表达细胞壁降解酶的植物生物质的联合预处理和水解的制作方法

表达细胞壁降解酶的植物生物质的联合预处理和水解的制作方法【专利摘要】本发明提供了一种对表达细胞壁降解酶的基因工程植物进行联合预处理和水解的方法。对用于制备转基因植物的表达盒和载体进行了描述。还提供了利用本发明的表达盒和载体来表达一种或多种细胞壁降解酶的基因工程改造的植物。【专利说明】表达细胞壁降解酶的植物生物质的联合预处理和水解[0001]本申请要求2011年3月7日提交的美国临时申请N0.61/449,769的优先权，该临时申请在此以全文援引的方式纳入本文。[0002]以电子方式与本申请提交的序列表以“序列表”为文件名，创建于2012年3月7日，文件大小为620，037字节，在此以全文援引的方式纳入本文。【
技术领域：
】[0003]本发明涉及从表达细胞壁降解酶的植物中生产可溶性糖的方法，以及转基因植物、表达载体，核酸以及细胞壁降解蛋白。【
背景技术：
】[0004]木质纤维素生物质是一种引人注目的用于生产生物燃料、化学物质和生物产品的原料。木质纤维素生物质可提供许多优势，包括丰富的可用性、潜在的低成本、可持续性，以及一般不作为人类的食物来源被消耗(LangeveldJffAetal.2010CropSci50:S131-S151)。为了将木质纤维素生物质转换成可再生能源和生化药剂，生物处理将一部分木质纤维素生物质转变成单糖，然后转化为生物燃料或其他生物产品。[0005]由于生物质预处理和酶水解的成本，通过生物转化来生产糖的成本是昂贵的(AlviraPetal.2010BioresourTechnollOl:4851；AbramsonMetal.2010PlantSciencel78:61；DanielKlein-Marcuschameretal.Biotechnol.Bioeng.2012；109:1083)。酶水解不容易降解植物细胞壁，因为细胞壁多糖的生物异质性、化学组成和结构特征使它们难以被水解酶水解(ZhuLetal.2008BioresourTechnol99:3817)。出于这个原因，酶水解需要能够使植物细胞壁容易水解的预处理。在工业上比较普遍的预处理技术，通常使用苛刻的条件，如高温和极端的pH值条件(WymanCEetal.2005BioresourTechnol96:1959；MosierNetal.2005BioresourTechnol96:673)。这些条件会引起糖降解并且导致产糖量减少，以及形成有毒的发酵化合物，需要昂贵的额外步骤以及昂贵的前期资本设备来进行解毒、分离和中和。[0006]预处理成本、外源酶用量的高成本、缓慢的水解速率、酶的有限供应也会影响到涉及木质纤维素生物质工艺的商业化。【
发明内容】[0007]一方面，本发明涉及一种从基因工程植物材料(engineeredplantmaterial)中生产可溶性糖的方法。该方法包括通过将基因工程植物材料与制浆制剂(pulpingformulation)混合形成混合物以进行预处理。所述基因工程植物材料包括编码第一蛋白的第一多核苷酸序列，所述第一蛋白选自由木聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、阿魏酸酯酶、经内含肽修饰的木聚糖酶、经内含肽修饰的内切葡聚糖酶、内含肽修饰的外切葡聚糖酶和内含肽修饰的阿魏酸酯酶所组成的组中。所述方法还包括提供水解条件。[0008]一方面，本发明涉及一种基因工程植物。所述基因工程植物包括编码与第一参考序列具有至少90%的同一性的氨基酸序列的第一多核苷酸序列，所述第一参考序列选自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDN0:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7,SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10和SEQIDNO:11所组成的组中。[0009]一方面，本发明涉及一种表达盒。所述表达盒包括能够在中度严格条件下与含有第一参考序列的核酸杂交的第一多核苷酸序列，所述第一参考序列选自由SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:36,SEQIDNO:37,SEQIDNO:38和SEQIDNO:39[P77853:S158-30-108-35]所组成的组中。所述表达盒还包括能够在中度严格条件下与含有第二参考序列的核酸杂交的第二多核苷酸序列，所述第二参考序列选自由SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37,SEQIDNO:38,SEQIDNO:39、SEQIDNO:40,SEQIDNO:4USEQIDNO:42和SEQID:43所组成的组中。被选定为第一参考序列的SEQIDNO不同于被选定为第二参考序列的SEQIDNO。[0010]一方面，本发明涉及一种表达盒。所述表达盒包括能够在中度严格条件下与含有参考序列的核酸杂交的多核苷酸序列，所述参考序列选自由含有SEQIDNO:52,SEQIDNO:53、SEQIDNO:54、SEQIDNO:55、SEQIDNO:56、SEQIDNO:57、SEQIDNO:58、SEQIDNO:59、SEQIDNO:60、SEQIDNO:61和SEQIDNO:62的序列所组成的组中。[0011]一方面，本发明涉及一种表达载体。所述表达载体包括能够在中度严格条件下与含有选自由SEQIDNO:68,SEQIDNO:69,SEQIDNO:70,SEQIDNO:7USEQIDNO:72、SEQIDNO:73,SEQIDNO:74、SEQIDNO:75,SEQIDNO:76,SEQIDNO:77,SEQIDNO:78、SEQIDNO:79,SEQIDNO:80,SEQIDNO:8USEQIDNO:82和SEQIDNO:83所组成的组中的序列的核酸杂交的多核苷酸序列。【专利附图】【附图说明】[0012]结合附图阅读将会更好地理解以下对本发明优选实施方式的详细说明。出于图解本发明的目的，图中显示的是目前优选的实施方式。然而，应当理解的是本发明并不局限于显示出的具体设置和方法。在附图中:[0013]图1是显示表达细胞壁降解酶的植物生物质的联合预处理和水解步骤的流程图。[0014]图2A-2B显不了使用#5复合酶(enzymecocktail)(FCt;灰色(每3个一组的柱形图的中间))或缺乏木聚糖酶A的#5复合酶(Ct-Xyn;斜条纹(右))或者不经酶(NCt；白色(左))水解后，来自预处理的表达木聚糖酶A的转基因植物(transgenicplant)(XynA.2015.05)和缺乏木聚糖酶A的转基因对照植物(XynB.2063.17)的葡萄糖(图2A)和木糖(图2B)的产量。[0015]图3A-3B显示使用#1复合酶(FCt;灰色(每3个一组的柱形图的中间))或缺乏木聚糖酶的#1复合酶(Ct-Xyn;斜条纹(右))，或者不经酶(NCt;白色(左))水解后，来自预处理的表达木聚糖酶B(XynB.2063.17)的转基因植物和预处理的野生型对照植物(AxB)的葡萄糖(图3A)和木糖(图3B)的产量。[0016]图4显示了对预处理的表达内切葡聚糖酶(EG)的转基因植物进行#1复合酶(FCt;灰色(中间))或缺乏内切葡聚糖酶的#1复合酶(Ct-EG(右))，或者不经酶(NCt；白(左))水解后的葡萄糖产量。图4A显示了从表达内切葡聚糖酶A的转基因植物(EGA.2049.02和EGA.2049.10)和缺乏内切葡聚糖酶的转基因对照植物(TGC.4000.12)中产出的葡萄糖产量。图4B显示了从表达内切葡聚糖酶B的转基因植物(EGB2042.03)和缺乏内切葡聚糖酶的转基因对照植物(TGC.2004.8.02)中产出的葡萄糖产量。[0017]图5A-?显示了表达多种蛋白的转基因植物的水解结果。图5A和图5C表示使用#1复合酶处理的从测试转基因植物和转基因对照植物中产出的葡萄糖产量，图5B和图表示使用#1复合酶处理的从测试转基因植物和转基因对照植物中产出的木糖产量。图5A和图5B显示的结果:经过全复合酶处理(FCt;深灰色(中间))、缺乏木聚糖酶的全复合酶处理(FCt-Xyn;条纹柱(右)以及不经酶(NCt;白色柱(左))的处理的I)双重叠表达木聚糖酶A(XynA)和辅酶(Acc)的转基因植物XynA/AccA/B.2096.05和XynA/AccA/B.2096.01；2)转基因对照植物TGC.2004.8.02。图5C和图显示的结果:经过全复合酶处理(FCt;深灰色(每组样品中四个的最左边))、缺乏木聚糖酶的全复合酶处理(Ct-Xyn;斜条纹(左二))，缺乏内切葡聚糖酶的全复合酶处理(Ct-EG;白色(左三))，以及缺乏木聚糖酶和内切葡聚糖酶的全复合酶处理(Ct-Xyn-EG;网格线(左四))的I)表达XynA和EGA的转基因植物EGA/XynA.2242.09；2)转基因对照植物TGC.4000.12。[0018]图6A-6B分别显示从预处理的野生型对照植物AxB和表达三重叠加(triplestacked)蛋白的转基因玉米植株XynB/EGA/CBHB.2349.56，XynB/EGA/CBHB.2349.55和XynB/EGA/CBHA.2345.116的秸杆中产出的葡萄糖和木糖的产量。产量的衡量是根据使用Acceleraseli1500/XY复合酶(FCt;黑色柱(右))进行酶水解，并与缺乏复合酶的对照处理(NCt;灰色(左))对比进行的。[0019]图7A-7B分别显示的是转基因植物的葡萄糖和木糖的产量。图7A显示的是经过#1复合酶(FCt;灰色(中))，缺乏木聚糖酶的#1复合酶(Ct-Xyn;斜条纹(右))和缺乏复合酶的对照处理(NCt;白色(左))的酶水解后，从预处理的表达木聚糖酶A的转基因柳枝稷(XynA.pv2015.3c>XynA.pv2015.4c)和预处理的野生型柳枝稷(Alamo白杨)中产出的葡萄糖产量。图7B显示了经过#1复合酶(FCt;灰色(中))，缺乏木聚糖酶的#1复合酶(Ct-Xyn；斜条纹(右))和缺乏复合酶的对照处理(NCt;白色(左))的酶水解后，从预处理的表达木聚糖酶A的第一代转基因植物(XynA.2015.05.T0),表达木聚糖酶A的第二代转基因植物(XynA.2015.05.Tl)以及预处理的缺乏木聚糖酶的转基因植物(TGC.4000.11)中产出的木糖产量的结果。[0020]图8A-8B分别显示了经过#I复合酶(FCt;灰色(中))，缺乏木聚糖酶的#1复合酶(Ct-Xyn;斜条纹(右))和缺乏复合酶的对照处理(NCt;白色(左))的酶水解后，从两种预处理的表达木聚糖酶A的转基因柳枝稷植物(XynA.pv2015.3c和XynA.pv2015.4c)和对照非转基因柳枝稷植物(Alamo)中产出的葡萄糖和木糖产量。[0021]图9A-9B分别显示了经过#I复合酶(FCt;灰色(中))，缺乏木聚糖酶的#1复合酶(Ct-Xyn;斜条纹(右))和缺乏复合酶的对照处理(NCt;白色(左))的酶水解后，从预处理的表达经内含肽修饰的木聚糖酶ACiXynA)的转基因植物(iXynA.2229.110)和预处理的野生型对照植物(AxB)中产出的葡萄糖和木糖产量。[0022]图10阐明了使用#1复合酶对预处理的表达木聚糖酶A的转基因植物(XynA.2015.5T1;实心三角)和预处理的表达木聚糖酶B的转基因植物(XynB.2063.17;实心圆圈)与对比的转基因对照植物(TGC.2004.8.02;空心方框)进行酶水解产生葡萄糖产量的时间进程。[0023]图11阐明了使用#1复合酶(EGA.2049.10.FCt、实心方框;TGC.4000.11.FCt、空心菱形)和缺乏内切葡聚糖酶的#1复合酶(EGA.2049.10.Ct_EG、实心三角；TGC.4000.11.Ct-EG,空心圆圈)对预处理的转基因植物(EGA.2049.10)和预处理的转基因对照(TGC.4000.11)进行酶水解产出葡萄糖产量的时间进程。[0024]图12A-12B阐明了经过全复合酶(EGA/XynA.2242.09.FCt,实心方块；TGC.4000.11.FCt、空心菱形)处理，与使用缺乏内切葡萄糖酶的全复合酶(图12A中EGA/XynA.2242.09.Ct_EG、实心圆圈；TGC.4000.11;Ct_EG，空心圆圈)和使用缺乏木聚糖酶的全复合酶(EGA/XynA.2242.09.Ct-Xyn、实心圆圈；TGC.4000.11;Ct_Xyn，空心圆圈)处理相t匕，预处理的转基因植物(EGA/XynA.2242.09)和预处理的转基因对照植物(TGC.4000.11)的酶水解产出葡萄糖产量的时间进程。[0025]图13A-13B阐明了经过全复合酶(XynA/AccB.2092.103.FCt,实心方块；TGC.4000.11.FCt,空心菱形)与缺乏木聚糖酶的全复合酶(XynA/AccB.2092.103.Ct-Xyn,实心三角；TGC.4000.11.Ct-Xyn、空心圆圈)进行酶水解后，分别来自预处理的表达木聚糖酶A和阿魏酸酯酶B的转基因植物(XynA/AccB.2092.103)和预处理的转基因对照植物(TGC.4000.11)的葡萄糖和木糖产量的时间进程。[0026]图14阐明了对预处理的以下表达蛋白的转基因植物进行酶水解，与非转基因对照植物(AxB)和缺乏酶的转基因对照植物(TGC.4000.11)对比得到葡萄糖的产量，所述表达蛋白的转基因植物包括:表达木聚糖酶B的转基因植物(XynB.2063.17)，表达内切葡聚糖酶的转基因植物(EGA.2049.10)，表达木聚糖酶A和阿魏酸酯酶B的转基因植物(XynA/Acc.B.2092.103)，表达木聚糖酶A和内切葡聚糖酶的转基因植物(EGA/XynA.2242.09)，表达经内含肽修饰的木聚糖酶A的转基因植物(iXynA.2229.110)。进行预处理的温度为65°C(PT_65)和75°C(ΡΤ_75)。酶用量包括每克生物质0.2毫升AccelIerase"1500或0.1毫升Accellerase'XY以及0.05μM的β-葡糖苷酶(BGL)。每个ΡΤ_65和ΡΤ_75预处理的上面的条形设定为目前转基因和对照植物的数据，从左到右依次是AxB；TGC.4000.11；XynA.2015.05T1；XynB.2063.17；XynA/AccB.2092.103；iXynA.2229.110；EGA.2049.10;和XynA/EGA.2242.09。[0027]图15显示了使用#5复合酶对预处理的转基因柳枝稷(EGC.2253.4b，实心圆圈)和野生型柳枝稷(Alamo、空心方框)进行酶水解产出的葡萄糖的产量。预处理温度为:65°C、75。。和95。。。[0028]图16A-16B显示了预处理温度和时间对从酶水解的预处理的表达内切葡聚糖酶和木聚糖酶A的转基因植物(EGA/XynA.2342.105;黑条(右))和预处理的对照植物(TGC.2342.01;灰条(左))中产出的葡萄糖(图16)和木糖(图16B)产量的影响。[0029]图17A-17B显示了预处理温度对从预处理的表达内切葡聚糖酶A和木聚糖酶A的转基因植物EGA/XynA.2242.09.01和EGA/XynA.2242.09.07，以及对照植物:野生型AxB和转基因TGC.4000.11中产出的葡萄糖(图17A)和木糖(图17B)产量的影响。[0030]图18显示了使用减少的酶用量:#1全复合酶(FCt)，75%的#1全复合酶(0.75FCt)，50%的#1全复合酶(0.50FCt)，25%的#1全复合酶(0.25FCt),10%的#1全复合酶(0.1OFCt)和无酶(OFCt)进行水解后，减少外源酶用量对从预处理的转基因植物XynA.2015.05T1(实心圆圈)，XynB.2063.17(实心三角)和对照植物TGC.2004.8.04(实心方块)中产出的葡萄糖产量的影响。[0031]图19显示了减少外源酶用量对从转基因植物XynE/EGC/CBHA.2339.03，XynE/EGC/CBHA.2339.04,XynE/EGC/CBHA.2339.05和对照植物BxA中产出的葡萄糖产量的影响。预处理使用0.17M亚硫酸氢铵和碳酸铵(pH8.1)，在75°C、液固比为10条件下进行16小时。在大约2%固含量，没有酶(NCt;白色(左))，20%全复合酶(0.2FCt;灰色(中间))和全复合酶，加入量为0.2毫升/0.1毫升的每克稻杆(0.2ml/0.1mlofpergramstover),50°C和pH值5.0的条件下进行为期三天的酶水解。[0032]图20A-20B分别显示了经过全用量的复合酶Accelerase-1500/XY(FCt;黑色(右))、20%用量的复合酶(0.2FCt;灰色(图20A中和图20B右))以及无酶(NCt；白色(图20A左))的酶水解后，预处理的表达木聚糖酶A和内切葡聚糖酶的植物(XynA/EGA.2309.54和XynA/EGA2309.107)与预处理的非转基因对照植物对比的葡萄糖和木糖的产量。[0033]图21A-21B显不了经过每克稻杆加入0.2毫升Accellerase*1500和0.1毫升Accellerase'XY的全复合酶(FCt),80%的全复合酶；每克稻杆加入0.16毫升Accellerase?1500和0.08毫升Accellerase?XY(0.8FCt),60%的全复合酶；每克稻杆加入0.12毫升Accellerasex1500和0.06毫升AccelIerase丨(XY(0.6FCt),40%的全复合酶；加入每克稻杆0.08毫升Accellerase?1500和0.04毫升Aceellerase⑧XY(0.4FCt),20%的全复合酶；每克稻杆加入0.04毫升AccelIerase1500和0.02毫升Acce丨丨eraseκ:XY(0.2FCt)以及无酶(OFCt)的情况下进行酶水解后，减少的外源酶用量对从转基因植物EGA/XynA.2242.09.16，CBHA.2069.01.03和对照植物TGC.4000.11中产出的葡萄糖(图21A)和木糖(图21B)产量的影响。[0034]图22显不了使用I)复合酶Accellerase*1500和Acce丨丨eraseφ:XY;和2)酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)D5A预处理的转基因植物EGA.2049.10和EGA/XynA.2242.09以及对比的对照植物的同步糖化和发酵(SSF)得到的乙醇产量。[0035]图23显示了基于表达外切葡聚糖酶CBHA的转基因植物(CBHA.2069.3.17;白色)和野生型对照植物(AxB;灰色)的重量损失的生物质增溶。[0036]图24A-24B显示了从非转基因对照植物(AxB;图24A)和表达外切葡聚糖酶CBHA的转基因植物(CBHA.2063.3.17;图24B)中产出乙酸(HAc)的产量。处理在75°C下进行16小时(白色(左))、85°C下进行7小时(条纹(中间))和95°C下进行(网格(右))[0037]图25A-25B显示了从非转基因对照植物(AxB;图25A)和表达外切葡聚糖酶CBHA的转基因植物(CBHA.2063.3.17)产出糖降解产物羟甲基糠醛(HMF)和糠醛的产量。处理方式用白色、条纹或网格表示，从左至右依次是:白色，HMF_75°C处理16小时；条纹，HMF_85°C处理7小时；网格，HMF_95°C处理16小时；条纹，糠醛_95°C处理16小时)。[0038]图26显示了经过0.17M亚硫酸氢铵和碳酸铵(BSC；pH8.1)预处理并自动水解后，从仅表达木聚糖酶B的转基因植物(XynB.2063.15)、表达木聚糖酶A和两种辅助酶A和B的转基因植物(XynA/AccA/B.2096.1)和非转基因对照植物(WTAxB)中产出的木糖产量。将木糖作为单糖(黑色(右))和将木糖作为寡糖(灰色(左))来评估木糖的产量。[0039]图27显示了经过0.17M亚硫酸氢铵和0.165M碳酸铵(BSC；pH8.1)预处理并自动水解后，从两种表达木聚糖酶B、内切葡聚糖酶和CBHB(XynB/EGA/CBHB.2349.56和XynB/EGA/CBHB.2349.55)的转基因植物，表达木聚糖酶B、内切葡聚糖酶和CBHA(XynB/EGA/CBHA.2345.116)的转基因植物和非转基因对照植物(AxB)产出的木糖产量。[0040]图28A-28B分别显示从使用AccelleraselY预处理的转基因植物(同时表达内切葡聚糖酶和木聚糖酶A的EGA/XynA.2242.09T1(实心圆圈)，以及转基因对照植物TGC.4000(实心方块))中产出的葡萄糖和木糖产量。[0041]图28C-28D分别表示从都同时表达内切葡聚糖酶A、木聚糖酶B和外切纤维素酶B(cellobihydrolaseB)的XynB/EGA/CBHB.2349.55(空心圆圈)，XynB/EGA/CBHB.2349.229(实心正三角)和XynB/EGA/CBHB.2349.56(实心倒三角)，以及表达经内含肽修饰的木聚糖酶A的iXynA.2329.14和野生型对照植物AxB中产出的葡萄糖和木糖的产量。【具体实施方式】[0042]在以下的说明中某些术语的使用只是为了方便而不是限制。单词“右”、“左”、“顶”和“底”在所提及的附图中用于指代方向。用于权利要求书和说明书相应部分中的单词“一个”和“一种”，除特别声明外，定义为包括一个或多个引用项。这个术语包括以上特别提到的单词，及其衍生词，以及相似的单词。短语“至少一个”意思为两个或两个以上的项目的列表，如“A，B或C”，意思是A、B或C的任何一个及它们的任何组合。[0043]本文的实施方式提供了在植物中表达一系列的细胞壁降解(CWD)蛋白的技术。CWD蛋白可以是CWD酶或CWD酶的修饰形式。修饰形式可以是经内含肽修饰的CWD蛋白。植物可以是玉米、高粱、柳枝稷或其他植物。本文的实施方式提供了获得含有植物CWD蛋白的生物质，以在糖生产中用作原料。植物酶表达使用植物作为一个“工厂”，而不是微生物发酵生产工业CWD酶。这种方法的优势在于将生物质原料中的蛋白直接用于可发酵糖生产中。有水解特性的转基因植物生物质可以不需要严格的预处理来提高细胞壁纤维素与外源酶的可结合性。在单株植物中，不同类型CWD蛋白的表达可以为生物燃料和生物化学生产创建一个低成本的糖平台。本文的实施方式提供了对来自包括一种或多种类型CWD蛋白的基因工程植物的木质纤维素生物质进行温和的化学预处理来生产可溶性糖的方法。[0044]—种实施方式提供了一种从基因工程植物材料中生产可溶性糖的方法。所述方法可以包括通过与制浆制剂混合形成混合物以预处理基因工程植物原料。基因工程植物材料可以包括编码第一蛋白的第一多核苷酸序列。第一蛋白可以是CWD酶。第一蛋白可以是经内含肽修饰的CWD酶。第一蛋白可以是木聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶，阿魏酸酯酶，经内含肽修饰的木聚糖酶、经内含肽修饰的内切葡聚糖酶、经内含肽修饰的外切葡聚糖酶或经内含肽修饰的阿魏酸酯酶。第一蛋白可以能够水解基因工程植物材料的组分。能够水解某组分意味着在水解条件下第一蛋白催化该组分的水解。对于经内含肽修饰的第一蛋白而言，能够水解某组分意味着该内含肽从肽上剪接(spliced)后，该蛋白能够在水解条件下水解该组分。所述方法还可以包括提供水解条件。水解条件可以适于水解该组分。[0045]基因工程植物材料还可以包括编码第二蛋白的第二多核苷酸序列。第二蛋白可以是CWD蛋白。第二蛋白可以是经内含肽修饰的CWD蛋白。第二蛋白可以是木聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、阿魏酸酯酶、经内含肽修饰的木聚糖酶、经内含肽修饰的内切葡聚糖酶、经内含肽修饰的外切葡聚糖酶或经内含肽修饰的阿魏酸酯酶。被选定为第二蛋白的蛋白可以不同于被选定为第一蛋白的蛋白。第二蛋白能够水解基因工程植物原料的组分。能够水解某组分意味着第二蛋白在水解条件下催化这种组分水解。对于经内含肽修饰的第二蛋白而言，能够水解某组分意味着该内含肽从肽上剪接后，该蛋白可以在水解条件下水解该组分。[0046]基因工程植物材料还可以包括编码第三蛋白的第三多核苷酸序列。第三蛋白可以是CWD蛋白。第三蛋白可以是经内含肽修饰的CWD蛋白。第三蛋白可以是木聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、阿魏酸酯酶、经内含肽修饰的木聚糖酶、经内含肽修饰的内切葡聚糖酶、经内含肽修饰的外切葡聚糖酶或经内含肽修饰的阿魏酸酯酶。被选定为第三蛋白的蛋白可以不同于被选定为第一蛋白的蛋白。被选定为第三蛋白的蛋白可以不同于被选定为第二蛋白的蛋白。第三蛋白可以能够水解基因工程植物原料的组分。能够水解某组分意味着第三蛋白在水解条件下催化这种组分水解。对于经内含肽修饰的第三蛋白而言，能够水解某组分意味着该内含肽从肽上剪接后，该蛋白能够在水解条件下水解该组分。[0047]基因工程植物材料是指转基因植物、转基因植物的子代，转基因植物的后代，或上述任何一种植物的部分。转基因植物材料可以含有不存在于天然植物中的细胞壁降解酶或其编码基因。基因工程植物材料可以是表达CWD蛋白的转基因植物，或转基因植物的任何部分。基因工程植物材料可以是表达修饰形式的CWD蛋白的任何转基因植物，或转基因植物的任何部分。转基因植物可以是任何形式的植物。植物的转基因植物类型可以是但不限于玉米、甜菜、甘蔗、高粱、柳枝稷、芒草、桉树、柳树或杨树。基因工程植物材料可以是整个转基因植物或该植物的部分。所述部分可以是但不限于叶、茎、花、芽、花瓣、子房、果实或种子。基因工程植物材料可以是来自转基因植物的愈伤组织。基因工程植物材料可以由一种或多种转基因植物的部分再生。基因工程植物材料可以是第一转基因植物和第二转基因植物或非转基因植物有性杂交的产品，其中，产品植物保留引种到第一转基因植物的多核苷酸序列。转基因植物可以是本文所提供的转基因植物中的任何一种。转基因植物可以含有任何载体，表达盒，或单独的核酸或其片段。[0048]基因工程植物材料与制浆制剂的混合可以通过任何基因工程植物材料和制浆制剂的结合来完成。混合可以通过搅拌来完成。[0049]制浆制剂可以是分解木质素的物质，所述木质素将木质纤维素植物材料内部的木质纤维素结合在一起。所述物质可以降解木质素而不会严重降解木质纤维素。预处理可以导致在基因工程植物中表达的部分酶的释放和木质纤维素植物材料内木质素的部分降解。[0050]所述方法可以包括在预处理之前，期间或之后对CWD蛋白进行激活。所述方法可以包括在供给水解条件之前、期间或之后对CWD蛋白进行激活。被激活的CWD蛋白可以是第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白，或任何外加的木质纤维素处理酶。CWD蛋白可以被修饰为含有内含肽。所述内含肽可以融合至CWD酶上或酶末端或酶的内部。所述内含肽在供给诱导条件下可诱导剪接。诱导条件可以是特定的混合物温度。诱导条件可以是预处理或提供水解步骤之前、期间或之后的温度。经内含肽修饰的酶和用于诱导内含肽剪接的条件，可以作为活化条件，这在2004年7月7日提交的美国申请Appln.10/886，393和2010年的11月5日提交的PCT/US10/55746，2010年的11月5日提交的PCT/US10/55669和2010年的11月5日提交的PCT/US10/55751中有所描述，在此以全文援引的方式纳入本文。[0051]所述组分可以是需要处理的任何部分。所述组分可以是木质纤维材料。所述组分可以为本文所列出的任何CWD蛋白的底物。所述组分可以为木聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶，阿魏酸酯酶的底物。所述组分可以是包括本文所列出的任何CWD蛋白的底物的一部分。所述组分可以是包括木聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶，阿魏酸酯酶的底物一部分。[0052]所述方法还包括混合之前、期间或之后添加其他植物材料，预处理，或提供水解条件。其他植物材料可以是基因工程材料以外的任何植物生物质、纤维素或木质纤维材料。其他植物材料可以来源于生物炼制产物。其他植物材料可以包括林业和农业废物。林业和农业废物可以是但不限于玉米秸杆、甘蔗渣(baggasses)、小麦秸杆、废木材、森林修剪物(foresttrimmings)、废纸、城市固体废物(MSW)。其他植物材料可以是任何能源作物。能源作物可以是但不限于。柳枝稷、高粱、甜菜、甘蔗、芒草和杨树。[0053]编码第一蛋白，第二蛋白，第三蛋白或任何额外的酶的多核苷酸序列可以可操作地连接至调控序列上。本文中，可操作地连接意味着调控元件将其功能赋予多核苷酸序列。在调控元件是启动子的情况下，当将调控元件与多核苷酸序列可操作地连接的时候，启动子能够控制它们的表达。在调控元件是终止子的情况下，所述终止子能够终止多核苷酸序列的转录。下面提供了调控元件的非限制性参考示例。[0054]第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的至少一种可以是但不限于选自下列的酶:XynA:来自嗜热网球菌(Dictyoglomusthermophilum)的β-1,4-木聚糖酶229Β(Uniprot登记号Ρ77853);XynB:来自米曲霉(ThermomycesIanuginosus)的内_1，4_β-木聚糖酶(Uniprot登记号043097)；EGA:来自高山象白蚁(Nasutitermestakasagoensis)的内-β-1，4-内切葡聚糖酶(Uniprot登记号077044)；EGB:来自解纤维热酸菌(Acidothermuscellulolyticus)的内_β-1,4-内切葡聚糖酶(Uniprot登记号Ρ54583)；AccA:来自黑曲霉(Aspergillusniger)的阿魏酸酯酶A(Uniprot登记号042807)；AccB:来自黑曲霉的阿魏酸酯酶B(Uniprot登记号Q8WZI8)；AccA/B:黑曲霉的阿魏酸酯酶A和阿魏酸酯酶B;EGC:来自海洋红嗜热盐菌(Rhodothermusmarinus)的内-β_1，4-内切葡聚糖酶(Uniprot登记号033897)；Ρ40942:来自幾堆梭菌F9(ClostridiumstercorariumF9)的β-1,4-木聚糖酶(Uniprot登记号P40942);P40943:来自嗜热脂肪土芽孢杆菌T_6(GeobacillusstearothermophiIusT-6嗜热脂肪芽抱杆菌)的β-1，4-木聚糖酶(Uniprot登记号Ρ40943)；030700:来自芽孢杆菌属NG-27的β-1,4-木聚糖酶(Uniprot登记号030700)；CBHA:来自热纤维梭菌(Clostridiumthermocellum)的外切纤维素酶A(Uniprot登记号068438)；CBHB:外切纤维素酶B(SYTBD22308);或XynE:木聚糖酶(EU591743)。[0055]第一蛋白可以包括与参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列、基本上由或由与参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列组成，所述参考序列选自由SEQIDNO:1[WTP77853]、SEQIDNO:2[AnfaeA]、SEQIDNO:3[AnfaeB]、SEQIDNO:4[NtEGm]、SEQIDNO:5[EU591743]、SEQIDNO:6[043097]、SEQIDNO:7[P77853:T134-100-101]、SEQIDNO:8[Ρ77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO:9[033897],SEQIDNO:10[068438]和SEQIDNO:11[P54583]所组成的组中。第一蛋白可以包括与参考序列SEQID:12[BD22308]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列、基本上由或由与参考序列SEQID:12[BD22308]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列组成。[0056]第二蛋白可以包括与第二参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列、基本上由或由与第二参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列组成，所述第二参考序列选自由SEQIDNO:1[WTP77853]、SEQIDNO:2[AnfaeA]、SEQIDNO:3[AnfaeB]、SEQIDNO:4[NtEGm]、SEQIDNO:5[EU591743]、SEQIDNO:6[043097]、SEQIDNO:7[P77853:T134-100-101]、SEQIDNO:8[P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO:9[033897],SEQIDNO:10[068438]和SEQIDNO:11[P54583]所组成的组中。第二蛋白可以包括与参考序列SEQID:12[BD22308]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列、基本上由或由与参考序列SEQID:12[BD22308]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列组成。[0057]第三蛋白可以包括与第三参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列、基本上由或由与第三参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列组成，所述第三参考序列选自由SEQIDNO:1[WTP77853]、SEQIDNO:2[AnfaeA]、SEQIDNO:3[AnfaeB]、SEQIDNO:4[NtEGm]、SEQIDNO:5[EU591743]、SEQIDNO:6[043097]、SEQIDNO:7[P77853:T134-100-101]、SEQIDNO:8[P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO:9[033897],SEQIDNO:10[068438]和SEQIDNO:11[P54583]所组成的组中。第三蛋白可以包括与参考序列SEQID:12[BD22308]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列、基本上由或由与参考序列SEQID:12[BD22308]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列组成。[0058]第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少一种还可以包括编码各自靶向肽的第一靶向多核苷酸序列。对于缺乏第三多核苷酸序列的基因植工程植物材料，第一靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列或第二多核苷酸序列的至少一种上。对于缺乏第二多核苷酸和第三多核苷酸序列的基因工程植物材料，第一祀向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列上。第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的每种可以独立选择各自的靶向肽。靶向肽可以融合到第一蛋白，第二蛋白或第三蛋白上。每种各自的靶向肽可以独立地选自但不限于造粉体靶向信号、细胞壁靶向肽、线粒体靶向肽、细胞质定位信号、叶绿体靶向信号、核靶向肽和液泡靶向肽。[0059]第一靶向多肽可以位于所述第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列的上游。靶向肽可以与SEQIDNO:13[BAASS]、大麦糊粉粒序列SEQIDNO:14[HVAlePS]、SEQIDNO:15[PRla]、SEQIDNO:16[Y玉米蛋白序列xGZein27ss_02]或SEQIDNO:17[GluB4SP]中的一种具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98,99或100%的同一性。[0060]与第一多核苷酸序列，第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的一种相结合的第一靶向多核苷酸序列可以编码与参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列，所述参考序列选自由SEQIDNO:18[BAASS:P77853]、SEQIDNO:19[BAASS:033897]、SEQIDNO:20[HVAlePS:NtEGm]和SEQIDNO:21[BAAS:P77853:S158-30-108-35]所组成的组中。[0061]第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少一种还可以包括编码羧基靶向肽的第二靶向多核苷酸序列。对于缺乏第三多核苷酸序列的基因工程植物材料，第二靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列或第二多核苷酸序列中的至少一种上。对于缺乏第二多核苷酸序列和第三多核苷酸序列的基因工程植物材料，第二靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列上。羧基靶向肽可以选自但不限于与SEQIDNO:22[SEKDEL]、缩减的SEQIDNO:23[KDEL]或大麦液泡分类决定序列SEQIDNO:24[HvVSD-OI]中的一种具有至少72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100的同一性的序列。羧基靶向肽可以融合到第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白的至少一种上。[0062]在细胞质积累中，提供的所述第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中至少有一种可以不含有靶向肽。[0063]所述第一靶向多核苷酸序列和第二靶向多核苷酸序列与第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列结合在一起，可以编码与参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列，所述参考序列选自由SEQIDNO:25[BAASS:AnfaeB:SEKDEL]、SEQIDNO:26[BAASS:AnfaeA:SEKDEL]、SEQIDNO:27[PRla:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO:28[BAASS:P77853:T134-100-101:SEKDEL]、SEQIDNO:29[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO:30[BAASS:043097:SEKDEL]和SEQIDNO:31[xGZein27ss-02:BD22308:HVVSD-01]所组成的组中。[0064]第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少一种可以编码CWD蛋白的“变体”。所述CWD蛋白的变体的氨基酸序列可以根据氨基酸序列的缺失、添加、替换或CWD蛋白的其它修饰而改变。CWD蛋白的变体可以维持CWD蛋白的生物活性。本文中，所述维持生物活性是指，变体至少有从CWD蛋白中得到的60%的活性。对木聚糖酶活性的评估可以在实验中使用本文中实施例1标题为“秸杆酶活性测定”的小节中描述的XylazymeAX底物。对内切葡聚糖酶的活性的评估可以通过在实验中使用本文中实施例1标题为“秸杆酶活性测定”的小节中描述的Cellazyme底物。外切葡聚糖酶活性的评估可以通过在实验中使用突光4_甲基伞形酮-b_D_乳吡喃糖苷(4-methylumbelliferyl-b-D-1actopyranoside)(4-MU),如HarrisonMDetal.2011“Accumulationofrecombinantcellobiohydrolaseandendoglucanaseintheleavesofmaturetransgenicsugarcane,”PlantBiotechnologyJournal(植物生物科技杂志)9:884-896中所描述的，这里以全文援引的方式纳入本文。对阿魏酸酯酶活性的评估可以通过在实验中使用PNP标记的阿魏酸盐作为底物(详见HegdeS.等.2009“Single-stepsynthesisof4-nitrophenylferulateforspectrophotometrieassayofferuloylesterases,，，AnalyticalBiochemistry(分析生物化学)387(I):128_129)。上述木聚糖酶、内切葡聚糖酶,外切葡聚糖酶或阿魏酸酯酶活性的测试可以用来确定与CWD降解蛋白序列有少于100%的同一性的序列是否为CWD降解蛋白的变体。这里CWD蛋白的变体可以被修饰成与CWD蛋白有相似的疏水性、亲水性、溶解度、氨基酸残基极性的氨基酸序列。这里CWD蛋白可以根据翻译后的修饰而改变。不同的翻译后修饰可以是但不限于糖基化，乙酰化或磷酸化作用。变体可以通过任何方式形成。变体可以通过定点诱变或非定点诱变形成。本文中，易错PCR可以用来创建CWD蛋白的突变体，而且以上任何实验均可以用来评估突变体是否是变体。[0065]实施方式包括将第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白，或它们的变体中的至少一种融合到靶向肽或羧基靶向肽中的至少一种的变体上。靶向肽或羧基靶向肽的变体将蛋白靶向融合到与靶向肽或羧基靶向肽的参考序列相同的位点上。[0066]内含肽的变体可以在第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中提供。内含肽的变体可以从其融合的蛋白中剪接。[0067]为确定两种氨基酸序列或两种核酸序列的同一性百分比，可以包括在两条序列的相应位置上比对和比较氨基酸残基或核苷酸。如果两条序列所有的位置都被相同的氨基酸残基或核苷酸占据，那么这两条序列被称为具有100%的同一性。同一性百分比可以通过SmithWaterman算法测定(SmithTF、WatermanMS1981“IdentificationofCommonMolecularSubsequences,”JMolBiol147:195-197,该文献通过全文援引的方式纳入本文)。[0068]在一种实施方式中，编码与引用的氨基酸参考序列具有低于100%同一'丨生的蛋白的多核苷酸序列可以编码含有氨基酸参考序列的蛋白的变体。在一种实施方式中，与引用的氨基酸参考序列具有低于100%的同一性的蛋白可以是含有氨基酸参考序列的蛋白的变体。在一种实施方式中，编码与引用的核酸参考序列编码的蛋白具有低于100%的同一性的蛋白的多核苷酸序列可以编码蛋白的变体，所述蛋白由参考序列编码。[0069]参考图1，显示了一种从基因工程植物材料中生产可溶性糖的方法。图1显示了基因工程植物材料的联合预处理和水解的工艺流程。基因工程植物材料或基因工程植物材料混同其他植物材料可以通过送料机10添加到反应器20进行化学预处理和酶液化，也就是说，将固体木质纤维素生物质转化成液化状态以进一步加工和水解的过程。在反应器20，基因工程植物材料或基因工程植物材料混同其他植物材料可以与制浆制剂混合。制浆制剂可以包括至少一种组分，所述组分具有选自由亚硫酸根、亚硫酸氢根、硫酸根、碳酸根、氢氧根和氧负离子(oxide)所组成的组中的离子。所述至少一种组分还包括但不限于选自由铵离子、钠离子、镁离子及钙离子所组成的组中的反荷离子(counterion)。至少一种组分可以是盐。所述盐可以是但不限于亚硫酸盐(S032_)、亚硫酸氢盐(HS03_)、氧化物(02_)和氢氧化物(0H—)。所述盐可以包括反荷离子。反荷离子可以包括但不限于钠离子(Na+)、钙离子(Ca2+)、氢离子、钾离子(K+)、镁离子(Mg2+)和铵离子(MO。制浆制剂可以包括氧化钙(CaO)、石灰或氢氧化钙(Ca(OH)2)、消石灰中的至少一种。[0070]在一种实施方式中，制浆制剂可以至少包括亚硫酸氢铵和碳酸铵中的一种。亚硫酸氢铵的浓度可为0.02M至0.35M，而碳酸铵的浓度可为0.025M至0.25M。制浆制剂可以与基因工程植物材料或混有其他植物材料的基因工程植物材料以优选的液固比混合成混合物。这种混合物具有的液固比可选自小于或等于10、9、8、7、6、5、4、3、2或I的值，或上述任何两个值区间内的任意值(包括端点)。例如，液固比可以为小于任何选自3-7之间的整数或非整数的值。液固比值可以等于10、9、8、7、6、5、4、3、2或1，或上述任何两个值区间内任何值(包含端点)。例如，液固比可以为等于3至7范围内任何整数或非整数的值。[0071]预处理可以包括培养混合物任意一段时间。预处理可以包括培养混合物长达16个小时。所述培养可以进行更长或更短的时间。预处理可以包括培养混合物一段小于或等于16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或I小时的时间。[0072]预处理可以包括提供40°C至95°C的混合物温度。40°C至95°C的混合物温度，可以在不使水解酶失活的情况下破损或除去混合物中木质素纤维材料的部分木质素。预处理可以包括提供55°C、65°C、75°C、95°C、低于551:、低于651:、低于75°C、低于95°C、低于100°C、40°C至55°C、40°C至65°C、40°C至75°C、40°C至95°C、40°C至低于100°C、55°C至65°C、55°C至75°C、55°C至95°C、55°C至低于100°C、65°C至75°C、65°C至95°C、65°C至低于100°C、75°C至95°C、75°C至低于100°C或95°C至低于100°C的混合物温度。[0073]预处理可以包括提供混合物pH值为5.0至10。预处理可以包括提供混合物pH值在6.5-8.5范围内。提供的混合物pH值可以是5.0,5.5,6.0,7.0,7.5,8.0,9.0、9.5或10，或任意两个上述PH值之间的(包括端点)pH值。预处理过程中混合物的pH值可以取决于使用的化学物质的类型和/或使用的植物材料的类型。提供混合物PH值可以包括添加pH值调节化学物质。PH值调节化学物质可以是酸或碱。[0074]预处理步骤结束时，混合物可以包括部分降解的植物材料和称为部分滤液的液相，所述部分滤液可以含有来自制浆制剂和低浓度的CWD酶的化学物质或从基因工程植物材料释放的酶。所述方法可以包括在分离器30中从部分降解的植物材料的固体部分分离部分滤液。分离可通过各种工艺来完成。可以通过沉淀、过滤或离心部分滤液。所述方法可以包括在多个回合的预处理中至少收集或回收一部分部分滤液。在去除部分滤液后，混合物中固体的浓度可以增加并且可以为在2%至15%(w/v)的范围内的任何整数或非整数值，或为在2%至15%(w/v)范围内的任何两个整数值内的范围。[0075]所述方法可以包括用任何合适的液体清洗预处理的基因工程植物材料。液体可以是去离子水。液体可以通过离心分离而去除。[0076]所述方法还包括通过机械研磨来精炼，这可以在精炼机40内通过任何已知的方法完成，例如但不限于去纤维化(defibrilIation),研磨或打碎。[0077]所述方法可以包括转移精炼的预处理的生物质到糖化容器50。从基因工程植物材料中释放的CWD酶的水解作用发生在糖化容器50中。[0078]提供的水解条件可以包括调整混合物为2%至25%的固含量，在2%至25%(包括端点)之间的任何整数或非整数值的固含量，或在2%至25%之间任意两个整数范围内的任何整数或非整数值的固含量。提供的水解条件可以包括培养混合物长达144小时的一段时间，选自长达144小时的任何一个整数或非整数值的一段时间，或大于零和长达144小时内任意两个整数值范围内的一段时间。提供水解条件可以包括提供100°C或更低、65°C或更低、50°C或更低、48°C至50°C、48°C至65°C、48°C至小于100°C，或48°C至100°C的混合物温度。提供水解条件可以包括提供从4.8至5.0范围的pH值，4.8的pH值，4.9的pH值或者5.0的pH值。可以根据基因工程植物材料中CWD酶的具体活性来选择温度，pH值或处理时间中的至少一种。[0079]如果基因工程植物材料包括多种CWD酶，可以按顺序为所述多种酶中的每一种的表达、预处理或水解中的至少一步提供最佳的条件。水解条件可以包括提供一种酶活性最佳的pH值，然后提供适于另一种酶活性的最佳的不同pH值。水解条件可以包括在不同的时段来调整每种酶最佳活性的温度。例如，木聚糖酶可能需要不同于内切葡聚糖酶的温度或pH值。[0080]所述方法包括添加一种或多种外源酶到基因工程植物材料，其它植物材料或混合物其中的至少一种中。外源酶可以在预处理之前、期间或之后添加。外源酶可以在提供水解条件之前、期间或之后添加。外源酶可以添加到糖化容器50中。一种或多种外源酶可以以复合酶(enzymecocktail)的形式提供。复合酶可以包括一种或多种CWD酶。本文中，在一种实施方式中提供的CWD酶可以是但不限于木质素降解酶，纤维素降解酶或半纤维素降解酶。本文中，在一种实施方式中提供的CWD酶可以是但不限于选自糖苷酶、木聚糖酶、纤维素酶、纤维素内切酶、外切葡萄糖酶、外切纤维素酶、β-木糖苷酶、阿魏酸酯酶以及淀粉酶中的一种。复合酶可以包括从里氏木霉(Trichodermareesii)中分离的的纤维素酶。复合酶可以从供应商购买。复合酶可以为但不限于从杰能科国际(GenencorInternational)(罗契斯特市，纽约)购买的Accellerase?lOOO,Accellerase*1500和Accellerase%XY。复合酶可以是诺纤力?赛力二代(Cellic)。酶Cellic可以包括不同类型的CWD酶。混合物中不同类型的CWD酶的最优条件可以被提供。例如，在所述方法中，可以调节水解处理的温度、PH值和时间以为混合物中不同的酶提供最优条件。水解条件可以包括减少复合酶中含有的外源酶的用量。减少用量可以包括在基因工程植物材料中具有较少的或缺乏一种或多种CWD蛋白表达的制剂。例如，如果转基因植物表达木聚糖酶和内切葡聚糖酶，这些酶可以从按配方制成的用于具有转基因植物的基因工程植物材料水解的复合酶中去除。[0081]水解效率可以通过测量植物材料的增溶进行评估。测量植物材料增溶的方法为本【
技术领域：
】所公知，可以包括确定单糖和二糖浓度，例如通过高效液相色谱(HPLC)法。在此描述的实施例中，可以使用具有LC解决方案软件(solutionssoftware)的ShimadzuLC-20AD二元液相泵(Shimadzu,Kyoto,Japan)进行HPLC,糖浓度的测量可以使用AminexHPX-87p糖柱(Bio-Rad实验室)。其他测量植物材料的增溶的方法，例如，通过测定重量损失、木质素去除或对预处理的植物材料进行脱乙酰作用都是可用的。[0082]所述方法还可以包括使混合物和/或水解产物与发酵生物相接触，以便生产生化产品。酶水解后，可溶性糖可以回收并用于生产生化产品。或者，在所述方法中，可以同步糖化和发酵可溶性糖以形成生化产品。生化产品可以是但不限于丁烷、丁二醇、丁二烯、丁醇、异丁醇、丙烷、丙二醇、丙烯、丙醇、异丙醇、甲烷、甲醇、乙醇、苯酚、丙三醇、乙烯、甲苯、乙酯(ethyl)、苯、苯乙烯、二甲苯、乙二醇、环氧乙烷、甲酸、二氧化碳、甲醛、乙醛、丙酮、维生素、乙烷、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、苯、醋酸、山梨糖醇、阿拉伯糖醇、琥珀酸、胡索酸、苹果酸、呋喃二羧酸、天冬氨酸、葡糖二酸、谷氨酸、衣康酸、乙酰丙酸、羟基内丁酯、甘油、山梨醇、木糖醇、阿拉伯糖醇、葡糖酸、乳酸、丙二酸、丙酸、柠檬酸、乌头酸、木糖酸、糠醛、左旋葡聚糖、丙氨酸、脯氨酸、赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸(参见T.Werpy和G.Petersen,TopValueAddedChemicalsFromBiomass,VolumeljResultsofScreeningforPotentialCandidatesfromSugarsandSynthesisGas，2004年8月，Report，PNNL&NREL，在此以全文引用的方式纳入本文)。所述方法可以包括同步糖化和发酵可溶性糖生产乙醇。同步糖化和发酵生产乙醇可以包括在预处理之前、期间或之后提供酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)D5A或提供水解条件。[0083]可以通过任何合适的发酵生物将糖类转换成所需的生化产品。发酵生物可以根据所需的生化产品来选择。发酵生物可以是酵母。酵母可以是但并不仅限于酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichiai)、耶氏酵母属(Yarrowia)、刀抱酵母属(Spathaspora)或发酵酵母属(Scheffersomyces)各属种中的一种。发酵的生物可以是细菌。细菌可以是但不限于单胞发酵菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、芽抱杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)或梭菌属(Clostridium)各属种中的一种。发酵生物可以是野生型生物或基因工程重组生物。[0084]一种实施方式包括含有编码第一蛋白的第一多核苷酸序列的基因工程植物。第一蛋白可以是CWD蛋白。第一蛋白可以是经内含肽修饰的CWD蛋白。第一蛋白可以通过任何一种描述的有关从基因工程植物材料生产可溶性糖的方法中获得。第一蛋白可以包括、基本上由或由与第一参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列组成，所述第一参考序列选自由SEQIDNO:I[WTP77853]、SEQIDNO:2[AnfaeA]、SEQIDNO:3[AnfaeB]、SEQIDNO:4[NtEGm]、SEQIDNO:5[EU591743]、SEQIDNO:6[043097]、SEQIDNO:7[P77853:T134-100_101]、SEQIDNO:8[P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO:9[033897]、SEQIDNO:10[068438]和SEQIDNO:11[P54583]所组成的组中。所述第一蛋白可以包括，基本上由或由与参考序列SEQID:12[BD22308]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一性的氨基酸序列组成。[0085]基因工程植物还可以包括编码第二蛋白的第二多核苷酸序列。第二蛋白可以是CWD酶。第二蛋白可以是经内含肽修饰的CWD蛋白。第二蛋白可以通过任何一种描述的有关从基因工程植物材料生产可溶性糖的方法中获得。第二蛋白可以包括、基本上由或由与第二参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列组成，所述第二参考序列选自由SEQIDNO:1[WTP77853]、SEQIDNO:2[AnfaeA],SEQIDNO:3[AnfaeB],SEQIDNO:4[NtEGm]、SEQIDNO:5[EU591743]、SEQIDNO:6[043097]、SEQIDNO:7[P77853:T134-100-101],SEQIDNO:8[P77853:S158-30-108-35],SEQIDNO:9[033897],SEQIDNO:10[068438],SEQIDNO:11[P54583]和SEQID:12[BD22308所组成的组中。被选定为第二参考序列的SEQIDNO可以不同于被选定为第一参考序列的SEQIDN0。[0086]基因工程植物还可以包括编码第三蛋白的第三多核苷酸序列。第三蛋白可以是CWD酶。第三蛋白可以是经内含肽修饰的CWD蛋白。第三蛋白可以通过任何一种描述的有关从基因工程植物材料生产可溶性糖的方法中获得。第三蛋白可以包括与第三参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列、基本上由或由与第三参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列组成，所述第三参考序列选自由SEQIDNO:1[WTP77853]、SEQIDNO:2[AnfaeA]、SEQIDNO:3[AnfaeB]、SEQIDNO:4[NtEGm]、SEQIDNO:5[EU591743]、SEQIDNO:6[043097]、SEQIDNO:7[P77853:T134-100-101]、SEQIDNO:8[P77853:S158-30-108-35],SEQIDNO:9[033897],SEQIDNO:10[068438],SEQIDNO:11[P54583]和SEQID:12[BD22308]所组成的组中。被选定为第三参考序列的SEQIDNO可以不同于被选定为第一参考序列的SEQIDN0。被选定为第三参考序列的SEQIDNO可以不同于被选定为第二参考序列的SEQIDNO。[0087]基因工程植物中的第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少一种还可以包括编码各自的靶向肽的第一靶向多核苷酸序列。对于缺乏第三多核苷酸序列的基因工程植物，第一靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列或第二多核苷酸序列的至少一种上。对于缺乏第二多核苷酸序列和第三多核苷酸序列的基因工程植物，第一靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列上。各自靶向肽可以独立地选自但不限于造粉体靶向信号、细胞壁肽、线粒体靶向肽、细胞质定位信号，叶绿体靶向信号，细胞核靶向肽或液泡靶向肽。[0088]每条单独的靶向肽可以融合到相应的第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白上。靶向肽可以与SEQIDNO:13[BAASS]、SEQIDNO:14[HvAleSP]、SEQIDNO:15[PRla]、SEQIDNO:16[xGZein27ss-02]或SEQIDNO:17[GluB4SP]中的一种具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性。[0089]基因工程植物的第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少一种还可以包括编码羧基靶向肽的第二靶向多核苷酸序列。对于缺乏第三多核苷酸序列的基因工程植物，第二靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列或第二多核苷酸序列中的至少一种上。对于缺乏第二多核苷酸序列和第三多核苷酸序列的基因工程植物，第二靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列上。羧基靶向肽可以选自但不限于与SEQIDNO:22[SEKDEL]、缩减的SEQIDNO:23[KDEL]或SEQIDNO:24[大麦液泡分类决定序列HvVSD-Ol]中的一种具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100的同一性的序列。羧基靶向肽可以融合到第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白的至少一种上。[0090]基因工程植物可以包括至少一种编码氨基酸序列的多核苷酸序列，所述氨基酸序列包括与选自由SEQIDNO:18[BAASS:P77853]、SEQIDNO:19[BAASS:033897]、SEQIDNO:20[HVAlePS:NtEGm],SEQIDNO:21[BAASS:P77853:S158-30-108-35],SEQIDNO:25[BAASS=AnfaeB:SEKDEL],SEQIDNO:26[BAASS:AnfaeA:SEKDEL],SEQIDNO:27[PRla:NtEGm:SEKDEL],SEQIDNO:28[BAASS:P77853:T134-100-101:SEKDEL]、SEQIDNO:29[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO:30[BAASS:043097:SEKDEL]和SEQIDNO:31[xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01]所组成的组中的序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的序列、基本上由或由与选自由SEQIDNO:18[BAASS:P77853]、SEQIDNO:19[BAASS:033897]、SEQIDNO:20[HVAlePS:NtEGm]、SEQIDNO:21[BAASS:P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO:25[BAASS:AnfaeB:SEKDEL]、SEQIDNO:26[BAASS:AnfaeA:SEKDEL]、SEQIDNO:27[PRla:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO:28[BAASS:P77853:T134-100-101:SEKDEL]、SEQIDNO:29[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO:30[BAASS:043097:SEKDEL]和SEQIDNO:31[xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01]所组成的组中的序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的序列组成。[0091]基因工程植物可以包括至少一种氨基酸序列，所述氨基酸序列包括与选自由SEQIDNO:18[BAASS:P77853]、SEQIDNO:19[BAASS:033897]、SEQIDNO:20[HVAlePS:NtEGm]、SEQIDNO:21[BAASS:P77853:S158-30-108-35],SEQIDNO:25[BAASS=AnfaeB:SEKDEL],SEQIDNO:26[BAASS:AnfaeA:SEKDEL],SEQIDNO:27[PRla:NtEGm:SEKDEL],SEQIDNO:28[BAASS:P77853:T134-100-101:SEKDEL]、SEQIDNO:29[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO:30[BAASS:043097:SEKDEL]和SEQIDNO:31[xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01]所组成的组中的序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的序列、基本上由或由与选自由SEQIDNO:18[BAASS:P77853]、SEQIDNO:19[BAASS:033897]、SEQIDNO:20[HVAlePS:NtEGm]、SEQIDNO:21[BAASS:P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO:25[BAASS:AnfaeB:SEKDEL]、SEQIDNO:26[BAASS:AnfaeA:SEKDEL]、SEQIDNO:27[PRla:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO:28[BAASS:P77853:T134-100-101:SEKDEL]、SEQIDNO:29[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO:30[BAASS:043097:SEKDEL]和SEQIDNO:31[xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01]所组成的组中的序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的序列组成。[0092]基因工程植物可以是转基因植物，转基因植物的子代，转基因植物的后代，或上述的任何一部分。基因工程植物可以包括不在植物中天然存在的CWD蛋白，或编码相同CWD蛋白的基因。CWD蛋白可以是经内含肽修饰的CWD蛋白。转基因植物可以是任何类型的植物。转基因植物类型可以是玉米、甘蔗、甜菜、高粱、柳枝稷、芒草、桉树、柳树或杨树。转基因植物可以通过已知的方法创建，用来表达任何形式的CWD酶或CWD蛋白。所述植物可以使用载体进行农杆菌介导转化来创建，所述载体包括编码酶的多核苷酸序列。还可以通过用于转基因植物的其他方法来创建转基因植物，例如，基因枪法或直接吸收DNA法。本文所述的转基因植物可以含有任何单独的核酸、氨基酸序列、表达盒或载体。[0093]在一种实施方式中提供了一种表达盒，包括第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少一种，分别编码第一蛋白、第二蛋白和第三蛋白。第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的一种或多种可以是CWD蛋白。第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的一种或多种可以是经内含肽修饰的CWD蛋白。第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的一种或多种可以是从基因工程植物材料或基因工程植物中生产可溶性糖的方法中描述的一种蛋白。第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的一种或多种可以是木聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、阿魏酸酯酶、经内含肽修饰的木聚糖酶、经内含肽修饰的内切葡聚糖酶、经内含肽修饰的外切葡聚糖酶或经内含肽修饰的阿魏酸酯酶。被选定为第二蛋白的蛋白可以不同于被选定为第一蛋白的蛋白。被选定为第三蛋白的蛋白可以不同于被选定为第一蛋白的蛋白。被选定为第三蛋白的蛋白可以不同于被选定为第二蛋白的蛋白。[0094]在表达盒中编码CWD蛋白的第一多核苷酸序列，第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中至少有一种可以通过插入编码内含肽的核酸序列被修饰。经内含肽修饰的多核苷酸可以使用修饰功能编码经内含肽修饰的蛋白。修饰功能可以使CWD蛋白失活而内含肽仍然融合到或在CWD蛋白中。存在于经内含肽修饰的蛋白中的内含肽可以诱导剪接形成非经内含肽修饰的蛋白。剪接的诱导条件可以是但并不局限于提供一定的温度。提供的温度可以是用于从基因工程植物材料中生产可溶性糖的方法中描述的预处理或水解条件中至少一种中提供的温度。诱导条件可以是与选定的内含肽相匹配的任何其他诱导条件。经内含肽修饰的蛋白可以是iXynA:即，经内含肽修饰的XynA。经内含肽修饰的蛋白可以是经内含肽修饰的P77853。经内含肽修饰的蛋白可以是P77853:T134-100-101或P77853:S158-30-108-35。[0095]在表达盒中的第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的一种或多种可以包括与参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列、基本上由或由与参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列组成，所述参考序列选自由SEQIDNO:1[WTP77853]、SEQIDNO:2[AnfaeA],SEQIDNO:3[AnfaeB],SEQIDNO:4[NtEGm],SEQIDNO:5[EU591743]、SEQIDNO:6[043097]、SEQIDNO:7[P77853:T134-100-101],SEQIDNO:8[P77853:SI58-30-108-35]、SEQIDNO:9[033897]、SEQIDNO:10[068438]和SEQIDNO:11[P54583]所组成的组中。所述第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的一种或多种可以包括、基本上由或由与参考序列SEQID:12(BD22308]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一性的氨基酸序列组成。[0096]表达盒中的第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列其中至少有一种还可以包括编码各自的靶向肽的第一靶向多核苷酸序列。对于缺乏第三多核苷酸序列的表达构建体，第一靶向多核苷酸序列可以被包括在第一多核苷酸序列或第二多核苷酸序列的至少一种上。对于缺乏第二多核苷酸序列和第三多核苷酸序列的表达构建体，第一靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列上。每种各自的靶向肽可以独立地来自第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的每一种。靶向肽可以融合到第一蛋白，第二蛋白或第三蛋白上。每种各自的靶向肽可以独立选自但不限于造粉体靶向信号、细胞壁靶向肽、线粒体靶向肽、细胞质定位信号、叶绿体靶向信号、细胞核靶向肽和液泡靶向肽。第一靶向多核苷酸可以位于第一多核苷酸序列，第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列的上游。靶向肽可以与BAASS(SEQIDNO:13)、大麦糊粉序列HVAlePS(SEQIDNO:14),PRla(SEQIDNO:15),Y玉米蛋白序列xGZein27ss_02(SEQIDNO:16)或GluB4SP(SEQIDNO:17)中的一种具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一'丨生。第一祀向多核苷酸序列与第一多核苷酸序列,第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列结合在一起可以编码与参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一性的氨基酸序列，所述参考序列选自由SEQIDNO:18[BAASS:P77853]、SEQIDNO:19[BAASS:033897]、SEQIDNO:20[HVAlePS:NtEGm]和SEQIDNO:21[BAAS:P77853:S158-30-108-35]所组成的组中。[0097]表达盒中的第一多核苷酸序列，第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少有一种还可以包括编码羧基靶向肽的第二靶向多核苷酸序列。对于缺乏第三多核苷酸序列的表达构建体，第二靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列或第二多核苷酸序列上。对于缺乏第二多核苷酸序列和第三多核苷酸序列的表达构建体，第二靶向多核苷酸序列可以包括在第一多核苷酸序列上。羧基靶向肽可以选自但不限于与SEKDEL(SEQIDNO:22)，缩减的KDEL(SEQIDNO:23)或大麦液泡分类决定序列HvVSD-01(SEQIDNO:24)中的一种具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100同一性的序列。羧基靶向肽可以与所述第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的至少一种相融合。[0098]表达盒可以配置为提供第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的至少一种，不含有用于在细胞质中积累的靶向肽。[0099]在表达盒中，与第一多核苷酸序列，第二多核苷酸序列或第三核苷酸序列中的一种结合到一起的第一靶向多核苷酸序列和第二靶向多核苷酸序列可以编码与参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一性的氨基酸序列，所述参考序列选自由SEQIDNO:25[BAASS:AnfaeB:SEKDEL]，SEQIDNO:26[BAASS:AnfaeA:SEKDEL],SEQIDNO:27[PRla:NtEGm:SEKDEL],SEQIDNO:28[BAASS:P77853:T134-100-101:SEKDEL]，SEQIDNO:29[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL],SEQIDNO:30[BAASS:043097:SEKDEL]和SEQIDNO:31[xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-OI]所组成的组中。[0100]实施方式包括编码与靶向肽或羧基靶向肽中的至少一种相融合的第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白，或者它们的变体中的至少一种的表达盒。[0101]在一种实施方式中，在表达盒中，编码与所引用的氨基酸参考序列具有低于100%同一性的蛋白的多核苷酸序列，可以编码具有氨基酸参考序列的蛋白的变体。在一种实施方式中，与所引用的氨基酸参考序列具有低于100%的同一性的蛋白可以是具有氨基酸参考序列的蛋白的变体。在一种实施方式中，编码与所引用核酸参考序列编码的蛋白具有低于100%同一性的蛋白的多核苷酸序列，可以编码所述参考序列编码的蛋白的变体。[0102]在一种表达盒中，所述第一多核苷酸序列，第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少一种能够与在低度、中度或高度严格条件下编码CWD蛋白或经内含肽修饰的CWD蛋白的参考序列杂交。所述第一，第二或第三多核苷酸中的至少一种能够在低度、中度或高度严格条件下与含有参考序列的核酸杂交，所述参考序列选自由SEQIDNO:32[WTP77853]、SEQIDNO:33[AnfaeA]、SEQIDNO:34[AnfaeB]、SEQIDNO:35[NtEGm]、SEQIDNO:36[EU591743]、SEQIDNO:37[043097]、SEQIDNO:38[P77853:T134-100-101]、SEQIDNO:39[P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO:40[033897]、SEQIDNO:41[068438]、SEQIDNO:42[P54583]和SEQIDNO:43[BD22308]的所组成的组中。表达盒可以包括能够在低度、中度或高度严格条件下与含有参考序列的核酸杂交的多核苷酸序列，所述参考序列选自由含有SEQIDNO:52[BAASS:P77853]、SEQIDNO:53[BAASS:033897]、SEQIDNO:54[HVAIePS:NtEGm]、SEQIDNO:55[BAASS:P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO:56[BAASS=AnfaeB:SEKDEL],SEQIDNO:57[BAASS:AnfaeA:SEKDEL]、SEQIDNO:58[PRla:NtEGm:SEKDEL],SEQIDNO:59[BAASS:P77853:T134-100-101:SEKDEL],SEQIDNO:60[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO:61[BAASS:043097:SEKDEL]和SEQIDNO:62[xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01]的序列所组成的组中。[0103]本文的表达盒可以包括调控元件。[0104]在一种实施方式中，提供了包括本文所述的任何分离的核酸，多核苷酸序列或表达盒的载体。本文的实施方式包括其中结合有至少一种本文所述的表达盒的质粒，染色体，线粒体DNA，质体DNA，病毒或核酸片段。一种实施方式提供了用于在植物中表达CWD蛋白的载体。一种实施方式提供了植物转化载体。所述植物转化载体可以是但并不仅限于T-DNA载体，双运载体或共整合载体。转化载体可以包括本文所述的任何分离的核酸，多核苷酸序列或表达盒。[0105]—种实施方式包括含有多核苷酸序列的表达载体，所述多核苷酸能够在低度、中度或高度严格条件下与含有以下序列的核酸杂交，所述序列包括、基本上由或由选自由SEQIDNO:63[pAG2015],SEQIDNO:64[pAG2048],SEQIDNO:65[pAG2049]、SEQIDNO:66[pAG2063],SEQIDNO:67[pAG2069],SEQIDNO:68[pAG2091],SEQIDNO:69[pAG2092],SEQIDNO:70[pAG2096],SEQIDNO:71[pAG2201]、SEQIDNO:72[pAG2229]、SEQIDNO:73[pAG2233]、SEQIDNO:74[pAG2234]、SEQIDNO:75[pAG2242]、SEQIDNO:76[pAG2252]、SEQIDNO:77[pAG2253]、SEQIDNO:78[pAG2309]、SEQIDNO:79[pAG2310]、SEQIDNO:80[pAG2339]、SEQIDNO:81[pAG2342]、SEQIDNO:82[pAG2345]和SEQIDNO:83[pAG2349]所组成的组中的序列组成。[0106]—种实施方式包括含有多核苷酸序列的表达载体，所述多核苷酸序列与选自由SEQIDNO:63[pAG2015]、SEQIDNO:64[pAG2048]、SEQIDNO:65[pAG2049]、SEQIDNO:66[pAG2063]、SEQIDNO:67[pAG2069]、SEQIDNO:68[pAG2091]、SEQIDNO:69[pAG2092],SEQIDNO:70[pAG2096],SEQIDNO:71[pAG2201],SEQIDNO:72[pAG2229]、SEQIDNO:73[pAG2233]、SEQIDNO:74[pAG2234]、SEQIDNO:75[pAG2242],SEQIDNO:76[pAG2252],SEQIDNO:77[pAG2253],SEQIDNO:78[pAG2309]、SEQIDNO:79[pAG2310]、SEQIDNO:80[pAG2339]、SEQIDNO:81[pAG2342]、SEQIDNO:82[pAG2345]和SEQIDNO:83[pAG2349]所组中的组中的序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性。[0107]杂交的方法和严格度条件为本【
技术领域：
】所公知，并且在以下书籍中有所描述:MolecularCloning,T.Maniatis,Ε.F.Fritsch和J.Sambrook,ColdSpringHarborLaboratory,1982,以及CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.G.Siedman,J.A.Smith,K.Struhl,Volumel,Johnffiley&Sons,2000，在此以全文援引的方式纳入本文。[0108]温和的条件可以如下:将装有DNA样品的过滤器在含有6x柠檬酸盐缓冲盐水(SSC；Amresco,Inc.,Solon,0Η)、0.5%十二烷基硫酸纳(SDS；Amresco,Inc.,Solon,OH),5xDenhardt’s溶液(Amresco,Inc.，Solon,OH)以及和变性鲑鱼精子(InvitrogenLifeTechnologies,Inc.Carlsbad，CA)的溶液中68°C预处理2_4小时。杂交是在同样的溶液中并稍加以下改动:0.01MEDTA(Amresco,Inc.，Solon,0H)>100μg/ml鲑鱼精子DNA以及5-20xl06cpm的32P-标记或荧光标记探针。过滤器先在杂交混合物中孵育16-20小时，然后用含有2xSSC和0.1%SDS的溶液洗15分钟。第二次清洗更换含有0.1xSSC和0.5%SDS的洗液，并且在Tm(融化温度。C)以下20°C至29°C下额外培养2小时。Tm=81.5+16.61Log10([Na+]/(1.0+0.7[Na+]))+0.41(%[G+C])-(500/n)-P-F0[Na+]=钠离子的摩尔浓度。％[G+C]=DNA序列中G+C碱基的百分比。N=DNA序列的碱基长度。P=错配碱基对百分比的温度校正(每1%的错配约1°C)。F=甲酰胺浓度的校正海1%甲酰胺=0.63°C)。过滤器暴露在成像仪中或者通过放射自显影法显影。低严格度条件是指低温杂交条件，例如，在37°C和60°C之间，第二次洗涤在低于Tm的40°C至48°C的温度下用高浓度[Na+](高达0.825M)。高严格度是指在高温杂交条件，例如，高于68°C，第二次洗涤在低于Tm的5°C至I(TC的温度下用0.0165至0.0330M的[Na+]。[0109]一种实施方式提供了分离的核酸序列，所述核酸序列在低度、中度和高度严格条件下与含有选自SEQIDNO:32[WTP77853]、SEQIDNO:33[AnfaeA]、SEQIDNO:34[AnfaeB]、SEQIDNO:35[NtEGm]、SEQIDNO:36[EU591743]、SEQIDNO:37[043097]、SEQIDNO:38[P77853:T134-100-101]和SEQIDNO:39[P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO:40[033897]、SEQIDNO:41[068438]、SEQIDNO:42[P54583]和SEQID:43[BD22308]、SEQIDNO:52[BAASS:P77853]、SEQIDNO:53[BAASS:033897]、SEQIDNO:54[HVAlePS:NtEGm]、SEQIDNO:55[BAASS:P77853:S158-30-108-35]、SEQIDNO:56[BAASS=AnfaeB:SEKDEL],SEQIDNO:57[BAASS:AnfaeA:SEKDEL],SEQIDNO:58[PRla:NtEGm:SEKDEL],SEQIDNO:59[BAASS:P77853:T134-100-101:SEKDEL],SEQIDNO:60[HvAleSP:NtEGm:SEKDEL]、SEQIDNO:61[BAASS:043097:SEKDEL]和SEQIDNO:62[xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01],SEQIDNO:63[pAG2015],SEQIDNO:64[pAG2048]、SEQIDNO:65[pAG2049],SEQIDNO:66[pAG2063],SEQIDNO:67[pAG2069]、SEQIDNO:68[pAG2091]、SEQIDNO:69[pAG2092]、SEQIDNO:70[pAG2096]、SEQIDNO:71[pAG2201],SEQIDNO:72[pAG2229]、SEQIDNO:73[pAG2233]、SEQIDNO:74[pAG2234]、SEQIDNO:75[pAG2242]、SEQIDNO:76[pAG2252]、SEQIDNO:77[pAG2253]、SEQIDNO:78[pAG2309]、SEQIDNO:79[pAG2310]、SEQIDNO:80[pAG2339]、SEQIDNO:81[pAG2342]、SEQIDNO:82[pAG2345]和SEQIDNO:83[pAG2349]的序列或它们的互补序列的核酸杂交。[0110]一种实施方式提供了上述任何分离的核酸的片段。所述片段可以是杂交探针或引物。所述探针或引物的长度不限。所述探针或引物可以是6，10，15，20，25，30，35，40，45或50个核苷酸长度，或者是前述任意两长度之间的长度(包括端点)。片段可以有小于全长的长度，和/或包括与引用的参考序列相比的碱基的替换或缺失。所述片段可以是所述引用的参考序列的变体。由片段编码的肽的长度可以小于全长，和/或包括与引用的参考序列编码的氨基酸序列相比的氨基酸的替换或缺失。长度小于全长的肽可以是由所述引用的参考序列编码的氨基酸序列的变体。[0111]表达盒可以由已知方法通过基因重组产生。表达盒可以包括一系列特定的核酸元件，它使得植物细胞或植物组织中特定核酸被转录。所述表达盒可以包括编码蛋白的多核苷酸序列。所述蛋白可以是CWD酶或经内含肽修饰的CWD酶。CWD酶可以从包括木聚糖酶酶，纤维素内切酶，外切葡聚糖酶，木糖苷酶，葡糖苷酶和阿魏酸酯酶的一系列CWD酶中选取。[0112]本文中，表达盒中的多核苷酸序列，分离的核酸，载体，或其他任何DNA构建体，或在本文所述的方法中应用的，都可以可操作地与一种或多种调控元件相连接。调控元件可以是启动子。启动子可以是组成型启动子，它在植物大部分细胞，组织和器官的整个发育过程以及许多但并非所有的发育阶段的发育过程中提供多核苷酸序列的转录。启动子可以是诱导型启动子，仅当其暴露在特定的化学物质或环境刺激时，才能启动所述多核苷酸序列的转录。启动子对于特定的发育阶段、器官或组织可以是特定的。组织特异性启动子能够启动在特定的植物组织中的转录。由组织特异性启动子靶向的植物组织可以是但不限于茎，叶，毛状体，花药或种子。本文中，组成型启动子可以是大米泛素3启动子(0sUbi3P)或大米肌动蛋白I启动子。也可以使用其他已知的组成型启动子，包括但不限于花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子，夜香树黄色叶卷曲病毒启动子(CMP)或截短型CMP(CMPS)，二磷酸核酮糖羧化酶小亚基启动子和玉米泛素启动子。组织特异性启动子可以包括种子特异性启动子。种子特异性启动子可以是但不限于大米GluB4启动子或玉米蛋白启动子。提供的另一种调控元件可以是终止转录的终止序列。终止序列可以被包括在表达盒的转录单元的3'端。终止子可以来自不同的植物基因。终止子可以是一种来自根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens.)的胭脂氨酸合成酶或章鱼碱合成酶基因的终止序列。[0113]本文中，整合有表达盒的载体也可以包括另外的基因元件，如多个克隆位点来促进分子克隆和筛选标记以方便选择。包括在载体中的可筛选标记可以是来自大肠杆菌(Escherichiacoli)的磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因，该基因赋予转化细胞利用甘露糖增殖的能力。包括在载体中的可筛选标记可以包括但不限于能赋予卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(npt)基因，能赋予潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因和能赋予草甘膦抗性的3-磷酸烯醇式丙酮酰莽草酸(enolpyruvylshikimate-3-phosphate)合成酶基因。[0114]在一种实施方式中，可以构建包括编码多种CWD酶的多核苷酸序列的载体。本文所述的载体还可以包括多核苷酸序列，其目的在于沉默植物中的一种或多种基因。[0115]表达载体可以导入到合适的宿主细胞，组织，器官和/或生物体中。合适的宿主细胞可以是双子叶(dicots)或单子叶(monocots)的植物。[0116]本文的其他实施方式可以通过补充实施方式来构成，补充的实施方式有一种或多种来源于本文中一种或多种其他实施方式的兀件，和/或使用来自本文中一种或多种其他实施方式的一种或多种元件替换来自一种实施方式的一种或多种元件。本文进一步的实施方式可以通过参考权利要求1后的任何一条从属权利要求和阅读从任何一条或多条前述的权利要求中选出的权利要求来描述。[0117]实施例[0118]下面提供非限制性的实施例来说明具体的实施方式。全部实施方式都可以由来自下面的一种或多种实施例来补充一处或多处细节，和/或一种或多种来自一种实施方式的元件可被来自下面的一种或多种实施例中的一处或多处细节替换。[0119]实施例1-材料和方法[0120]载体[0121]本文中设计的载体是根据从日本烟草购买的过渡质粒(intermediateplasmid)pSBll进行的，并且已在2010.11.5提交的申请N0.PCT/US10/55746、2010.11.5提交的申请N0.PCT/US10/55669和2010.11.5提交的申请N0.PCT/US10/55751的国际申请中做出了描述，这些文献以全文援引的方式纳入本文。简单地说，所述用于克隆的质粒PSBll与pSBl受体载体结合，所述PSBl受体载体是在利用pSBll和pSBl都存在的cos和ori位点通过同源重组的卸甲Ti质粒(disarmedTiplasmid)。整合载体包括诸如virB,virC和virG的毒性基因，这些毒性基因用于T-DNA转移并且可以用于植物转化。基础转化载体含有表达盒，所述表达盒含有在0sUbi3P启动子后续取代了CMPS启动子的控制下编码PMI的人A基因。该基础载体用来获取以下列出的载体，这些载体用于植物转化和细胞壁降解酶在植物中的表达:[0122]1.pAG2015(SEQIDNO:63):0sUbi3P:P77853；[0123]2.pAG2048(SEQIDNO:64):OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm，在水稻Ubi3启动子之间与液泡融合；[0124]3.pAG2049(SEQIDNO:65):0sUbi3P:HvAleSP:NtEGm:SEKDEL；[0125]4.pAG2063(SEQIDNO:66):0sUbi3P:BAASS:043097:SEKDEL；[0126]5.pAG2069(SEQIDNO:67):0sUbi3P:068438；[0127]6.pAG209I(SEQIDN0:68):0sUbi3P:BAASS:AnfaeA:SEKDEL+0sUbi3P:BAASS:P77853；[0128]7.pAG2092(SEQIDN0:69):0sUbi3P:BAASS:AnfaeB:SEKDEL+0sUbi3P:BAASS:P77853；[0129]8.pAG2096(SEQIDNO:70):OsUbi3P:BAASS:AnfaeA:SEKDEL+0sUbi3P:BAASS:AnfaeB:SEKDEL+0sUbi3P:BAASS:P77853；[0130]9.pAG2201(SEQIDNO:71):0sUbi3P:ZmUBQm:P77853；[0131]10.pAG2229(SEQIDNO:72):0sUbi3P:BAASS:P77853:T134-100-101:SEKDEL(经内含肽修饰的木聚糖酶);[0132]11.pAG2233(SEQIDNO:73)0sUbi3P:P77853:S158-30-108_35;[0133]12.pAG2234(SEQIDNO:74)0sUbi3P:BAASS:P77853:S158-30-108-35;[0134]13.pAG2242(SEQIDNO:75):0sUbi3P:PRlaSP=NtEGm:SEKDEL+0sUbi3P:ZmUBQm:P77853；[0135]14.pAG2252(SEQIDNO:76):0sUbi3P:033897(内切葡聚糖酶);[0136]15.pAG2253(SEQIDNO:77):0sUbi3P:BAASS:033897；[0137]16.pAG2309(SEQIDNO:78):0sUbi3P:HvAleSP:NtEGm+0sUbi3P:P77853；[0138]17.pAG2310(SEQIDNO:79):0sUbi3P:EU591743(木聚糖酶);[0139]18.pAG2339(SEQIDNO:80):0sUbi3P:068438+0sUbi3P:BAASS:033897+0sUbi3P:EU591743；[0140]19.pAG2342(SEQIDNO:81):0sUbi3P:HvAleSP:NtEGm:SEKDEL+0sUbi3P:P77853;[0141]20.pAG2345(SEQIDNO:82):OsUbi3P:068438+0sUbi3P:HvAleSP:NtEGm:SEKDEL+OsUbi3P:BAASS:043097:SEKDEL；[0142]21.pAG2349(SEQIDNO:83)=ZmUbilP:ZmKozak:xGZein27ss-02:BD22308:HvVSD-01+OsUbi3P:HvAleSP:NtEGm:SEKDEL+0sUbi3P:BAASS:043097:SEKDEL；[0143]22.pAG2042(SEQIDNO:84):P54583(内切葡聚糖酶EGB)[0144]转基因玉米植物的生产[0145]玉米和柳枝稷转化的方法在2010.11.5提交的申请的N0.PCT/US10/55746，2010.11.5提交的申请N0.PCT/US10/55669，2010.11.5提交的申请N0.PCT/US10/55751的国际申请以及Gray等2011PlantBiotechJ9:1100中有所描述，在此以全文援引的方式纳入本文。简单地说，将含有合适转化质粒的农杆菌细胞LBA4404接种到野生型AxB玉米胚性愈伤组织中。未成熟的玉米胚的农杆菌介导的转化按照前面描述的方法进行(NegrottoD等.2000PlantCellRepl9:798；IshidaYetal.1996NatBiotechl4:745)。酶基因的表达盒被克隆到PAG2004(SEQIDNO:85)载体的Kpnl-EcoRI位点，以便生成过渡载体，使用之前报道的方法(IshidaY等.1996NatBiotechl4:745；HieiYetal.1994PlantJ6:271；HieiY和KomariT2006PlantCellTissueOrganCult.85:27；KomariTetal.1996PlantJlO:165)，所述中间载体能够与农杆菌菌株LBA4404三亲杂交的pSBl载体重组。玉米(玉米品种HiII，A188或B73)母株生长在28°C、16小时光照的温室中。未成熟合子胚从玉米粒中分离出来，并用含有目的基因的农杆菌溶液接种。接种后的未成熟胚在10-12周的组织培养过程中生长。对发育成具有叶和根的幼苗取样进行PCR分析来鉴定含有目的基因的转基因植物。用水清洗PCR阳性并且生根的植物，以洗掉琼脂培养基，移植到土壤中并在温室中生长，以广生种子和稻杆。[0146]本文中，特定的转基因植物是指由酶所标示(如:“P77853”、“P40942”、“030700”、“NtEGm”等)或转基因对照(如:“TGC”等)，然后从以亿计的质粒中指定用于构建转基因植物的质粒(如:“2014”、“2015”、“2229”、“2092”等)。在上下文中，除i)酶或对照和ii)质粒名称外，偶尔插入的附加字符是清楚的。提及的质粒以pAGXXXX命名。例如，在转基因植物名称中“2229”、“2252”、“2253”、“2092”、“2096”或“2042”的名字的意思是所述转基因植物分别由“？八62229”、、八62252”、、八62253”、、八62092”、、八62096”或、八62042”制备。可以参考纳入的用质粒名称标记的序列来确定用于制备特定的转基因植物的序列。[0147]对于转基因柳枝稷植株的制备，柳枝稷(Panicumvirgatum、cv.)的种子用于胚性愈伤组织的启动，随后使用含有PSBl质粒的农杆菌LBA4404用于转化。目的基因的存在使用基因特异性引物通过PCR来验证。[0148]以下表达一种或多种CWD酶的转基因植物及对照植物用来于联合预处理和水解。[0149]1.野生型玉米植株用作阴性对照(AxB;BxA);[0150]2.使用空载体转化的玉米植株，用作阴性对照(TGC.4000.12；TGC.4000.11；TGC.2004.8.02；TGC.2004.8.04；TGC.2243.01)；[0151]3.通过使用pAG2015转化制备的转基因玉米植株XynA.2015.05，表达木聚糖酶XynA(P77853)；[0152]4.通过使用pAG2015转化制备的第二代转基因玉米植株XynA.2015.5T1，表达木聚糖酶A(P77853)；[0153]5.通过使用pAG2063转化制备的转基因玉米植株XynB.2063.17，表达木聚糖酶XynB(043097)；[0154]6.通过使用pAG2049转化制备的转基因玉米植株EGA.2049.02和EGA.2049.10，表达内切葡聚糖酶EGA(NtEG)；[0155]7.通过使用pAG2042转化制备的转基因玉米植株EGB.2042.03，表达内切葡聚糖酶EGB(P54583)；[0156]8.通过使用pAG2253转化制备的转基因玉米植株EGC.2253.4b，表达内切葡聚糖酶EGC(033897)；[0157]9.通过使用pAG2242转化制备的转基因玉米植株EGA/XynA.2242.09，表达内切葡聚糖酶EGA(NtEG)和木聚糖酶XynA(P77853)；[0158]10.上面植株9的第二代转基因玉米植株，命名为EGA/XynA.2242.09.16T1，表达内切葡聚糖酶EGA(NtEG)和木聚糖酶XynA(P77853)；[0159]11.通过使用pAG2092转化制备的转基因玉米植株XynA/AccB.2092.103，表达木聚糖酶XynA(P77853)HE来自黑曲霉(Aspergillusniger)的阿魏酸酯酶B;[0160]12.通过使用pAG2096转化制备的转基因玉米植株XynA/AccA/B.2096.01和XynA/AccA/B.2096.05,表达木聚糖酶XynA(P77853),来自黑曲霉(Aspergillusniger)的阿魏酸酯酶A和来自黑曲霉(Aspergillusniger)的阿魏酸酯酶B；[0161]13.通过使用pAG2069转化制备的转基因玉米植株CBHA.2069.3.17，表达外切葡聚糖酶CBH(068438)；[0162]14.通过使用pAG2015转化制备的转基因柳枝稷植株XynA.pv2015.3c和XynA.pv2015.4c，表达木聚糖酶XynA(P77853)；[0163]15.通过使用pAG2229转化制备的转基因玉米植株iXynA.2229.110是，表达经内含肽修饰的XynA(P77853)；[0164]16.通过使用pAG2309转化制备的转基因玉米植株XynA/EGA.2309.54和XynA/EGA.2309.107，表达XynA(P77853),内切葡聚糖酶EGA(NtEGm)；[0165]17.通过使用pAG2342转化制备的转基因玉米植株XynA/EGA.2342.105，表达XynA(P77853)和EGA(NtEGm)；[0166]18.通过使用pAG2339转化制备的转基因玉米植株XynE/EGC/CBHA.2339.03，XynE/EGC/CBHA.2339.04和XynE/EGC/CBHA.2339.05，表达XynE(EU591743)、内切葡聚糖酶EGC(033897)和CBHA(068438)；[0167]19.通过使用pAG2345转化制备的转基因玉米植株XynB/EGA/CBHA.2345.116，表达XynB(043097)、内切葡聚糖酶EGA(NtEGm)和CBHA(068438)；[0168]20.通过使用pAG2349转化制备的转基因玉米植株XynB/EGA/CBHB.2349.55和XynB/EGA/CBHB.2349.56，表达XyanB(043097)、内切葡聚糖酶EGA(NtEG)XBHB(BD22308)和ZmUbiIP:ZmKozak:xGZein27ss_02:BD22308:HvVSD-01:NosT。[0169]植物秸杆[0170]收获的温室玉米秸杆在37°C条件下在空气循环器中干燥1-2周。干燥后，手动把秸杆切成1.0-1.5英寸的碎片，然后使用0.5mm筛的UDY粉碎机(Model014，UDY公司，FortCollins,CO)磨碎。[0171]植物蛋白提取物的制备[0172]将压碎的谷粒或20mg磨碎的秸杆分别重悬在蛋白提取缓冲液中，所述蛋白提取缓冲液包括IOOmM磷酸钠(pH值6.5)，乙二胺四乙酸(EDTA;ImM)，聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)(0.1%，v/v)和苯甲基磺酰氟(PMSF;0.1mM)。将重悬的组织样本充分混合，不溶性物质通过离心沉淀。将含可溶性蛋白的上清液转移至新管中。[0173]化学物质和酶[0174]糖标准品(葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和纤维二糖)是从AciosOrganics(MorrisPlains,NJ)购买的。本研究所用的其他化学物质均从Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)购买。用于自制复合酶(inhousecocktail)的内切葡聚糖酶(C8546),β-糖苷酶(49291)和木聚糖内切酶(X2753)都购自Sigma(St.Louis、M0)。所述外切纤维素酶(CBHI)(EC3.2.1.91)和β-木糖酶(EC32I37)均从Megazyme(威克洛，爱尔兰)购买。AccelleraseK1500和AccellemseKXY均由杰能科国际(GenencorInternational)(Rochester,NY)惠赠。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae),菌株D5A是从美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC)(Manassas,VA)获得的。[0175]秸杆酶测试[0176]从15mg于室温下在500μI提取缓冲液(IOOmM磷酸钠缓冲液，pH6.5；NaOAc,pH,4.5或Tris,ρΗ8.0；EDTA(IOmM)和TritonX-100(0.1%)中孵育30min的秸杆中提取蛋白。通过离心分离秸杆。收集上层清液并转移至新的微量离心管。在缓冲液中重浮50μI蛋白提取物用来进行酶分析。通常，将含有Xylazyme的IOOmM的磷酸钠溶液，pH6.5或含有Cellazyme的IOOmMNaOAc溶液，pH4.5,xylazymeAX或纤维素酶检测底物药片(cellazymetablets)的缓冲液适量加入到用于酶测试的每管中。在测试温度下(通常约50-60°C，这取决于被测试酶)孵育进行反应，直至上清液有可见蓝颜色出现。通过测定反应产物在590纳米下的吸光度来量化蓝色染料的量。这些反应的对照包括微生物提高的酶和野生型植物提取物。水解底物也可以通过使用AZCL缀合底物(Megazyme)替代xylazymeAX和纤维素酶检测底物药片的情况而定。使用AZCL缀合底物使得被测秸杆的体积和底物浓度最优化。[0177]木聚糖酶活性的检测[0178]50°C下在0.5ml反应体系中使用XylazymeAX(Megazyme,Bray,C0.Wicklow,Ireland)作为底物进行可溶性蛋白的测定，对于BSX使用HEPES缓冲液(100mM、ρΗ8.0)，对于XynB使用磷酸钠(100mM、pH6.5)缓冲液。将Iml2%(w/v)的Tris碱加入到反应体系中以终止XylazymeAX反应。通过离心来沉淀来自XylazymeAX反应的不溶性材料，使用分光光度计在590nm下测定100μL反应产物的吸光度值，一式三份。对于BSX或XynB积累水平的量化，通过孵育已知量的纯化的、使用含有XylazymeAX药片的分析缓冲液稀释的微生物提高的BSX或XynB，以构建标准曲线；与此同时，使用转基因植物材料进行XylazymeAX分析。[0179]下面表1说明了在转基因植物中检测的酶活性。如文中所述。检测了几种木聚糖酶，内切葡聚糖酶，外切纤维酶和阿魏酸酯酶的酶活性。对于每一个转基因事件，被测的酶活性同样通过蛋白质印迹(Westernblot)分析加以验证。“N/A”指的是没有进行的分析。[0180]表1[0181]【权利要求】1.一种从基因工程植物材料中生产可溶性糖的方法，该方法包括:通过将基因工程植物材料与制浆制剂混合形成混合物以进行预处理，其中，所述基因工程植物材料包括编码第一蛋白的第一多核苷酸序列，所述第一蛋白选自由木聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、阿魏酸酯酶、经内含肽修饰的木聚糖酶、经内含肽修饰的内切葡聚糖酶、经内含肽修饰的外切葡聚糖酶和经内含肽修饰的阿魏酸酯酶所组成的组中；以及提供水解条件。2.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括在所述混合物中加入其它植物材料。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一蛋白包括与参考序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，所述参考序列选自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDN0:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10和SEQIDNO:11所组成的组中。4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一蛋白包括与参考序列SEQID:12具有至少90%同一性的氨基酸序列。5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述基因工程植物材料还包括编码第二蛋白的第二多核苷酸序列，所述第二蛋白选自由木聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、阿魏酸酯酶、经内含肽修饰的木聚糖酶、经内含肽修饰的内切葡聚糖酶、经内含肽修饰的外切葡聚糖酶和经内含肽修饰的阿魏酸酯酶所组成的组中；其中，被选定为第二蛋白的蛋白不同于被选定为第一蛋白的蛋白。6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第二蛋白包括与第二参考序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，所述第二参考序列选自由SEQIDNO:USEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10和SEQIDNO:11所组成的组中。7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第二蛋白包括与参考序列SEQID:12具有至少90%同一性的氨基酸序列。8.根据权利要求5所述的方法，其中，所述基因工程植物材料还包括编码第三蛋白的第三多核苷酸序列，所述第三蛋白选自由木聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、阿魏酸酯酶、经内含肽修饰的木聚糖酶、经内含肽修饰的内切葡聚糖酶、经内含肽修饰的外切葡聚糖酶和经内含肽修饰的阿魏酸酯酶所组成的组中；其中，被选定为第三蛋白的蛋白不同于被选定为第一蛋白的蛋白，并且不同于被选定为第二蛋白的蛋白。9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述第三蛋白包括与第三参考序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，所述第三参考序列选自由SEQIDNO:USEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10和SEQIDNO:11所组成的组中。10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述第三蛋白包括与参考序列SEQID:12具有至少90%同一性的氨基酸序列。11.根据权利要求1、5或8中任意一项所述的方法，其中，所述第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少一种还包括第一祀向多核苷酸序列，所述第一靶向多核苷酸序列编码与第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的每一种相应的靶向肽，所述靶向肽独立地选自由造粉体靶向信号、细胞壁靶向肽、线粒体靶向肽、细胞质定位信号、叶绿体靶向信号、细胞核靶向肽和液泡靶向肽所组成的组中，其中，所述相应的靶向肽与第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白相融合。12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述第一靶向多核苷酸序列分别位于第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列的上游，并且所述靶向肽独立地选自由SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16和SEQIDNO:17所组成的组中。13.根据权利要求11所述的方法，其中，与第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的至少一种相结合的所述第一祀向多核苷酸序列编码与参考序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，所述参考序列选自由SEQIDNO:18,SEQIDNO:19,SEQIDNO:20和SEQIDNO:21所组成的组中。14.根据权利要求11所述的方法，其中，所述植物还包括编码羧基靶向肽的第二靶向多核苷酸序列，所述羧基靶向肽选自由SEQIDNO:22,SEQIDNO:23和SEQIDNO:24[HvVSD-01]所组成的组中，其中，所述羧基靶向肽与第一蛋白、第二蛋白或第三蛋白中的至少一种相融合。15.根据权利要求11所述的方法，其中，所述植物还包括编码羧基靶向肽的第二靶向多核苷酸序列，其中，与第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列中的一种相结合的所述第一靶向多核苷酸序列和所述第二靶向多核苷酸序列编码与参考序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，所述参考序列选自由SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27,SEQIDNO:28、SEQIDNO:29,SEQIDNO:30和SEQIDNO:31所组成的组中。16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述制浆制剂包括至少一种组分，所述组分具有选自由亚硫酸根、亚硫酸氢根、硫酸根、碳酸根、氢氧根和氧负离子所组成的组中的离子。17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述至少一种组分还包括选自由铵离子、氢离子、钠离子、镁离子和钙离子所组成的组中的反荷离子。18.根据权利要求1所述的方法，其中，所述制浆制剂包括亚硫酸氢铵和碳酸铵中的至少一种。19.根据权利要求18所述的方法，其中，亚硫酸氢铵的浓度为0.02M至0.35M，碳酸铵的浓度为0.025M至0.25M。20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述混合物的液固比选自小于或等于10、9、8、7、6、5、4、3、2或I的值。21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述预处理包括将混合物孵育处理，所述孵育处理的时间小于或等于16小时、15小时、14小时、13小时、12小时、11小时、10小时、9小时、8小时、7小时、6小时、5小时、4小时、3小时、2小时或I小时。22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述预处理包括提供40°C至95°C的混合物温度。23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述预处理包括提供5.0至10.0的混合物pH值。24.根据权利要求23所述的方法，其中，该方法还包括通过机械研磨对混合物进行精炼。25.根据权利要求1所述的方法，其中，所述水解条件包括2%至25%的固含量。26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述水解条件包括孵育混合物长达144小时。27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述水解条件包括100°C或更低的混合物温度。28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述混合物温度为65°C或更低。29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述混合物温度为48°C至50°C。30.根据权利要求27所述的方法，其中，所述水解条件包括4.8至5.0的混合物pH值。31.根据权利要求30所述的方法，其中，该方法还包括将混合物与发酵生物相接触以生产生化产品。32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述发酵生物为酵母，所述酵母选自由酵母属(Saccharomyces),克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces),毕赤酵母属(Pichia),耶氏酵母属(Yarrowia),刀孢酵母属(Spathaspora)和发酵酵母属(Scheffersomyces)所组成的组中。33.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括加入一种或多种外源酶。34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述一种或多种外源酶包括内切葡聚糖酶、外切纤维素酶、糖苷酶和木聚糖酶。35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述一种或多种外源酶还包括β-木糖苷酶。36.根据权利要求33所述的方法，其中，所述一种或多种外源酶包括从里氏木霉(Trichodermareesii)中分离的纤维素酶。37.一种基因工程植物，该基因工程植物包括编码与第一参考序列具有至少90%同一性的氨基酸序列的第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列选自由SEQIDNO=USEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、SEQIDN0:6、SEQIDN0:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9,SEQIDNO:10和SEQIDNO:11所组成的组中。38.根据权利要求37所述的基因工程植物，其中，该植物还包括编码与第二参考序列具有至少90%同一性的氨基酸序列的第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸序列选自由SEQIDNO:USEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、SEQIDN0:6、SEQIDNO:7,SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQID:12所组成的组中，其中，被选定为第二参考序列的SEQIDNO不同于被选定为第一参考序列的SEQIDNO。39.根据权利要求38所述的基因工程植物，该植物还包括编码与第三参考序列具有至少90%同一性的氨基酸序列的第三多核苷酸序列，所述第三多核苷酸序列选自由SEQIDNO:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、SEQIDN0:6、SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9、SEQIDNO:10,SEQIDNO:11和SEQID:12所组成的组中，其中，被选定为第三参考序列的SEQIDNO不同于被选定为第一参考序列的SEQIDNO，也不同于被选定为第二参考序列的SEQIDNO。40.根据权利要求37、38或39中任意一项所述的基因工程植物，其中，所述第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列还包括编码靶向肽的靶向多核苷酸序列，所述靶向肽选自由造粉体靶向信号、细胞壁靶向肽、线粒体靶向肽、细胞质定位信号、叶绿体靶向信号、细胞核靶向肽以及液泡靶向肽所组成的组中。41.根据权利要求40所述的基因工程植物，其中，所述靶向肽选自由SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:22,SEQIDNO:23和SEQIDNO:24[HvVSD-OI]所组成的组中。42.根据权利要求37、38或39中任意一项所述的基因工程植物，其中，所述基因工程植物选自由玉米、甘蔗、甜菜、高粱、柳枝稷、芒草、桉树、柳树和杨树所组成的组中。43.一种基因工程植物，该植物包括至少一种编码氨基酸序列的多核苷酸序列，所述氨基酸序列与选自由SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:25,SEQIDNO:26,SEQIDNO:27,SEQIDNO:28,SEQIDNO:29,SEQIDNO:30和SEQIDNO:31所组成的组中的序列具有至少90%的同一性。44.一种表达盒，该表达盒包括:第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列能够在中度严格条件下与含有第一参考序列的核酸杂交，所述第一参考序列选自由SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:36,SEQIDNO:37,SEQIDNO:38和SEQIDNO:39所组成的组中；第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸序列能够在中度严格条件下与含有第二参考序列的核酸杂交，所述第二参考序列选自由SEQIDNO:32,SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39,SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42和SEQID:43所组成的组中，其中，被选定为第一参考序列的SEQIDNO不同于被选定为第二参考序列的SEQIDNO。45.根据权利要求44所述的表达盒，其中，该表达盒还包括第三多核苷酸序列，所述第三多核苷酸序列能够在中度严格条件下与第三参考序列杂交，所述第三参考序列选自由SEQIDNO:32,SEQIDNO:33,SEQIDNO:34,SEQIDNO:35,SEQIDNO:36,SEQIDNO:37、SEQIDNO:38,SEQIDNO:39,SEQIDNO:40,SEQIDNO:4USEQIDNO:42[P54583]和SEQID:43所组成的组中，其中，被选定为第三参考序列的SEQIDNO不同于被选定为第一参考序列的SEQIDNO，并且不同于被选定为第二参考序列的SEQIDNO。46.根据权利要求44或45中任意一项所述的表达盒,其中，所述第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列或第三多核苷酸序列还包括编码靶向肽的靶向多核苷酸序列，所述靶向肽选自由造粉体靶向信号、细胞壁靶向肽、线粒体靶向肽、细胞质定位信号、叶绿体靶向信号、细胞核靶向肽和液泡靶向肽所组成的组中。47.根据权利要求46所述的表达盒，其中，所述靶向多核苷酸序列选自由SEQIDNO:44、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50和SEQIDNO:51所组成的组中。48.一种表达盒，该表达盒包括多核苷酸序列，所述多核苷酸序列能够在中度严格条件下与含有参考序列的核酸杂交，所述参考序列选自由含有SEQIDNO:52,SEQIDNO:53、SEQIDNO:54,SEQIDNO:55,SEQIDNO:56,SEQIDNO:57,SEQIDNO:58,SEQIDNO:59、SEQIDNO:60、SEQIDNO:61和SEQIDNO:62的序列所组成的组中。49.一种表达载体,该表达载体包括多核苷酸序列，所述多核苷酸序列能够在中度严格条件下与含有选自由SEQIDNO:68,SEQIDNO:69、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:72、SEQIDNO:73、SEQIDNO:74、SEQIDNO:75、SEQIDNO:76、SEQIDNO:77、SEQIDNO:78,SEQIDNO:79,SEQIDNO:80,SEQIDNO:8USEQIDNO:82和SEQIDNO:83所组成的组中的序列的核酸杂交。【文档编号】C10L5/44GK103547659SQ201280021388【公开日】2014年1月29日申请日期:2012年3月7日优先权日:2011年3月7日【发明者】R·M·莱布,张东成,O·布格瑞申请人:谷万达公司