸序列是下述1)、2)或3)
1)序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列；
2)在严格条件下可与1)所述的DNA序列杂交的核苷酸序列。
3)与序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列具有80％以上的同源性的且编码蛋白具有与几丁质酶相同功能的核苷酸序列。
4、含有权利要求2或3所述的几丁质酶编码基因的重组表达载体。
5、含有权利要求2或3所述的几丁质酶编码基因的转基因细胞系。
6、含有权利要求2或3所述的几丁质酶编码基因的转基因重组菌。
7、权利要求1所述的几丁质酶在防治粘孢子虫病中的应用。
8、权利要求2或3所述的几丁质酶编码基因在防治粘孢子虫病中的应用。
9、气单胞菌(Aeromonas sp.)CD3 CGMCC NO.3169。
全文摘要
本发明公开了一种具有粘孢子虫孢子壁降解能力的几丁质酶及其编码基因。该几丁质酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列；2)将序列表中的SEQ ID №.2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有几丁质酶相关功能的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。实验证明，本发明的几丁质酶具有降解几丁质的活性，并且可以破坏粘孢子虫孢子壁，因此，本发明的几丁质酶及其编码基因可以用于防治粘孢子虫病，特别是鱼类的粘孢子虫病。
文档编号C12N1/00GK101603039SQ200910088808
公开日2009年12月16日 申请日期2009年7月20日 优先权日2009年7月20日
发明者周志刚, 斌 姚, 刘玉春, 何夙旭, 曹雅男, 白东清, 石鹏君, 昆 孟 申请人:中国农业科学院饲料研究所